156 __Revista Argentina de Microbiologia - 27: 156-174, 1995 - ISSN 0235-7541 Coriza infeccios: ACTUALIZACION: revision de métodos de diagnéstico y vacunas P. J. BLACKALL', H. R. TERZOLO® ' Animal Research Institute (ARD, Queensland, Australia y * Departamento de Produc- cin Animal, INTA EBA Balcarce, Balearce, Argentina INTRODUCCION La coriza infecciosa es una enfermedad respiratoria aguda de las gallinas domésti- cas causada por la bacteria Haemophilus paragallinarum. Exeepcionalmente pueden enfermarse también los faisanes y gallinas de Guinea. El H. paregallinarum infecta al ave por via respiratoria y Inego de un cor- to pexfodo de incubacién, que varia entre 1 8 dias, produce una enfermedad que se manifiesta por inflamacién catarral de los senos paranasales, Este cuadro puede estar asociado a inflamacion de los barbillones, conjuntivitis o queratitis. Los casos de neu- monia y aerosaculitis son menos frecuentes pero también suelen ocurrir en las infeccio- nes puras por estos heméfilos. En las gallinas on produccién causa alta morbilidad, baja o nula mortalidad y una importante pérdida en la produccién de huevos, la que generalmente oscila entre 10% y 40%. En pollos parrilleras puede cau- sar un cuadro deserito como «cabeza hin- chada» y ocasionalmente también producir septicemia y muerte (48), Esta bacteria go- neralmente se asocia con otros agentes bacterianos, viricos o parasitatios y cuan- do esto ocurre se agrava el curso de la en- fermedad. Entre los agentes bactcrianos més comunes deben moneionarse los mycoplasmas y las pasteurelas. Cuando H. paragallinarum se asocia con otros agentes esta enfermedad se denomina woriza infec- ciosa complicada» (48) En esta recopilacién se aportardn deta- les sobre la clasificacién, identificacién y serolipificacién del agente causal. También se resumird la informacién disponible sobre nuevas métodos de diagnéstico y programas de vacunacién para prevenir esta enferme- dad. Alo largo de esta revisién se hard re- ferencia a los heméfilos aviarios que, para el propésito de este trabajo, serait definides como organismos gram negativos aislados de aves y que necesariamente requieren factores de crecimiento in vitro, Los dos factores que pueden ser requeridos por los DIRECCION POSTAL: Ds. Horacio Ratil Terzolo, Departamento de Produccién Animal, INTA BEA Balcaree, Casilla de Correos 276, 7620 Balcarce. coriza infecciosa, produceién avicola, diagné: PALABRAS CLAVE: Recibido: 30/5/95, Ravisado: 4/7/95, co, vacunas aviares,Coriza infecciosa 187 heméfilos para su crecimiento in vitro son hemina (factor X) ylo nicotfn-adenin- dinucledtido (NAD o factor V). CLASIFICACION En 1981 se logré registrar el primer ais- lamiento en las aves de un microorganismo con requerimientos de factores de creci- miento que se encuentran en la sangre. Desde entonces y hasta comienzos de la década del 60, el nico microorganismo hemofilico de origen aviario formalmente reconocido era una especie denominada Haemophilus gallinarum. Bl H. gallinarum fue considerado como el agente causal de la coriza infecciosa y se demostré que reque- ria los dos factores de crecimiento, X y V (52), Sin embargo a partir de la década del 60, los nicos heméfilos que habian sido reeuperados de aves sélo requerian del fac- tor V. Recientemente, se ha alegado que las, primitivas descripciones de los heméfilos aviarios como dependientes de los factores Xy V fueron incorrectas. Ello fue debido a que los medios de cultivo disponibles para las pruebas desde la década de los afios 0 hasta Ia de los 60 tenfan serias deficiencias (15). Por ello actualmente ee euestiona la existencia de H. gallinarum. Actualmente esta ampliamente aceptado que, por lo menos, existen dos especies de hemeéfilos aviarios. Con algunas excepeiones detalladas més adelante, ambas especies sélo requieren el factor V. Una especie se conoce como H. paragallinarum y se consi- dera el agente etiolégico de la coriza infec- ciosa. La otra es conoeida como H. avium y se estima que es apatégena (26), El uso reciente de la tecnologia de hibridizacion del acido desoxirribonucleico (DNA) ha demostrado que ol grupo H. ‘avium esta compuesto como minimo por tres grupos semojantes (41). Los tres gru- pos han sido denominados: Pasteurella avium, P. volantium y un tercer grapo co- nocido como «Pasteurella especie A». Sin embargo, no todos los aislamientos de H. avium pueden ser asignados a alguno de estos tres nuevos grupos taxonémicos exclu- sivamente por sus propiedades fenotipicas. Por ejemplo solamente 25 de las 39 ccpas de H. avium que habian sido examinadas en un estudio (2), pudieron ser identifica- das como P avium, P volantium o el ter- cer grupo conocido como Pasteurella vespe- cie A», Todavia se desconoce si las restan- tes 14 cepas que no se pudieron clasificar representan nuevas especies o, si en reali- dad, son variantes previamente no identi- fieadas de las tres nuevas especies de Pasteurella. Evidentemente, la clasificacién de los heméfilos aviarios todavia no puede ser con- siderada como un tema concluido. Dado que la propuesta para efectuar una reorganiza- cién taxonémica de los heméfilos aviarios no patogenos es muy reciente, en esta revision se usard el nombre H. avium para desig- nar a todos estos organismos, excepto don- de los nombres P. avium, P volantium y Pasteurella especie A» sean, con seguridad, més apropiados. AISLAMIENTO Para obtener cepas de los senos paranasales de las aves enfermas es reco- mendable el uso de medios de cultivo selec- tivos, para evitar de este modo el sobrecrecimiento de H. paregallinarum por otras bacterias que normalmente habitan los senos y Ia cavidad nasal. En el INTA de Balcarce ha dado buen resultado el empleo168 _ Revista Argentina de Microbiologia 21 (8) - Julio / Setiombre de 1995 del medio Columbia agar base con el agre- gado de 5 a 7% de sangre equina lisada, dacitracina (5 U/ml), cloxacilina (5 g/ml) y vancomicina (20 pg/ml) (54), La sangre equina hemolizada se prepara mantenién- dola en bafio maria a 56°C durante 40 min con agitacién a intervalos de 4 min. La san- gre hemolizada se conserva congelada a -20°C (64), Es conveniente sembrar por du- plicado en el citado medio con y sin el agre- gado de los antibisticos, ‘para asegurar el aislamiento de cepas de H. paragallinarum que pudieran ser sensibles a los antibiéti- cos. En trabajos realizados en INTA sélo una de 80 cepas examinadas crecié leve- mente inhibida por este medio selectivo. Si bien estas bacterias desarrollan aerébicamente en caldo, es conveniente la ineubacién con 5 a 10% de CO, cuando se cultivan en medios s6lidos. En el INTA de Balearce se ha usado con buenos resultados para primo-aislamiento una atmésfera microaerofilica rica en hidrégeno, prepara- da en jarras anaerdbicas con mandmetro incorporado como sigue: las jarras se evactian con una bomba de vacio hasta 0,7 atmésferas (Atm.), se adiciona H, hasta 0,2 ‘Atm. y se agrega CO, hasta 0,1 Atm. dejan- do un vaefo residual para asegurar el sella~ do completo (54). El empleo de la citada atmésfera disminuye el crecimiento del gru- po H. avium y otras pasteurelas V depen- dientes que son mas aerébicas y que po- drian confundirse con el agente de 1a cori za infecciosa. TDENTIFICACION Requerimientos nutricionales ‘Todos los heméfilos aviarios, con algunas exeepciones detalladas més adelante, re- quieren del factor V pero no del X. No es facil establecer los exactos requerimientos de factores de crecimiento que tienen estos heméfilos. El uso de discos comerciales con factores de crecimiento para medios de cul- tivo tales como el agar de infusién cerebro- corazén o el agar para pruebas de suscep- tibilidad pueden producir un porcentaje alto de cultivos que falsamente parecen ser de- pendientes de ambos factores, X y V (9). ‘Tanto la marea comercial del disco como la del medio a emplear deberian ser cuidado- samente controladas para seleccionar el ar- ticulo més adecuado. Para laboratorios bien ‘equipados la prueba de porfirina (32) se re- comienda para determinar la dependencia del factor X. Tales laboratorios bien equi- pados podrfan también considerar el uso de hemina purificada y de NAD para suple- mentar medios de cultivo enriquecidos. Recientemente se ha reconocide que al- gunas cepas de H. paragailinarum aisladas de aves en Sudafrica aparentemente son independientes del requerimiento del NAD (19, 27, 40). Se ha demostrado que estas cepas son idénticas aH. paragallinarwm en todas sus propiedades excepto por su capa- cidad de crecer en un medio de cultive com- plejo sin la adicién de factor V (27, 40). Propiedades bioquimicas La habilidad para reducir nitratos a nitrites y fermentar la glucosa sin la forma- cin de gas es comin a todos los heméfilos aviarios, La actividad oxidasa positiva, la presencia de la enzima fosfatasa alealina y Ia falta de produceién de indol o hidrélisis, de la urea 0 gelatina son también caracte- risticas uniformes. Existe considerable confusién en la inter- pretacién de los resultados de la fermenta-Coriza infeeciosa 159 cién de carbohidratos por los heméfilos aviarios. En general, la variabilidad regis. trada en la bibliografia puede deberse al uso de diferentes medios basales. Los resul- iados falsos negatives se asocian prineipal- anente con crecimiento pobre y pueden ser un problema significativo (1). En la mayo- ria de los estudios recientes se ha usado un medio compuesto por caldo rojo feno] con la adicion de 1% (pv) de CINa, 25 ug/ml de NADH (NAD reducido), 1% (v/v) de suero de pollo y 1% (p/v) del correspondiente car bohidrato, El uso de este caldo y la precau- cidn de efectuar un inéculo denso es Ia elec- cin motodolégica més conveniente para poder interpretar correctamente los resul- tados de la fermentacion de los carbohidra- tos. Para estudios m4s extensos la seleccién de la técnica de cultivos en placa duplica- da (1) es lo més apropiado. El Cuadro 1 presenta aquellas propieda- des que permiten una identificacién comple- ta de los heméfilos aviarios. Se muestran las propiedades del complejo grupo de H. avium y las nuevas especies de Pasteurella. La fal- ta de produccién de catalasa y la ausencia de fermentacién de la galactosa y trehalosa por el H. paragallinarum son propiedades que elaramente separan a esta especie del resto de los otros heméfilos aviarios, CUADRO 1 Diferenciacién de los heméfilos aviarios Pruebas Haemophilus Haemophilus Pasteurella Pasteurella Pasteurella paragallinarum avium avium — volantium especie A Pigmento _ ‘V(amarille) V (amarillo) V (amarillo) V (amaritto) Catalasa ~ + + + + Crecimiento acrobio No 8 Si si Si ONPG + v _ + Vv Produccién de Scido de: Arabinosa _ v - - + Galactosa a + + + + Maltosa + v - + v fanitol + v - + v Sorbitol v v = v ee Sacarosa v + + + + Trehalosa - + + + + ‘Con la excepcidn de algunos aislamientos de H. parogallinarum, todas las especies son bacilos Gram Degativos que requieren factor V pero no X. Thdas las especies producen dcido de ln glucosa 7 crecen con 6% de anhidrido carbinica, + = Positive (> 90%). — ‘egativo {> 90%). V = Reaccién variable160 _Revista Argentina de Microbiologia - 27 (3) - Julio / Setiembre de 1995 ESQUEMAS DE SEROTIPIFICACION Esquema de Page EI primer estudio serolégico de H. para- gallinarum fae realizado en los EE.UU. por Page (42) quien usé una prueba de aglutina- cidn para identificar tres serovariedades (A, By ©). El esquema de Page es el métode mas, comunmente empleado para serotipificar a H, paragallinarwm. Clasicamente esta técni- ca se implementa utilizando antisueros de co- nojo contra las tres cepas de referencia (serovariedad A - cepa 0083, serovariedad B - cepa 0222 y serovariodad C - cepa Modes- to). Para efectuar la prueba se realizan di- luciones de los correspondientes sueros y se enfrentan con cultivos de las cepas a clasifi- car en una prueba de aglutinacién en placa © portaobjetos. Las cepas de las tres serovariedades tienen antigenos comunes y ello se evideneia con abundantes reacciones serolégicas cruzadas. Por lo tanto una cepa se identifica como perteneciente a una deter- minada serovariedad si comparativamente aglutina a la dilucién més alta del suero co- rrespondiente a la sorovariedad asignada Una gran desventaja del esquema de Page es Ia alta incidencia de cepas no serotipifi- cables, tanto por ser autoagiutinantes como no aglutinantes; asi se encontraron hasta un 88% de cepas inclasificables en uno de los studios (5). Se ha demostrado que todas las cepas de H. paragallinarum, independiente- mente de la serovariedad de Page a la cual pertenecen, tienen actividad hemoaglutinan: te (HA) siempre que se utilicen glébulos ro- jos de pollo fijados con glutaraldehido, Esta actividad HA ha sido empleada como punto de partida para la reslizacién de una prue ba de inbibicién de la hemoaglutinacién (HD, usando antisueros de conejo conira las serovariedades de referencia A, By C. En el Animal Research Institute (ART) de Austra lia se ha aplicado la metodologia de HI en el esquema de Page logrando de ese modo serotipificar a 70 de los 72 aislamientos de H. paragallinarum, que se estudiaron (6). Deberia sefialarse que algunos de los aisla- mientos requieren tratamiento previo con hialuronidasa para que la actividad HA pue- da sor ovidonciada, por ejemplo este trata- miento se tavo que aplicar a 9 de los 72. ais- Iamientos del citado estudio (6) Los anticuerpos monoclonales (AeMs) son. ‘itiles para clasificar a los aislamientos de H. paragallinarum dentro de las serovariedades de Pago. Se ha demostrado que cuatro AcMs pueden ser usados tanto en pruebas de HI como de «dot-blot» para serotipificar los ais- lamientos de campo (17). El uso de los eua- tro AcMs dio mejores resultados que un es- tudio anterior en el cual sélo se disponia de dos AcMs (14). Sin embargo existen diferen- cias regionales entre las eepas, por ejemplo los aislamientos de la serovariedad A de Ar- gentina y Brasil son antigénicamente dife- rentes a las cepas del resto del mundo (16). Esquema de Kume Este esquema es un método alternative al de Page (24). Se basa en la deteceién de hemoaglutininas en eélulas bacterianas que primeramente se tratan con tiocianato de potasio y son luego sonicadas. La actividad de HA también se detecta usando glébulos ojos de pollo fijados con glutaraldehfdo. De acuerdo a lo demostrado recientemente (7), el esquema de Kume reconoce tres serogru pos que corresponden a las serovariedades A, By C de Page. Ademés existen diferen- cias menores que pueden sor detectadasCoriza infecciosa 161 rediante el uso de antisueros adsorbidos, or ello el esquema que originalmente se ropuso reconocié tres serogrupus y siete srovariedades. Ultimamente el esquema de “ume ha sido utilizado eon bastante fre- aencia en e! ARI, pormitionde el reconoci- ionto de dos nuevas serovariedades (7). ebido a la aparicién de nuevas serovarie- ades se ha sugerido una nueva termino- gia para el esquema de Kume. Actualmen- nos referimos a los serogrupos A, By C sl esquema de Kume, Las serovariedades intro de los serogrupos se identifican nu- éricamente, Hasta ahora las serovarie- ides reconocidas en el esquema de Kume ni AL, A2, A3, Ad, Bl, C-1, 0-2, 08 y 4 (7). En la nueva torminclogia se fatiza la equivalencia que oxiate entre las rovariedades de Page y los sorogrupos dv ame. Bl esquema de Kume tiene la ventaja de © requerir aglutinacién de células etorianas y por Jo tanto, evita el proble. a de In autoagiutinavion o inaglutinabi- lad que veurre cuando el esquema de ge se efectia mediante una prueba de lutinacién. A pesar de ello el esquema de ume continia siendo una téenica dificul- ‘a y poco utilizada, prineipalmente debi- a Ia necesidad de proparar antisueras vevificos mediante adsoreién, quema de Hinz Un esquema de serotipificaciin basade Ja deteceién de antigenos tormaestables sido propuesto para identifiear seis ovariedades por medio de nna prueba de asién en gel (25), Este esquema no pa- © haber sido utilizade en ningun otro ar distinto al de la publieseidn original. 4Cuall es el mejor esquema de serotipificacién? Evidentemente no existe un esquema de serotipificacisn en particular que se adap- te a las necesidades de cada Laboratorio. El esquema de Page adaptado @ una prueba de HI (6), parecerfa ser Ia opeién mas simple que esté disponible para la mayoria de fos laboratorios. Cuando se usa la prueba de HT con e] esquema de Page es importante que Jos antigonos hemoaglutinantes se preparen de un modo similar ai deserito en el ostu- dio original (6), Este particular método de preduccidn evita Ja necesidad do un trata- miento adicional de los antigenos en la mayoria de los aislamientos. El hecho de que Jas serovariedades de Page también se covrespondan ean el tipo de inmunidad es- pecifica que confieren ias vacunas inaetiva- das #9 otro potteroso motive para adoptar ol ‘eipleo de este metodo. Hl esquema de Kume es el que confiere ef mayor grado de subtipiticnzién, pero dado «que es ana prueba téenicantente muy exi gente no es posible adoptarla en muchos laboratories. Por otro lado adn permaneco confueo el significado de kas serovariedades de Kume con relacién ai tipo especitico de inmunidad adquirida Puesto que los anticuerpos monoclonals no estin disponibles comercialmente su uti- Lzacién esta restringida a aquellos labora- torios que tienen acceso dirvetn a estos veactivos RECIENTES RESULTADOS DE SEROTIPIFICACION Durante los ultimos dies ais se han efectuado una serie de estudios sobre la prevalencia de varias seravariedades de162 Revista Argentina de Microbiologia - 27 Julio / Sotiembre de 1995 Page en diferentes paises, Los resultados de diversas investigaciones se resumen en el Cuadro 2. Estos estudios de serotipificacion tienen importancia para los programas de vacunacién a implementar y sern discuti- dos mas adelante en la seccién sobre vacu- nacién. Sin embargo se debe comprender que la mayorfa de los estudios realizados no son relevamientos sistomaticos y por lo tan- to estos resultados no constituyen necesa- riamente un reflejo exacto de la situacién general de cada pais. ‘Dos temas deben ser considerados como los més importantes en los estudios reali- zados en Sudamérica. En primer lugar se destaca la alta ineideneia de la serovariedad B de Page en 1a Republica Argentina pues- to que 17 de 41 aislamientos han sido cla- sifieados dentro de osta variedad (48). Es importante destacar que durante muchos atios la serovariedad B de Page no fue ais~ Jada y algunos reportes cientificos habian hecho dudar de su existencia, sugiriendo gue las cepas que originalmente fueron des: critas por Page serian variantes de las serovariedades A o C (61). En un reciente estudio, se ha demostrado que Ia serovarie- dad B de Page realmente existe (58). Los nuevos estudios realizados en Argentina (48, 54) y en ol exterior (80) han demostra- do la importancia de esta sorovariedad afir mando la necesidad de incluirla en las va- cunas comerciales En segundo lugar se debe destacar que en Sudamérica algunas cepas de Ia serova- riedad A'de Page son antigénicamente dis- CUADRO 2 Resultados de los estudios de serotipificacién de Huemophilus paragallinarum en varios paises Pais ‘Numero de Serovariedad de Page: Referencia aislamientos Ne A B c NT Angentina al 21 wv 1 2 43 ‘Australia 39 5 0 28 6 55 “ 43 2 0 2 uw 5 « 6 16 0 2 1 a4 Brasil at 4 1 nL 1 13 China un a o ° 0 20 Japon 88 e ° ca 2 50 « 106 49 0 22, 2 59 10 1 ° 6 0 62 18 4 0 4 5 5 « 2 5 2 5 0 24 [Ta mayoria de los estudios de este cuadro fueron realizados usando el esquema de Page. El estudio Ge Baves y col, (24) fue Hevado a eabo empleando el esquema de Kume y los resultados han sido sconvertidas» sl esquema de Page,Coriza infecciosa nias de los aislamientos tipicos de esta srovariedad que est distribuida en otras giones del mundo. Asi en Argentina, 4 de ) aislamiontos de la serovariedad A, y en rasil, 6 de 14 aislamientos de la misma wrovariedad, no reaceionaron ¢on los aticuerpos monoclonales especificos (13, 4), No se conoce con exactitud el signi ido de estos aislamientos sudamericanos > la serovariedad A que no reaccionan con anticuerpos monoclonales; este tema ‘74 diseutido con detalle en la préxima ‘ecién sobre vacanacién. {VESTIGACION DE NUEVOS ETODOS DE DIAGNOSTICO Se han producido AeMs en Japén (58, 60, ) y Sudafrica (56). Los AcMs japoneses in sido caracterizados en términos de su bilidad para reconocer a las diferentes rovariedades de H. paragallinarum (14, ', 17) y son, por lo tanto, herramientas tencialmente utiles. Desafortunadamen. los AcMs de Sudafrica nunca han sido racterizados totalmente y por ese motivo ‘nen un uso limitado, Una gran desven- ja de todos los AcMs es que ninguno esta mereialmente disponible y por ello sélo eden ser empleados por los grupos de vestigacién que los producon, El trabajo que actualmente se realiza en ARI se orienta hacia una nueva genera- in de herramientas para el diagnéstico. \ este proyecto se seleccionaron dos orien- siones 0 lineas de trabajo. La primera voluera el desarrollo de pruebas basadas la deteccion del DNA bacteriano para la ntificacién répida y espeeifica de H. ragallinarum, Hasta el momento se han savrollado pruebas de busqueda de DNA )NA-prober) obteniéndose dos prucbas de reaccién en cadena de polimerasa («pol: merase chain reaction» 0 PCR) para H. paragallinarum. Una de ellas se basa en a deteccidn de fragmentos de DNA al azar y Ia otra esté ditigida hacia el DNA que co- difiea para los rRNA 238 del microorganis- mo, Ninguna de las dos pruebas es hasta ahora infalible: con Ia primera se obtienen algunos resultados falsos positives mientras que con el segundo PCR se detectan algu- nos resultados falsos negativos (datos no ublicados). Con el perfeccionamiento de es- tas pruebas se espera obtener un diagn tico rapido a partir de hisopados sinusales de las aves enfermas. Estas pruebas moleculares de nueva generacién han de- mostrado ser titiles para identificar a cepas sudafricanas de H. paragallinarum inde- pendientes del factor V (NADH). La otra linea de trabajo se orienta hacia la produccién de AcMs. Se intenta elaborar gran cantidad de AeMs que, de este mado, estarfan eventualmente disponibles en las fuentes comerciales. Esto eliminaria la se- tia limitacién que tienen los equipos de AcMs que se producon mediante el enfoque tradicional. Posteriormente se investigaré el empleo de estos anticuerpos en pruebas de ELISA para la deteccién directa de los, antigenos correspondientes a las serovarie. dades especificas y asi efectuar diagnésti- cos répidos y precisos. PROTECCION CRUZADA DESPUES DE LA INFECCION 0 VACUNACION Existe evidencia de que luego de una infeccién natural se produce inmunidad subsecuente que oftece proteecién contra sorovariedades de Page tanto homélogas como heterdlogas (45, 49).164 Rovista Argentina de Microbiologia ~ Al analizar Ja literatura cientffica refe- rida al grado de proteccién eruzada entre serovariedades que confieren las vacutsas a células enteras muertas, son dos los tépi- cos que pueden confundir la interpretacién de los resultados de estas investigaciones. Primero debo tenerse en euenta que dife- rentes estudios han definido a la «protec- ign» de distintas maneras. Algunos inves- tigadores han evaluado a la misma sélo en términos referidos a la presencia 0 ausen- cia de sintomas clinicos, Otros, incluyendo los estudios lovados a cabo on el ARI y en el INTA, han detinido que un ave vacuna. da osta protegida si luego del desafio con una copa virulenta presenta tres caracteris- ticas: 1) ausencia de sintomas clinicos, 2) falta de mucus en los senos paranasales en la necropsia y 8) imposibilidad de aisiar al microorganismo inoculado de estos mismos senos. Sin duda, la tiltima definicion es mucho mas exigente que la simple ausen- cia de sintomas elinicos ‘La otra cuestidn que debe ser considera- da cuando s¢ examina la proteccién cruza- da entre serovariedades es el esquema de serotipificacién utilizado. La mayoria de los estudios realizados sobre proteccin cruza- da incluyeron aislamientos que se serotipificaron por el esquema de Page. El nuevo esquema de Kume ha permitida serotipifiear con mayor precision a H. paragallinarum. Ahora se sabe que tos serogrupos de Kume se corresponden con las serovariedades de Page, Sin embargo debe reeordarse que es posible que aisla- mientos de la misma serovariedad de Page {equivalente a expresar el mismo serograpo de Kume) pertenezcan a diferentes serovariedades de Kume. Por ejemplo-las cepas HP31 y HIP60 (cepas australianas del 27 (3) - Julio / Setiembre de 1995 ARI) pertenecen ambas 4 la serovariedad C de Page (equivalente ai serograpo C de ‘Kume) aunque son respectivamente serova- riedades 0-2 y C-4 de Kume (7) Teniendo en cuenta Las limitaciones cita- das més arriba puede coneluirse que, en general, existe coincidencia en la literatu- ra cientifiea sobre las vacunas muertas con- tra la coriza infecciosa y ia proteccién er zada que las mismas confieren. Los inves~ tigadores que han utilizado vacunas basa~ das en cultivos de tejidns o vitelo de hue- vos embrionados han reportado algun gra- do de proteceiin cruzada entre las serova- riedades de Page (43, 57). Bn contraste, se ha demostrado que las vacunas muertas preparadas con antigenos desarrollados en caldos de eultivo brindan muy poca protec- cion crazada entre Ins serovariedades de Page (12, 36, 45). En lo que respecta a pro- teceién eruzada, la diferencia entre las va- cunas elaboradas con huevo 0 ealdo, podria estar relacionada con Ja estructura antigé- nica. Puesto que la infeceién natural pro- duce protectién cruzada entre estas sero- variedades, es posible que el antigeno bacteriano producido en el vitelo de los huevos tenga una estructura antigénica s milar ¢ la que presenta originalmente el microorganismo en el ave, siendo probable- mente distinta a la obtenida cuando osto germen crece en los caldos de cultivo. El hecho de que las vacunas producidas en huevos provean cierto grado de proteccién cruzada entre las serovariedades de Page, no deberia ser tomado como una recomen- dacién general para decidir la utilizacién de este tipo de vacunas. Cuando se considera exclusivamente a la proteccién homdloga entre las serovariedades de Page, son va- trios los estudios que han demostrado queCoriza infecciosa 165 las vacunas basadas en caldos de cultivos son més efectivas que las claboradas en huevos (23, 39). Puesto que el esquema de Kume todavia no ha sido ampliamente utilizado, resulta dificil realizar una evaluacién de la litera- tura cientifiea referida a la proteccién eru- zada entre estas serovariedadades, A pesar de ello, los datos disponibles indican que, en general, los serogrupos de Kume no pre- sentan proteccién eruzada entre si. In cam- bio, parece ser que dentro de un mismo serogrupo de Kume existe un grado signi- ficativo de proteccién cruzada entre las serovariedades que lo integran. Hasta el ‘momento, los resultados obtenidos en estu- dios de proteccién con combinaciones de serovariedades de Kume (4, 12, 36) son los siguientes: a) ensayos donde se demostré protecciéa cruzada entre C-1 con O-2 y C-2 con C-4; yb) ensayos donde no existié pro- teccién cruzada entre A-1 con C-1, A-l con €-2, A-d con C-2 y And con C-4. En general, la evidencia disponible seia- Ja que las vacunas inactivadas o bacterinas contra la coriza infecciosa, preparadas con células enteras muertas que han sido desa- rrolladas en caldos de cultivo, tinicamente Proveen protectién contra aquellas serova- riedades de Page que se incluyen en Ie for- mulacién de las mismas. La confirmacién de la oxistencia de la serovariedad B de Page como una auténtica serovariedad con pato- genicidad completa (68) y su existencia en Argentina (48, 54), Brasil (13) y quizds tam. bién en otros patses de Sudamérica, indica ‘que la misma debe ser incluida en la for- mulacién de las bacterinas, si se considera que Ia poblacién avicola a inmunizar se encuentra on un area geografica donde pre- domina la mencionada serovariedad. Ae- tualmente se reconoce la importancia de proteger contra la serovariedad B y ya exis- ten algunas vacunas comerciales inactiva: das (30) que contienen cepas virulentas de la serovariedad B. Otro factor que debe ser considerado es 1a posibilidad de variaciones antigénicas en determinadas Areas googréficas, Ahora se sabe que algunos aislamientos de la serova- riedad A de Page de la Argentina (54) y del Brasil (13) son antigénicamente diferentes a las copas tradicionales, puesto que no reaccionan con los AcMs especificos para esta serovariedad. {Significa que los men- cionados aislamientos son también diferen- tes en sus propiedades inmunolégicas? eProtegerdn las vacunas preparadas con cepas A tradicionales contra una descarga ofectuada con aislamientos de la serovarie- dad A que no reaccionan con los anticuerpos monoclonales? Por el momento no conoce- mos la respuesta a ambas preguntas, Exis- te, por lo tanto, la necesidad de realizar estudios sobre proteccién que incluyan a estos aislamientos sudamericanos de H. paragallinarum. VACUNAS INACTIVADAS 0 BACTERINAS Medios de cultivo Se ha informado sobre una variedad de diferentes métodos de preparacién de antigenos para vacunas contra la coriza infecciosa usando sacos vitelinos de embrio- nes de pollo, caldos de cultivo y cultivos colulares de tejidos aviarios. La propaga- cién en huevo fue ol método usado a c mienzos de Ia déeada del 60 para la produc- cign de las primeras vacunas contra la co- riza infeeciosa (43). Si bien estas vacunas no brindaron buena proteccién contra los signos clinicos de la enfermedad, lograron166 _ Revista Argentina de Microbiologia - 27 (3) Julio / Setiembre de 1995 en cambio prevonir el desarrollo de las le- siones secundarias de los sacos aéreos y redujeron las pérdidas de la produecién de huevos por caidas de postura asociadas a los brotes de coriza infecciosa. Investigacio- nes posteriores han demostrado que las va- cunas claboradas con ealdos de cultivo con- fieren mejor proteccidn que los productos fabricados en huevos embrionados (23, 39). Solo existe un trabajo que deseribe la pro- duccién de vacunas contra la coriza infec- ciosa en cultives de tejidos aviarios (57). Este tiniéo estudio informa que una vacu- na elaborada on cultivos de tejidos fue su- perior a bacterinas producidas en caldos con- vencionales (57). Dado que la reciente bi- bliografia sobre Ja produccién de vacunas contra la coriza infecciosa sélo involucra el empleo de caldos de cultivo, el resto de la pre- sonte revisién se referira exelusivamente a la eficacia de las bactorinas producidas en caldos, En Ia produccién de vacunas contra la coriza infecciosa se han utilizado diferentes medios de cultivos. Enire los ealdos que han demostrado dar buen resultado para la fa- bricacién de bacterinas efectivas, se inchi- yen varios tipos de infusiones de carne de pollo (37, 38) y un caldo de Casman modi- ficado (12, 47). Aparentemente no se han publicado comparaciones directas entre los resultados obtenidos mediante el empleo de bacterinas producidas on distintos medios de cultivo; debido a ello la eficacia relativa de estos medios no puede ser evaluada. Niveles de antigeno Se ha demostrado que 10° unidades formadoras de colonias por dosis do vacu- na es la dosis minima de antigeno que brin- da adecuada proteccién (39) Agentes inactivantes Existe cierta diserepancia sobre el efec- to de diferentes agentes inactivates, Varios estudios han confirmado que el timerosal es un efectivo agente inactivante (12, 23, 39). Otros investigadores han informado que l vacunas en las cuales se usé formalina como agente inactivante fueron también ofectivas (22, 47), Se han realizado tres estudios eompara- tivos directos utilizando vacunas que difi- rieron sélo en la formulacién del agente inactivante; as{ por ejemplo, en estos tra- bajos las fases de antigeno y adyuvante fueron exactamente las mismas y solamente s@ varié Ia composicién del agente inactivante utilizado. En una de estas com- paraciones directas, se determiné que el u: de la formalina, en vex del timerosal, pro- dujo una reduccién de la eficacia de vacu- nas que contienen gel de hidréxido de alu- minio como adyuvante (12). Matsumoto y Yamamoto (38) encontraron que la formalina, comparada con el timerosal, dis- minuye la eficacia de una vacuna que con- tenia como adyuvante alumbre de cromo. Sin embargo, estos mismos autores no en- contraron diferencias entre el timerosal y la formalina en otras vacunas que conte- nfan gel de hidréxido de aluminio, En ef estudio restante, In adicién de formalina, comparada con el tradicional uso del timerosal, redujo la oficacia de vacunas con- teniendo tanto geles de aceite mineral como de hidréxido de aluminio (23). En general se concluye que, si bien las bacterinas inactivadas con formalina pueden ser pro- tectoras, es posible que vacunas similares conteniendo timerosal podrian ser avin mas eficacas.Coriza infecciosa 167 Adyuvantes Se ha evaluado una variedad de adyuvantes para vacunas inactivadas con- ura a coriza infecciosa de las aves. Nueva- mente es importante recordar que diferen- tes investigadores han usado distintos cr terios para evaluar la «proteccién». De este modo, algunos de los resultados divergen. tes que se han registrado en la bibliogratia pueden provenir del uso de diferentes defi- niciones del término «proteccién». Las va- cunas ensayadas, elegibles o candidatas para ser seleccionadas, debersn ser das en dos aspectos: eficacia y seguridad. Este ultimo item se refiere a la ausencia o presencia de minimas reaceiones post. vacunales, El tema de las reacciones colaterales ad- versas debe ser seriamente considerado en Jas vacunas contra la coriza infeceiosa. En varios estudios se han registrado reaceiones colaterales relacionadas con Ia aplicacién de estas vacunas. Se ha sugerido que estas reacciones pueden estar asociadas tanto con el adyuvante como con el lipopolisacarido (LPS) que se encuentra en las eélulas de H. paragallinarum (28). Se ha demostrado que el LPS del H. paragallinarum ha sido letal para huevos embrionados de pollo y resulté positive en una prueba para la de- teceién de pirégenos (98). Iritani y col. (28) también han demostrado que un extracto de polisacérido poco purificado contiene un componente que es téxico y causa hidropericardio cuando se inocula intrave- nosamente a polos. Cualquier anteceden- te de reacciones colaterales adversas seri Aeserito en las siguientes secciones, anotan- do su relacion con los variados sistemas de adyuvantes que pueden emplearse. 1) Geies de hidréxido de aluminio y alubre de cromo: Se efectuaron una can- tidad de estudios que confirman la efica- cia del gol de hidréxido de aluminio (23, 37, 388, 44). También se ha encontrado que ei alumbre de eromo es un adyuvante efecti vo (38). Se evaluaron dos mareas comercia- les distintas de geles de hidréxido de alu- minio y se encontraron diferencias aprecia- bles entre Jas mismas (12). Varios estudios han informado sobre la aparicién de reac- ciones muy leves en el lugar de vacunacién (18, 38). En todos estos trabajos se consi- der6 que las reacciones adversas encontra- das en aves vacunadas con bacterinas que contenian gel de hidréxido de aluminio fue- ron minimas. En los estudios realizados en ol ARI 0 bien no se pudo detectar ninguna reaccién adversa 0 sélo se encontraron re- aceiones menores en el sitio de inoculacién (8, 12, 44), 2) Aceite mineral (tipo emulsién tinica): Con respecto a la eficacia de las vacunas con emulsiones del tipo aceite mineral han existido algunos desacuerdos. La revision de esta seccidn se centrara en aquellas va- cunas que contienen aceite mineral en un sistema de emulsién tinica, como por ejem- plo del tipo de emulsién «agua en aceiten. Clark y Godfrey (21) realizaron uno de los primeros estudios en el cual se examiné la eficacia de las vacunas propagadas en hue- vo y elaboradas con aceite mineral. En este estudio se informs que estas vacunas real- mente conferian algin grado de proteccién cuando fueron comparadas con aves contro- les sin vacunar. Las pollas vacunadas de- sarvollaron signos clinicos de coriza aunque Ja severidad de los mismos fue reducida en ‘comparacién con los sintomas de las aves controles que no fueron vacunadas. Asimis168 Revista Argentina de Microbiologia - 27 (3) - Julio / Setiembre de 1995 ‘mo, la recuperacién de las pollas vacunadas, fue més répida y la ineidencia de compli- caciones fue mas baja que en los controles sin vacunar (21), Probablemente la baja eficacia obtenida con esta vacuna en parti- cular puede haberse debido a otros factores, ademas del sistema adyuvante, como por ejemplo el uso de antigeno propagado on huevo 0 Ja adicién de formalina como agen- te ingctivante. En un estudio posterior, efectuado por Matsumoto y Yamamoto (38), también se encontraron resultados poco satisfactorios mediante el empleo de una yacuna comercial similar, propagada en huevo y con el agregado de aceite mineral. Con referencia a las bacterinas propaga- das en caldo, todavia existe desacuerdo so- bre la eficacia que tienen esas vacunas cuando se utiliza al aceite mineral como adyuvante. En el ARI se han comparado direetamente vacunas elaboradas con el mismo antigeno pero empleando diferentes sistemas de adyuvantes. De ese modo se comprobé que, si bien las vacunas elabora- das con aceite mineral conferian cierta pro- teccién, ésta era mucho menor que la brin- dada por una vacuna conteniendo adyuvante de gel de hidréxido de aluminio (44), En estos trabajos se probaron dos con- centraciones diferentes de aceite en el com- ponente del adyavante pero no se logré ‘mejorar la eficacia de los productos. En con- traste, Davis y col. (23) no encontraron di- ferencias notables en un trabajo en el que se efectué una comparacién directa entre vacunas elaboradas con adyuvantes de acei- te mineral ¢ hidréxido de aluminio. En un estudio realizado en Sudéfrica (22) se ha informado que vacunas con aceite mineral superaron la eficacia de una vacuna que contenfa hidréxide de aluminio. Sin embar- 0, los resultados de este trabajo deben ser considerados con procaueién. En este caso Jas vacunas con aceite mineral contenian cepas de la serovariedades Ay B de Page mientras que la vacuna con gel de hidroxi- do de aluminio contenia cepas de las serovariedades Ay C, En estos ensayos fue utilizada una mozela de copas de las serovariedades A y B de Page para desafiar alas aves vacunadas y testigos en la des- carga para la reproduccién experimental; claramente la vacuna con gel de hidréxido de aluminio no contenia la serovariedad B de Page que seria la apropiada para prote- ger a los animales, Recientemente se ha informado la oficacia de una vacuna trivalente elaborada con aceite mineral que brinda adecuada proteccién contra las serovariedades de Page (50). Otro aspecto importante que debe tener- se en cuenta cuando se utilizan vacunas que contienen aceite mineral es la seguri- dad del producto. En un estudio realizado en el ART se encontré que vacunas experi- mentales preparadas con aceite mineral causaron hinchazones localizadas en el rea de vacunacién en 15 de las 20 aves vacu- nadas y granulomas en 18 de las mismas (44), Debe admitirse que la severidad de estas reacciones es inaceptable para las operaciones avicolas en escala comercial. Por otro lado, se seftala que todos Ios otros estudios que han examinado el uso de va- cunas contra Ia coriza infecciosa con aceite mineral, no han indicado la realizacién de andlisis especificos para detectar cualquier posible reaccién adversa asociada a la va- eunacién. Dado que los LPS de H. para gallinarum han demostrado ser pirogéni- cos (33) la ausentia de registros sobre la ‘ocurrencia de fiebre en las aves experimen-Coriza infeceiosa 169 talmente vacunadas constituye una impor- tante deficiencia de todvs estos ensayos. ‘Todas las vacunas examinades que conten- gan aceite mineral y que podrian ser candidatas a ser seleccionadas para su em- pleo contra la coriza infeeciosa, deherfan ser siempre cuidadosamente evaiuadas para detectar cualquier evidencia de reacciones colaterales adversas a Ja vacuna 3) Hidréxido de aluminio y acvite mine- ral (tipo emulsién tinica): En un intento para aumentar la efieacia de las vacunas con aceite mineral, se han evaluado bacterinas que contienen ambos adyuvantes a la vex, hidréxido de aluminio y aceite mineral. Se demostré que tales vacunas son realmente muy efectivas. Sin embargo, es- tas bacterinas combinadas producen reac- ciones adversas atin mas severas que las do Jos productos preparados tinieamente con aceite mineral (44). & Aceite mineral (tipo emulsion doble) Gn adyuvante de eimulsién doble es un sis- tema alternativo para combinar las fases de antfgeno y adyuvante. Una emulsion doble se logra re-emulsionands wna emulsién simple «agua en aceites en una fase exter- na de agua, En una evaluacién inicial de emulsiones dobles (3), se demostré que es- tas vacunas brindan nivetes muy pobres de proteccisn. Sin embargo, no se evidencié ninguna reaceién adversa vacunal. Bl acei- te empleado en las vacunas del tipo de emulsién doble pertenecia al mismo lote que habia sido utilizado en un estudio pre- vio de vacunas del tipo de envulsién simple sagua en aceite. La presencia de aceite mineral en las vacunas con este tipo de ‘emulsiones simples fue asociada con reac- ciones adversas bastante severas (44). Sin embargo, estas reacciones estuvieron au- sentes cuando se us6 el mismo aceite en un sistema de emulsiones dobles. Esto sugiere que ef método de preparacién de una vacu na de emulsién doble ejerce algtin tipo de moderacién sobre Ia toxicidad de las bacterinas elaboradas con aceite mineral y eélulas inactivadas de H. paragallina- En un reciente estudio se han obtenido resultados mucho mas alentadores em- pleando sistemas de emulsién doble. Al rea- lizar trabajos en colaboracién con un fabri- cante australiano, muy experimentado en Ia produccién comercial de este tipo de va- cunas basadas en omulsiones dobles, se ‘obtuvieron elevados niveles de proteccién y se demostr6 que este tipo de bacterinas son altamente efectivas (8). También se ha ob- servado que estas vacunas de emulsién do- ble, causan muy pocas reacciones adversas en el sitio de la vacunacién (miisculo de la pechuga). Rstos resultados indiean que, siempre que sea correctamente formulado, el sistema de emulsién doble aplicado a las vacunas contra la coriza infecciosa es al mismo tiempo seguro y efectivo 5) Sistemas alternativos de adyuvantes: Se han efectuado pocos estudios sobre la adaptacién de adyuvantes diferentes del hidroxido de aluminio y del aceite mineral para las bacterinas contra la coriza infec- ciosa. En trabajos realizados en el ARI, se examinaron algunos sistemas alternativos de adyuvantes modernos (3, 44). Asi se en- contré que las vacunas elaboradas con la saponina «Quil A» tienen muy poca eficacia. Es posible que un adyuvante mixto que se prepare combinando el gel de hidréxido de aluminio con «Quil A» pueda ser mis efec- tivo que cualquiera de los dos eomponentes por separado,170 Revista Argentina de Microbiologia - 27 (3) Julio / Setiembre de 1995 Del mismo modo, la amina lipoidal avridina no parece tener ningun rol como adyuvante efectivo en vacunas inactivadas contra 1a coriza infecciosa. La avridina es un potente estimulador del interferon y esta considerada como un adyuvante eficaz para la estimulacién de la inmunidad en las mucosas (31). Por ello, en el ARI se evalué a Ia avridina come adyuvante tinico y en dos combinaciones diferentes: asociada con gel de hidréxido de aluminio y con un adyuvante del tipo emulsién dobie en acei- te mineral. En estos ensayos se usaron dos vias de inyeecién: intramuscular e intrana- sal. Cuando la avridina fue empleada como adyuvante tinico la vacuna no fue efectiva por ninguna de las dos vias utilizadas. Por otro lado no se pudo demostrar que la in- clusién de Ia avridina mejorara la eficacia de las vacunas elaboradas tanto con gel de hidréxido de aluminio como con ol sistema de la emulsién doble de aceite mineral. Puesto que los mismos tres métodos usados para incorporar la avridina a las vacunas ya han sido probados por otros investigado- res en distintas enfermedades y éstos han comprobado su eficacia, parece poco proba- ble que la explicacion del pobre rendimien- to de la avridina pueda ser debida a proble- mas en la formulacién, Més bien pareceria que la actividad adyuvante de la avridina no e5 relevante para Jas vacunas contra la coriza infecciosa on particular. ‘Vias de administracion La mayoria de la bibliogratia sobre las ‘vacunas inactivadas contra la coriza infee- ciosa indica que en casi todos los estudios se ha usado tanto Ja via intramuscular como la subcuténea (23, 39). Hay pocas comparaciones directas sobre el efecto de administrar la misma vacuna por diferen- tes vias, En un estudio realizado en el ARI, se demostré que una vaeuna que contiene gel de hidréxide de aluminio fue oficaz al ser aplicada tanto por via subeuténea (en la parte posterior del cuello) como intramuscular (en el misculo de la pechu- ga) (12). Sin embargo, la misma vacuna fue totalmente ineficaz cuando fue suministra- da por via intranasal. Se ha informado (29) que si se inyecta intramuscularmente una vacuna inactivada, elaborada con gel de hidrdxido de aluminio, en el miisculo de ia pata, se induce mejor proteccién que si la misma vacuna se aplica en el misculo de Ja pechuga. No se han descrito las causas de esta distinta protecciin y tampoco se han reportado trabajos similares. Importancia de Ja revacunacién y duracién de la inmunidad La duracién de la inmunidad inducida por Jas vacunas contra la coriza infecciosa ha sido examinada en numerosos estudios. Matsumoto y Yamamoto (39) demostraron ‘que una dosis tiniea de bacterina contenien- do gel de hidréxido de aluminio brindaba proteccién significativa hasta nueve meses después de la inyeccién. Kume y col. (35) pudieron lograr proteccién significativa hasta 30 semanas después de la vacunacién usan- do dos dosis de la vacuna inactivada conte- niendo gel de hidréxido de aluminio, En el ARI se demostré que las bacterinas elabora- das con gel de hidréxido de aluminio pueden brindar algtin grado de proteecién hasta 56 semanas después do la vacunacién. El nivel de proteccicn siempre es mAs alto si se su- ministran dos dosis de la bacterina (12). Analizando en general la bibliografia dis- ponible, puede concluirse que si las evalua-Coriza infocciosa am. ciones de las vacunas inactivadas o bacterinas se efectiian durante periodos cortos de tiempo, una dosis unica de bacterina elaborada con gel de hidréxido de aluminio es suficiente y resulta tan eficaz como la aplicacién de dos dosis, Sin embar- 80, es muy probable que para obtener una proteceién mas prolongada, las baeterinas elaboradas con gel de hidréxido de alumi- nio deberfan inyectarse en dos dosis sepa- radas entre sf por un intervalo minimo de tres semanas. VACUNAS VIVAS En el ARI se han realizado estudios para el desarrollo de vacunas vivas contra la coriza infecciosa durante los tres altimos ailos, Este trabajo se basa en el conocimien- to de que las aves naturalmente infectadas desarrollan inmunidad cruzada entre las serovariedades de Page (45), Esto sugiere Ja hipétesis do que una cepa vivia y no patogena de H. parogailinarum terériea- mente deberia conferir proteccién contra las tres serovariedades Page. El trabajo efectuado ha confirmado que la infeceién con una cepa completamente virulenta de serovariedad C proporciona proteccién tanto contra una cepa diferente de serovariedad C de Kume como contra ‘una cepa serovariedad A de Page (10). Ha- biéndose confirmado la hipétesis fandamen- tal del proyecto, se decidié continuarle y partir de las cepas parentales de las serovariedades A y C se obtuvieron una serie de bacterias mutantes (10). Les mu- taciones han sido Hevadas a cabo por tra- tamiento quimico, Si bien en los trabajos iniciales se ha podido demostrar que casi todas estas mutantes no fueron patégenas (10), en trabajos mas recientes se ha evi- denciado que una de las copas resulté sor virulenta (Blackall, datos no publicados.) Mientras que esta cepa no fue patégena ‘cuando se suministré por via ocular y pro- dujo un nivel de proteccién adecuado fren- te a una descarga de cepas virulentas de las serovariedades Ay C (11), en cambio, resul- £6 completamente virulenta cuando se ino- cul6 por via intrasinusal. Por ello investi- gaciones con otras téenieas, como por ejem- plo mutacicnes dirigidas y basadas en téc- nicas moleculares de insercién de trans- posones, quizds podrian ser mejores méto- dos para la produccién de cepas vacunales vivas atenuadas contra Ia coriza infecciosa BIBLIOGRAFIA 1. Blackall PJ. An evaluation of methods for the detection of carbohydrate fermentation patterns in avian Haemophilus species. 3. ‘Microbiol. Methods 1: 275-281, 1983. 2, Blackall PJ. Biochomical properties of catalaze-positive avian hacmophili. J, Gen, Microbiol. 184: 2801-2805, 1988, 3. Blackall’ PJ, Further comparison of adjuvants for an inactivated infectious coryza vaccine. Avian Dis. $2: 831-835, 1988, 4. Blackall PJ. An evaluation of the crose protection afforded by Inactivated infections coryza vaccines, Aust. Vot. J. 68: 266-267, 1991. 5, Blackall PJ, Raves LE, Serological elas- sification of Australian and South Afriean isolates of Haemophilus paragallinarum. Aust, Vet. J. 65: 362-363, 1988, 6, Blackall PJ, Eaves LE, Aus G. Sorotyping of Haemophilus paragallinarum by the Page scheme: comparison of the use of ag- glutination and hemagglutination-inhibi- tion tests. Avian Dis. 34: 643-645, 1990. 7, Blackall PJ, Eaves LE, Rogers DG. Propossl for a new serovar and altered nomenclature for Haemophilus paragallinarum. in the Kume hemagglutination scheme, J. Clin, Microbiol. 28: 1185-1187, 1990.472 Revista Argentina de Microbiologia - 27 (3) - Julio / Setiembre de 1995 8. Blackall PJ, Baves LE, Rogers DG, Firth G. An evaluation of inactivated infectious coryza vaccines containing a double- emulsion adjuvant system. Avian Dis. 36: 632-636, 1992. 8. Blackall PJ, Farrah JG. An evaluation of commercial dises for the determination of the growth factor requirements of the avian haemophili. Vet. Microbiol, 10: 125-181, 1985, 10. Blackall PJ, Rafiee M, Graydon RJ, ‘Tinworth D. Towards a’ tive infectious coryza vaccine. Proe. XIlth. World Vet. Poult. Assoc. Conf, p. 99, Australia, 1993. A, Blackall PJ, Raflee M, Graydon Md, Tinworth D. Progress towards a live infectious coryza vaccine. Prov. West. Poult, Dis, Conf, Australia, 1994, 12, Blackall PJ, Roid DG. Further efficacy studies on inactivated, aluraiaum- hydroxide-adsorbed vaccines against infectious eoryza. Avian Dis, 1; 627 1987, 44. Blackall PJ, Silva EN, Yamaguchi ‘, Ivitani Y. Characterization of isolates of avian hemophili from Brazil. Avian Dis, 58: 269- 274, 1994 Blackall PJ, Yamaguebi ‘, Iritant ¥, Rogers DG, Evaluation of two monoclonal antibodies for serotyping Heemaphilus paragallinarum. Avian Dis. 34: 861-364, ul 1990. 15, Blackall PJ, Yamamoto &. «Haemophilus gallinarunw — a reexamination. «J. Gen, Microbiol. 185: 469-474, 1939, 16, Blackall PJ, Zhong YZ, Takagi M, Terzolo HR, Sandoval VE, Silva EN. Characteri- zation of two monoclonal antibodies dixec- tod against serovar A Haemophilus paraga- inerum. Avian Dis. 3B: 361-365, 1994, AT. Blackall PJ, Zheng YZ, Yamaguoht‘, iritani Y, Rogers DG. Evalaation of a panel of ‘monoclonal antibodies in the subtyping of Haemophilus paragallinarum. Avian Dis. 35: 955-959, 1901, 18, Boycott BR, Rimler RB, Davis RB. Experi ‘mental coryza in broiler chicks. [, Effects of vaccination with a Haemophilus gallinarum bacterin and its components on weight, gains and resistance to infection. Avian Dis, 19, 20. 21, 22 23. 24. 25, 26. 28. 29. 21: 964-869, 1977, Bragg RR, Cootzou L, Verschoor JA. Plasmid- encoded NAD independence in some South African isolates of Haemophilus paragallinarum. Onderstepoort J. Vet. Res, 60: 147-152, 1993. Chen X, Zhang P, Blackall PJ, Feng W. Characterization of Haemophilus paragalli- narum isolates from China, Avian Dis. 37 574.576, 1993. Clark DS, Godfrey JF, Studies of an inactivated Hemophilus gallinarum vaccine for immunization of chickens against infectious coryza. Avian Dis. 5: 87-41, 1961 Coatzee L, Strydom GS, Rogers EJ. The valuo of eil-adjuvant vaccines in the control of Haemophilus peragallinarum infection Ganfectious coryza) in egg producing birds in South Africa. Devleop. Biol. Standard 51: 469-380, 1982. Davis RB, Rimler RB, Shotts Jr BB. Efficacy studies on Haemophilus gallina: run bacterin preparations. Am. J. Vet, Res BT: 219-229, 1976. Eaves LE, Rogers DG, Blackall PJ. Comparison of hemagglutinin and aggla- tinin schemes for the serological classifica tion of Haemophilus paragalliaarum and proposal of & new homagglutinin serovar, J. Clin. Microbiot. 27: 1510-1513, 1989. Hinz KH. Heat-stable antigenic determi- nants of Haemophilus paragallinarum. Zhi, Vet, Med. B 27: 668.676, 1980. Hinz KH, Kunjara 6. Haemophilus avium ‘a now species from chickens, Int. J. Syat. Bacteriol. 27: 924-829, 1977. Horner RF, Bishop GC, Haw C. An upper respiratory disease of commercial chickens resembling infectious coryza, but caused by a Veiactor independent bacterium. Avian Pathol. 24: 421-427, 1992, Initani Y, Ivaki 8, Yamaguchi 7. Biological activity of erude polysaccharide extracted from two different immunotype strains of Haemophilus gallinarum in chickens. Avian Dis. 25: 29-27, 1981, Ieitani ¥, Kunihivo K, Yamaguchi ‘T. Tomi 7, and Hayashi Y. Difference of immune efficacy of infectious croyza vaccine by different site of injection in chickens. JCoriza infecciosa 173 30, a1. 32, 33, 3a. 35, 16, Jpn. Soc. Poult. 20: 182-185, 1984, Jacobs AAC, Cuenen W, Storm PK. Efficacy of a trivalent Haemophilus paragallinarum vaccine compared to bivalent vaccines. Vet. ‘Microbiol. 82: 43-49, 1992. Jensen KE. Syathetic adjuvants: avridine and other interferon inducers. In: Advances in carriers and adjuvants for veterinary biologics, p. 79-90, ed. R. M. Nervig, P.M. Gough, M. L. Kaeberle, and C. A. Whet- stone, Iowa State University Press, Ames, Towa, 1986, Kilian M.A rapid method for the differentiation of Haemophilus strains, Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Seand, Sect. B 82: 835-842, 1974, Konno Y, Nakase Y. Purification of endo- toxin of Haemophilus gallinarum and theit biological activity. Jpn. J. Bacteriol. 82: 212, 1977, Kume K, Sawata A, Nakai T, Matsumoto M. Serological classification of Hoemophilus paragallinarum with a hemagglutinin sys- tom. J. Clin. Microbiol. 17: 958-964, 1983. Kume K, Sawata 4, Nakase ¥. Haemophilus infections in chickens. 8. Immunogenicity of serotypes 1 and 2 strains of Haemophilus paragallinarum. Spa. J. Vet. Sei. 42: 673- 630, 1980. Kume K, Sawate A, Nakase Y. Immuno- logical relationship between Page's and Sawata's serotype strains of Haemophilus paragallinerum. Aum. J. Vet. Res. 41: 757- "760, 1980. ‘Kume K, Sawata A, Nakase Y. Relationship between protective activity and antigen structure of Haemophilus paragallinarum serotypes 1 and 2, Am, J. Vet, Res, 41: 97- 100, 1980, ;. Matsumoto M. Yamamoto R. A broth hacte- tin against infectious coryza: immunogeni- city of various preparations. Avian Dis. 15: 109-117, 1974 Matsumoto M, Yamamoto R. Protective quality of an aluminum hydroxide-absorbed broth bacterin against infectious coryzs, ‘Am. J. Yet. Res. 36; 579-582, 1975. Mouahid M, Bisgasrd M,’ Morley AJ, ‘Mutters R, Mannheim W. Occurrence of V: factor (NAD) independent strains of a. 42 43, 45, 46, 41 43 49, 50. 51. Haemophilus paragallinarum. Vet. Microbiol. 31: 363-368, 1992, Mutters R, Piechulla K, Hine KH, ‘Mannheim W. Pasteurella avium (Hinz and Kunjara 1977) comb. nov. and Pasteurella volantium sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol 35: 5-9, 1985. Page LA. Haemophilus infections in chickens. 1. Characteristics of 12 Haemo- philus isolates rocovered from diseased chickens, Am. J. Vet. Res, 23: 85-95, 1962, Page LA, Rosenwald AS, Price FC. Haemo- philus infections in chickens. IV. Results of laboratory and fleld trials of formatinized dacterins for the prevention of disease caused by Haemophilus gallinarum, Avian Dis. 7; 239-256, 1963. Reid GG, Blackall PJ. Comparison of adjuvants for an inactivated infectious coryza vaccine. Avian Dis. 1: 59-63, 1987. Rimler RB, Davis RB. Infectious eoryza: In vivo growth of Haemophilus gallinarum as a determinant for eross protection. Am, J. Vet. Res. 98: 1591-1583, 1977. Rinler RB, Davis RB, Page RK. Infectious coryza: eross-protestion studies, using seven strains of Haemophilus gallinarum, Am. J Vet. Res. $8: 1587-1588, 1977 Rimoler RB, Shotts Jr. EB, Davis RB. A growth medium for the production of a bacterin for immunization against infec- tous coryza. Avian Dis. 19: 819-922, 1976. Sandoval VE, Terzolo HR, Blackall RJ. Complicated infectious coryza outbreak in Argentina. Avian Dis, 88: 672-678, 1994, Sato 8, Shilrine M. Serologic response of chickens to exporimental infection with Haemophilus gallincrum, and their immau- nity to challenge. Poutt. Sei. 43: 1199-1204, 1964. Sawata A, Kume K, Nakase ¥. Haemophilus infections in chickens. 2. Types of Haemo- Philus paragallinarum isolates from chi- ckens with infectious coryza, in relation to Haemophilus gallinarum strain N, 221, pn. J. Vet, Sei, 40: 645-652, 1978, Sawata A, Kume K, Nakase ¥. Biologie and serologic relationships between Page's and Sawata's sorotypas of Haemophilus paraga- Uinaram . Am. J. Yot. Res. 41: 1901-1904,174 Revista Argentina de Mierohiolog‘a - 27 (3) - Julio / Setiembre de 1995 1980, in the preparation of a bacterin for the 52. Schalm OW, Boach JR. Studies on prevention of infectious coryza. Proe. West. 5a. 55, 56. 8. infectious coryza of chickens with special reference to its aetiology, Poult. Sci. 15: 473- 482, 1936. ‘Takagi M, Hirayama N, Makie H, Ohta S. Production, characterization and protective effect of monoclonal antibodies to Haemo- philus paragailinarum serotype A. Vet. Microbiol. 27: 327-388, 1991. ‘Torzolo HR, Paolicchi F4, Sandoval VE, Blackall PJ, Yamaguchi 7, Irian Y. Characterization of isolates of Haemophilus paregallinarum from Argontina. Avian Dis. 87: 310-314, 1993. ‘Thorton AM, Blackall PJ. Serological classification of Australian isolates of Hae mophilus paragailinarum. Aust. Vet. J. 61: 251-253, 1984, Versehoor JA, Coetzee L, Visser L. Monoclonal antibody characterization of two field strains of Haemophilus peraga- Hinarum isolated from vaccinated layer hens. Avian Dis. 28: 219-225, 1989. Wiehmann RW, Wichmann’ AC. The cultivation of Haemophilus gallinarum in tissue culture and the use of these cultures 69. 60. 61 a. Poult, Dis. Conf. 32: 7-10, 1983, ’. Yamaguchi T, Blackall PJ, Takigami S, Initant Y, Hayashi Y, Pathogenicity and serovar-specific hemagglutinating antigens of Haemophilus paragallinarum serovar B strains, Avian Dis, 34: 964-968, 1990, Yamaguehi T, Kato K, Takigami S, Iritani Y¥, and Hayashi Y. Serological classification of Japanese isolates of Haemophilus para gollinaruin using two serovar-specific mo- noclonal antibodies. Avian Dis. 34: 364-868, 1990, Yamaguchi T, Takigami 8, Iritani ¥, Hayashi ¥. Characterization of two new monoclonal antibodies against Haemophilus paragallinarumn serovar C hemagglutina- ting antigen. Avian Dis. 84 922-927, 1990. ‘Yamaguchi T, Takigami §, Iritani ¥; Haya- shi ¥. Characterization and use of mono- clonal antibodies to identify Heemophilus paragallinaram serovars, Avian Dis. 94: 52- 57, 1990, Zaini MA, Iritani Y, Serotyping of Haemo- philus paragallinarum in Malaysia. J. Vet. ‘Mad. Sei. 54: 963-365, 1992, Eactén renizaga por Estuao Sigma SL. -E. Usouns 1252-8" = Suenos Aes Ipreso enol as do Naviembve de 1865