You are on page 1of 9
~ lg 618 Endesporosbacterianos em duasespcies de Clostridium. (@) Célaias om eadospoosecalizadoscenralmecte, (0) TEM colon eeuls com endosporsloealirades ma extemidade, que confer: ‘so cmpanisme uma form de ev, produzidos em grandes quankidades, si dspersados em um meio Favordvel, formar aovosfilamentos A conto dos endospors, ‘estes esporos conibuem para a reprocii das eas, Cultivo de Bactérias O cltvo de bactérias em aboratrio apreseta dois problemas. Primeiro, 6 preciso uma cultura pura de una Gnica espe para se estudar as caractersticas de um organism. Em segundo lu 21, € preciso encontrar um meio que permita oerescimento do organismo desejado. Veremos algumas mancres de solucicnar estes problemas, Métodos de Obtengdo de Culturas Puras Para oestudo de baci em Iborti, ¢ importante xe ober uma ealftara pura, una cultura gue conten apenas una ct espécie de organisma. Antes do desenvolvimento ds enicas decltura pura os ienistasestedavam cura mists, u cl ‘urs comtendo diversas tos de orgnismos. Os pesqusadres conseguiam cbservar diferentes formas etamanton de orga ‘os, mas descabriam pouco sobre as necesidadesntconais ou sore a earacterstas do cresciment de spies indivi Ais Hoje, an cultures prs so obtdas através do solaneato dos descendents (ou rok) do uma inca cul “Apesar de gor parser spl, tnia de solar culcas pura fo diel de sr desenvolvida,Tenaivas de solar cas Dor lig sriads foram eqdentementemalsicetidas, pois do fu mais ogansmos de diferentes especies estar vrias vere presents us ma aa igbes. A tenica de Koch deespalar oucas bata eum serie sia fo mas ecient pox fla ceposiava uma nica bateca em alguns locas. Eneta, dle tentou vis substncias side diferentes, Fazendo uso da descobera de Angelina Hesse, esposa de um colaborado, el es tabeleeuo gar somo o agente solidiicante el. Pouss org nisms odigerem prepara em urn sold de 1.5%, clea se fnde a uma temperatura inferior «95°C. Alem disse depois de fund, gn pormanece guido st esfilar 40°C temper tua fio Susie para permit adi de nuns ede or aismos vives que podenam ser destudos pel calor. 0 Método do Esgotamento Hoye. amaneira comets de prepaar cultias pas utiliza mé {odo do esgotamento em pacas de ex. As bactsis so reo. Ihidas comma alga metioa esl, ea alga é movida evemente a superficie do gar, depontando a bactras na esta eu {anes ala de tmoclaga lambada ealgumas basta so fzadas daegiojédepontadac estrada env uma nova ego (Fig. 619), A media que oengotamento continua cadh vez meno baci so deposits, endo aaa larbads aps cala éstiamento. Os organinnos individ sto deposiads nui ‘na regio ena Depo de a laa se incuba a uma tem. Peratura de erescimento adequada ao organism, parecer pe SGuenas colds, cada ums derivade de uma unica cela bate fan. A alga meta eu paras etrar uma porgo de uma colonia isoladae transfers para qualquer meto eae prope Ado, para estados postriores, O uso de tecncas esters (asspias) ansegura que o novo mei icone organismos de oma nica especie. 0 Método Pour Plate (Outra manera de obter ultras puras¢ 0 método pour plate, que liza digdes em sie (> Fig, 6.78), Siofeitas digs dernowo {que adiluigdo final contenha em mécia mil orgarsmos. Eno, coloc-se I'm do meio liquide da diigo final em 9 ml de ga fundio (45°O) €0 meio érapidamente vertigo em una placa et ni A place resultant contri um pequeno nimero de bacteria, algunas das quis formario coli isoladssno sg. Este método petite que algun organisms fquem embebides no meio. Epc. o > Fis. 6.19 Método de cagtameato para obtensio de ea pras: (a) Ui goa ov una poquna quanidade de elu em uma yada de imnculac élvemente exis na parte soperie da repo I dodga A alga flambod, placa gaa alguns npn ‘So reid desta repitoeexiados na regio 2A alga &novamente fanbada eo process €repctido na reife 3A placa éenti incubada {ty Uma placa de Serratia marcescens opin semieatur pelo méto de ‘xzoamento incuba, Observe « grande redugio do nero de olin a prt da regio inca, tiularmente tl para. ocrescimento de microefilos que no - feram a exposigdo ao xiginio do ar na supericie do meio. Meios de Cultura ‘Nanatureza, muita espéces de bactéras e de outros microrge humo so cncontradas ereseendo juntas em oceanes, agos, 010 ‘Gem materia orginica viva ou morta. Estes material podem ser onsiderados meios de cultura naturals. Apesa de a amostes ddosoloe da Sgua seem muitas vores trazidas ao labora, 08 ‘ryanismos neles contidos slo normalmenteisoladose cultares ‘ras sio preparadas para este. ‘Para cultivar boctéis em aboratco, é preciso conhecer suas necessidades nurcionais eter a hablidade de fomecer as subs tania necessérias ao meio. Ao longo de anos de experiéncia em ‘ultivar bactrias emlaboratéi, os microbiologists aprenderam Gquaisnutientes dever ser supides para cada um dos diferentes Srganismos. Cencs organises, tis como aqueles que causa. a sls ea ep, ainda nfo podem ser cltivados em meios de abo. fatirio, les devem crescer em culturas que contenbam cfs ‘vivasoriundas de seres humanos ou de outros anima. Mutos, ‘outros orgaistios caja necesidades nutricionis so razoave mente coahecas podem crescerem um ou mais tipos de msios, Tipos de Meios (5 meios de aboratorio So geralmente micos sintticos, em ‘porigdo aos meiosnaturaisantriormente mencionados. Um ‘melo sinttico & um meio preparado em Inboratio a paride ‘mateias de composig precisa oa razoavelmente bem def nda, Um mele sinétio definido ¢ agucle ue contém tips ¢ {quanidades de substinciasquimicasconheciaseespeciics Exemplos de meios sintéticos definidos sio apresentados nos Quadros 6.263 Um melo complexo, ou meio quimicamente ‘nao-definido, €aguele que contém determinados mateiais Fazoavelmente coneeidos, masque variam igiamente massa Composigdo quimica de partida para patda. Tais meios coo tim sangoe ou extros de came, soa levedura ¢outos orgs rismos. Um ingrediente comum €a peptona, um produto da Aigesto enzimitica das protefnas. Ela fomece pequencs pep- {ios us podem se teados pelos microrganismos. Apesar de as concontragGes exatas nfo serem conhecidas, 08 meios omplexoscontem oligoelementos vitaminas em quantdades suficientes para permit o eessimento de muitos organismos. Tanto as cultuas em caldo nutritive quanto aquelasem eins de agar solidifcado, usados para cultivar muitos orgaismes, ‘Sto meios complexos. Um exemplo de meio complexe ¢ spre tentado no Quadeo 64 Meios Comumente Utilizados ‘Amaioria ds culturas de rotina dos aboratris utiliza meios co. ‘endo peptona de came de boi ou de peixe em meio de cultura tem caldonutiivo ou Sgar sido. Tals mes sio 38 vezes enn {quecos como extrato de evedura, que contém grande nimeo de vitaminas, coenzimas e nvcleosidios.O hidrolisado de case- ia, feito de protefnas do lite, contém muitos aminoScidos eé todo para efriquscercertos meio. Pel ato de osangue corer tmultos nutsienes necessiros aos palgenos fstdioss,o sero (are liquid do sangue depois que os fatores da coasugo fo ‘im removidos),osangue tal eo sangue total aque podem series no enniquecimento de meios.O gar sangue € stil aa idemtieapto de orzanistos que podem causar hems, ow rom pitmento das hemacas,O sangue do carmero € usido porque sua Meio sintético definido para ocultivo {40 Proteus vulgaris TIngredienteQuantitude agredente _Quantidade Koen Tie HPO, Te MiS0,-7H.0 200m ~FES0,"7H0 Omg each, Omg Ghcose Se NHC Te, Aaido oims Otigoetemertas (Ma, Mo, Cu, Co, Za como sas inorganic, ‘quid conhecdas de O02 —0,5 cae) Fone: Alapado de RY. Stn ot 1986, The microbial world. 3 Engowood Clie, NF Pree Hal Meio sinttico definido para o cultivo dia bactériafastidioen Leueononioe mesenteroides Ingrediente __Quantidade Ingrediente _Quantiade Aa ire Fone de eneria Gicose Fonte de mirogénio NiCr a5 Minerais KHLPO, sO0me — FeS04-7H,0 10mg Kuo, Ome MaS0,"3H,0 20mg MgS0,"7H.0 20mg Nac tome Acido orgtnice ‘Acsuto 20g a s6tio Aminocidos Dea@Almiog 200mg LLisina “HCL 250mg Arginine 242mg DeMetoninn 100mg ‘Aspurgins © M0mg— OL Fenilalanina 100 mg ‘sitio rf 1-Cistina Ome D-Secina 30mg ‘ido 300m, LTreonion 200 hy ‘gltimico isi Loome —i-Trptofino dO mg Listing - HCL G2 ng! Tirosina loom Pi-solecina 250mg bL-Valing 20m¢ DtLeveina 250mg Purina pirimidinas Salto de ome Unt toms Guanina 10mg Xantina “HCL 10mg HCI" 24,0 Viaminas Tamint"HC —OSmg_— Riboflavin =o my Pindoxina- HC Nome Ano. tome Piidotamina 03mg Acido Omg Hel asninobenzbico Pika HCL O.3mg_—_Bietina 001 me Patotenato Omg — Acidofsieo Ot a decdcio Foe: HE Subetich¢ CA. Basmaea. “A fact regi forte owt of hhemetise ¢ mais claramente definida do que quando o sangue hhumano ¢ usado ao meio de igar.O fgar chocolate, feito com Samu aguecido, € assim chamnado porgue se toma marrom. sho. colate. Eusado para cltivarpaligenosfastioso. © fear de suco de tomate, que € feo com oppo suco de tmate, ¢usado para o culivo de ctobaclon, J cnrscinet ecu me nucrnus Meios Seltivos, Diferencias ede Enriquecimento Para isola identifier cers micorganistos,espevaimente agucles de pacientes com doengasinfesioss, secu, Its veres meas sles, diferencias de svigaerinnee Estes mciosespeciis to pat exsenial dos mario ages, tcos da micrabiologia © Quadro 5 most alguns txstplon de mcios especie ‘Um mato ssetive 6 agucte que favoreceo cescimenta de alguns organisms, mas supine ocrescimento deen, Por exemplo, para identifica o Clostridium botulinum em amesten de alimentos suspeitas de Serem agentes de enveoenament al menta, os anibios slfadiaznae sito de plimaine SPS ~sufaacine and polmin ule) so acrecetades oat Sura anarobicas as especies de Clostrto Este riod ce turaé cham dpar SPS le permite erescimento do Close dium botdu, 30 paso qe be oeescmema dations tes outraseapcies de Closriam Un meio dferenial poss um constiune que ease un stata cncrvel (uma uc decor onde ED soncioguas core nae bioqunica sxpetica Estamuianga penne, microbiologists ding um detractors os curs qocrescem names placa. Og SPS anh econ tio diferencia. A colbis de Cos orn eras neste msio i escurs,devido a slo de hdrgeni procs Telos rpanimos a paid atives qu omtereneoi Mui eis ts come oar SPS coset Macon, so 20 resto lempo sets eieencia, Oder MlacConkey cons cristal violet essa, gu temo einen tac Gram posrs, ao mest mpage pec o resco de buetias Gram-negavas.O agar Mat oney tum contre carlos eum incor de pH ue tomaas coli fener de lactone vermis eda a olsen femeradoras enor ox nso. Apes de haver algunas xceqdon talon doe organisms que 40 normalmenteencontados nov iets fumanos emer lace, o paso gue amar ar Jos pages (micrganismes caussdores de doco) to far Ummelodeenriquecimento conn utenesespecaisque ermitem o cresciment de um organismo espesfce sus sao deve estar presents em nero suftiene para permite le, Indo identifica. Ao consi deum met stv, tm cio de enriqueimentondo suprime oatos microrganiamoe, Pes exemplo, pelo fats de os organisms da Samoa ph nko sere sfcientementenumerosos para pel ra loco: 0m uma amos feral eles to culivads emam merseoe tendo 0 oligoctementoseiéno, que favorece seu cressinens Ap a incubago no meio de eniqueciment,oaumete oo ‘nimero de orgnismos pssibltara melhor ientifcart Ingredientes do eal nutritive ‘Meio complexo adequado a muitos haeterotréticos Aeua Peptons Estat de cme Melo saliiicado Be ngredientes acim nas quancidades expeciicadss BA xemplos selecionndas de metos de dlagndstico Meio entieado() Seletividade wou diferenciagio aleaneada Aer verse Salmonella Salt: ‘han ‘corre verde shane inte a acs Grar-postivas sim, selecionsaqelas Gram-neeaties Diferencial Pe rtcns coins de Shigella (qe nfo ferment actos nem re ccone eae decor vermatb hans) de oUves organs due ferment um duels apicares eso de cor ama a verde Aga eosin Cramzegaivos ——_Selete: eum) Agae Gram-negaivos MacConkey nieces Kopf ae ames tae al | {| vermont na = supers inlnad, ‘ermetho 80 incinada, amarlo ofan, sem fede procigio Se HS u a Frcalomanas Ticker Acinetbocter ——-Buerbacier iAlaligenes ‘Rebel Diferening de bacls intestinais basendos no TSE esto de beden sere eee ‘Otek inte parcilmente a bactias Gram poses ijerencia: Rican ec az de meen dfrenciam organisms 2 coli “J Enherih ol so owas €normalieote poster tm bebo “eS meat: as colbans de Enterobacter ccronenes Si, Torderos indica que fermpentam a lactose; ea coi de ‘or orgnismos st cor-d-resa clara, indcando que do Selo 6 sia vileta cos sas iliares nib as acta Gram-posivs Diferenial: Sten eo indiador de pH vermetbo neuro (vermebo, quando see denieam os ermentadoces de lactose como colts ‘ermelhas os niofementaores Como cor-e-osa clara. A Tnitora doy patgencsntxtinne€ de nofermentadors fran o redid Naeseedro Diferencial Tiras sm nos de at ntinados (bos colocados em psig incline), onde u fren @ baseada tanto no creseimento ‘roi na sapetce quanto no cescumenteanacrGbico no Sg hbase do tube, O meio cont guantadesespecticas de geo Meares lactose aminodcios contend encore, fer ¢ um wiados dep fogo, ous eat de cada agicareaformagso bes potem ser detctatos 1, Tube de TS o-oculad 2 Inoclan: vermeltona serie inctinada¢vermetbo 20 fando = boave rmsd nexium agar ft ferment 3, Airco ns superficie nelinada auc po fndo = a Iacose alcove form femmentadas,produrind Side as bolas pres to fund inear ferment com pcdogan de fda e258 4, Veemelno ea sper ineinag (arise nlo-fennenad) © veucl fnde (gcse fermetadn + eis) prsipitado $0 {5 produits ves encore fondo amafelo.Quase fos ‘Ge patheansendicos produce colores vermeha ma sper {Suinaiseanarla no undo, com ca sem HS lou Eases pore vermuho de sperie_vermetio nk superice wiSimda atarcio” "tiga, amarloimclinnda, anarclo no fandom no funda sem ‘no funde, rougio eS produgioJeH,S _prodaso de HS Carob? “Wieeta~ Fiona ‘Aiguras copies espewes de Girobacer de rottur Proteus ‘Ariana Controle da Quantidade de Oxigenio do Meio AAs hactrias aerdbias eanterSbis obigatériase as microaer fils necessitam de atengao especial para que sejam mantis as cconcentragdes-de oxigénio adequadas ao seu ereseimento, A Insiora ds aerbios obrigatéios obtém oxigéni sufciente do ‘aldo nutritive ouda supertcie do meio de dear solidificado, mas alguns preisam de mais. Os oxigenio 6 borbalhado através do tncio ou dentro do ambiente de incubsgo com fltros entre afte de gés ¢ 0 meio, pera impedir a contaminacio da cultura. Os tmiroaeflos podem srincubados em tubos de um meio nutrient, ‘ouem placas de agar em uma jarra na qual, antes de ser fecha, E scesa ua yela(~ Fig 620). Vela perfumadas ndo dover ser ‘sade, ps seus ons inibem o crescimentobacterano.) Avela fossa consome 0 oxigenio da jar e acrescentine cidkido de ‘carbone, Quando 0 dioxido de carbono apaga a chama. as ‘condigdes eso Stimas para o crescimento dos microrganismos! ‘que requerem pequenas quantidades de ddxido de carbono, ti ‘Somo a bactéla Neisseria gonorrhoeae, que causa gonomtia, Niio Snia de Casa sem Seu CO,! ‘As vaso tanspnte de epcimesdepacini pra Inkeratnio ¢roblensice- Os rpnisis no deve sex submetido cones seas, ema mao ob OC) ‘rina videtemente os manplaores ds espcimes ‘evem esar press de ines. Calas que psa ‘omer Nese gonorhoene, cas de pacientes com eno cama um problema dest ipo, ao propecionarem {nu aafra relates la de dino dcarbono. Exit stems comers ponies como JEMBEC (on E Marin Bilogical Enviromental haber) Este ‘Sterna cose es uma een lca ce lsc centendo ‘en seletvo eumns psa de carbon de soe do ‘co, A plac mocap 6 cio A plac ‘tio colada em uns boa pica, que fechas. “ide vind doi aretha ibrar id Se ‘Seton €oboda ua concentra propia eS 10%. A ‘Stine neutada de mide a pom wis do creciment> fntes do tanspre pars bri, Para cultivar os anaersbiosobrigatérios, tooo oxigénio mo- lecular deve ser removido e mantido fora do meio. A adigfo 20 meio de agentes que se liam a0 oxigenio, ais como o toglicol to, aminoicid cisteina ou osuleto desi, impede que 0 oxi- ‘Enio cause efeitos ticos aos anaerdbios. Os meios podem ser fisttbudos em ubos selados com tampas de osca e completa mente cheios, de modo a expat o ar, ou podem também ser dis ‘ebuldos em placas de Pe. Quando for necessio realizar cul ‘ras em placas para que o crescimento da coaia possaser est Pett ieries > Fig, 620 Cultura de anaerobes e microaerdos em Jarra com ‘ela. micoueriios est crcendo eos de eso sem plans Ue Pot cm ue ura sed, onde oma vela queso si ser apagada peloactimalade sido de carton a atnetera da ara Ua peur ‘atte deoxgénin snd permance. Apes de ete todo no set ‘sade angnente rao principal mao defer reser anaes, dado tlizam-se jars especias qu possam conter tanto placas {quanto tubos. As plscas de égar so incubadas em jarasseladas ‘contendosubstincias quimicas que remavem o oxigénio do ar © stam diéxido de carbono(~ Fig. 621). Culturas em camada ata dd dgar podem ser produaidas introduzindo.se uma agulha de inocula ecaberta de organismos em umitubo com meio de gar sélido. Em leboratrios onde os anaerdbios sto regularmente ‘manipula, liza-e-com frequéna uma cdrnarade anaerobise > Fig, 621 Incubadora de CO, Quando aivados, estes repens Gulnicosremoverao ongttio e so colocados juntos eulurs em Aine jarva laced praia una clara anaerSbica. Ete sistema € rum laboraticopegueno que porto apenas poueas placa a eer Ineubadasanerobicsnene ~ Vig. 622 Transferéacia anaersbie. Una grande clmara de ‘ransferéncia com veda de separ intndogao de equipement ‘ltrs com abemuas que pernitem 3 manipulo ds cultuns (> Fig. 622). 0 equipanento e as culturas slo intoduzidos na ‘mara através de um vedador de a, onic faz uso de vas scopladas para manipula a cultures, Manutenedo das Cultu Ua veeiolado, um organism pode ser mando indefinite sent em uma cara pur, cama cultura de estoque. Qua dose que eso ume imosira de uma cultura de esoque€ inoculada emma fesco. A cultura de estoque jamais € uli dem estos delaboratro. Entel, o organises ecu {ura de estogu passa pls (aes de cesimentoesgotan os tues escuula ree, como qusluer outa cutr A tsa que ela envelhece, os organisms poem duit foray estas ov ous carats alters, Asc deesoque ‘Soman prurndose subsumes sco anervalas frente, pr se mame ocresimento dos organs. ‘tio adequacdastsnicasassptcas € import aa ma sipulagho de ods as clus. As tenleas aspicas minim ™~ <= i am a possiblidade de as culturasserem contaminadas por or. tnismosvindos do ambiente impede que o organisms Decialmente os pat6genos, escapem pars 9 mio, Estas tenicas Sao especialmente importantes para fazer subculturs de cult fas de estogue, De outa forma, um organisa indesejével po era er inroduzdo, eo crganinmo de crtoque trade se eisolado Mesmo com transferénciasregulares de organismos de cltras de slo para mos esos, os organismos podem ster mutagdes (@rudangas no DNA) edesenvolver aracerfsicasalleradas Culturas Preservadas Para evita isco de contuminagao e redurt a taxa de muss, ‘os organismos decultras de estogue também devem ser maat dos em uma eultura preservada, ou sj, uma cultura ns qual (0s organismos sio mantidos em estado inativa, A tenica mais freqlentemente usada para preservar cultures é a liafizagdo (congelamento a seco), na qual a clus io rapidamente con seladas, desidratadas enquanto se congelam e lacradas em fr 0s sob vdcuo (Cap. 12). Estas eulturas podem ser mantidts 3 ‘emperatura ambiente indefiidamente Polo fato de os microrganisios frequentemente sofrerem rmudangas genetieas, sia mantidascultaras de referencia. Uma cultura de referéncia & una cultura preservada que mantém ‘0s organismos com as caracersticas cniginalmente defiridas ‘As culturas de referéncia de todas as espécies¢ variedades de buctérias conhecidas e de muitos outros microrgenismos estio aguardadas na Colegdo Americana de Culturas Tipicat (Amer ‘can Type Culture Colleton), emuizas também slo mantidas em, universidades ecentos de pesquiss. Assim, caso as cultura de éstoque em um laboratro especifco sofram mudansas, ou caso 7 "Pox que os endowpors no so consideradcs uma forma d reproduslo? Por que ato ae esperar a ooméncia de condiie Fig. 625 0 Sistema de Moltensaio por Enterotubagem (Enterotube Mulist System) 3) A remo de wna tampa cats permite que se bre" uma colds da superficie de uma place fo meico de nocelago¢ eno deslocado por todos os compatanenta, ocala assim cada um dels. 2) Apts ainoculago e a incubagio, os compaftinentos com resultados postivos slo marcados com um atere. OS iimeos so somos dene de ona, para dar um nimer indeadordefintv, que entific um organism na sta do masl de egos, (ousque estes cofirmatris necessrios So tambéem a estados. Numerando-t cad tate cn umn zona com um digital uma Ptncia de (1,2, 4, $e asim por dint) soma de qualquer conjunto de eager positivas rsa emu nice niraero, Una daa especie de enretanto, se codiicada por muitos almeros ferns que cope individuals dessa spi ido varia am pouco en sus crac outros laboratérios quciram obterdeteminados organinmos para estudo as cultuas de referénca esio sempre disponives Métodos de Realizar Multiplos Ensaios de Diagnéstico Muitslaboratris de diagnstico utiliza sistemas de cultura que cont um grande nimero de mcios diferencias seleivos, ais ‘como o Sistema de Multieastio por Enterotubagem (Entertube Multiest System) ouo Indice do Perfil Analiticn (Analytica! Pro Index — APD). Estes sistemas permite a eterminago sil. ‘nea da reagdo de um organism a uma varedade de meios de Aiagnsstico cuidadosamente excolhigos « partir de uma Gnie ‘noculagd. As vantagensdeses sistemas sia de que eles lizam [Pequenis quantidades de meios, ocupam pouco espago em na Incubadora e proporcionam um meio eficieate e coalsvel de ‘ager a perfeita denicago dos organiemos infeseioeos (0 Enterotube System € usado para ideniicar pat6genos entéticos ou organismos que causam doenyasintestinais como as febrestifbide e paratifide ashigelse, a gastrenterit ea: {guns ipos de envenenamentoslimentar. Os organisms causa dores so todos bastonetes Gram-negativs indistinguiveis uns dos outros sem testes bioguimicos. O Enterowube System com siste em um tubo com compartimentos, cada um contendo um ‘u mais meios diferentes, eum bastio inoculadocesteil > Fig. 6.234). Cada compartiment €inoculado quando a extremidade do bast toca uma collins obastio¢deslocado pelo tubo. Ap tubo serincubado por 24 horas 37°C, os estas de 15 testes boguimicos podem ser obtides observando-se (1) se fol pro zo gés€ (2) cor do meio em cada compartimento, Os estes Slo agrupados em conjuntos de és; dentro de cada grupo $80

You might also like