soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana AULAS PRATICAS DE BACTERIOLOGIA HUMANA. Mel cy Biosseguranga no Laboratério de Microbiologia Introdugdo Abiosseguranga abrange um conjunto de medidas que visam prevenir, controlar, migar e liminerriscos inerentes &s etvidades que possar inteferr ov comprameter s qualidade de vida, a sade humana e @ meio ambiente, Desta forma, a impleentagio de préticas adequadas no laborat6ro é primordial para evitaracidentes e garantira qualidade das atividades realizadas (MINISTERIO DA SAUDE, 2010), Boas Praticas Laboratoriais + Eindispenséivel o uso de avental nc laboratério O avental deve ser, de preferéncia, compride, com mangas compridas e estar abotoado. Removélo antes de debxar 0 laporatérie, + Sempre usar luvas, enquanto manipular amostras. Remon ‘oprocedimento estiver concluico las €lavar as més, quando Vestustio:calgas compridas e sapatos fe resistente), para impedir lesbes no caso de substinclas quimicas e materials bloigicos, ‘ados (idealmente de material no poroso e dentes corn materials perfurocortant + Cabelas comprides deve perrnanecer sempre presos ou com gorres para evitar Contato com rrateriais bioldgicos ou quimicos; Evitar user lentes de contato nos olhos em ambiente laboratorial, po's podem manter ‘agentes infecciosos na rnucose ocular + As unhas devem ser de preferéncia, curtas (o ideal € que ndo utranassem as pontas dos destos) + Evitaro uso de adomas como relégios, oias ou bjuterias e piercings, pois podem servir come depésitos para agentes infecciosos ou quimicos, +E proibi ingerir alimentos, beber ou fuer no laboratério; + Euitar levar as méos & boca, nariz,olhos, rosto au cabelo, no laboratéro + Uslizar na bancada sornente o material necesséirio a0 trabalho pratiee, come: roteito de ‘aula, papel ou caderno para anotagao e caneta, Material extra deixar nas prateletas abaixo das bancadas; + Prestar atenao &s stividades dos colegas ao lado, para evitar que materiais, incornpative's sejar manipulacos 0 mesmo tempo (exemple: alcool efogo) + Evita brineadeiras, dstragées e poder causar sérios acidentes; verses paralelas durante os procedimentos, pois + Em-caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, respingo de cultura etc) comunicarimediatamente o professor au 0 pessoal técnica responsével pela aula pratica nitpsfpublica.ciarufgbrlebooksiptsp/bacteriologia_humanalartigo_1.html 1130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana + Nao cheirar placas de cultura, a inalagdo de agentes microbianos pode resultar em infeogses: + Nao cheirar, ner provar substancia alguma; pois elaumas substéncies quando inaladas, ‘ou engolidas podem provocar queimaduras au lesées; + Descarte do material (1) materials contaminados devern ser colocados nos reciplentes prépros existentes nas laboratéros, (2) placas de Petr utlizadas devergo ser deixadas tampadas sobre a bancada; (3) iminas fornecidas pelos professores nara visualizagio overdo ser deixadas sobre a bancada e tubos com cukuras deverdo se” deixados nas estates + Terninados os trabalhos prticos: (1) lamba algas e fos ce platina; (2) verficar se as tormeiras de aqua gs estdo fechadas; (8) desligar impadias e microscépios; (4) mpar (0s microscépios e cobrHlos com a capa; (6) iar avental equardar (5) lavar cuidadosamente as méos; + As superficies de trabalho do laboratério dever ser descontaminadas ao final des atvidades e no final do dia, ‘Alavagem frequente das mos 6 uma atitude importante na prevengdo de contaminagdes. Dever ser lavedas sempre, apés 0 contato com amostras, apés a concluséo das praticas, ‘apés a remagio das Iwas, antes de deixar o laboratéro e antes de manipular comida ou bebida. Fnsaboar todos os derlos e ente eles, as castas das mos e os punhos e procure no tocar na toreira depois de lavar as mas, faa isso com um a tolha de papel Coloragao de Gram Introdugdo £m 1884, Hans Cristian Joaquim Gram observou que ae tratar bactérias com diferentes ‘corantes, eles acquiriar cores dstintas. Isso permitiy classified-les em dois grupos: as que se ccoravam de roxas, eto denominadias de Grarmpostivas, eas que se coravarn de rosa ou vermethas, charnadas de Gram-negativas. Fssa classificagao se efere As ciferengas da ccomposigio de parede celular, As bacteria Grar-negativas possuern uma fina carade de peptideoglicano e uma membrana externa composta por bicarnadaliidica, @ qual se solubiiza na presenga do élcoo-acetona (agente diferenciador), perdendo a coloragao do cristal violeta (corante priméric},adquirindo a caloragao sa ou verrnelho do corante secundério, safranina ou fucsina, Jé as bactérias Gram-positivas possuen uma espessa ccarnada de peptideoglicano e grandes quantidades de Acido teicbico, adquirem a coloraggo Violeta ou roxa pela casacidade er rete o corante priméria na presenga do agente iferenciador, conforre descrite na figura 1 (OPLUSTIL etal, 2004), tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 2130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana PAREDE CELULAR emo gu = ‘Figura 1. Esquemailstrasvo da estutra da prede celular de batriasgram-acgativase gram-positive, Fonte: aervo propio. Na técnica de Grarn, um esfregago & fxado na lamina pelo calor e coberto com um corante primar, geralmente o cristal violets, Apés urn minuto, o esfregago ¢lavado e em seguida ‘cobre-se alarnina com lugo, que age corno mordente (fxacor),fxanco o cristal violeta, Nessa ctapa tanto as bactérias Gram-negativas como as Gramt-positivas permanecem corn a coloragio violeta. Em seguida, a lmina élavada com uma solugéo de dlcookacetona a 95% Esta solugdo age como descolorante,retira o cristal violeta das bactéries Gram-egetvas € deixando-as incolores. Ands essa etapa o excesso do decal retitado e em seguida as bacterias so submetidas a0 corante secundério, podendo ser a fucsina ou safranina a 0,1 a 0.2%, A lamina é lavada, seca com papel ilo e observada ao microscépio 6plico, aplicar uma gote de dleo de imerséo e observat na objetva de imersdo (100X) (Figure 2) Objetivos + Compreendee aprender sobre ateniea de Grams + Visualizar as ciferentes morfologias entre as bactérias Gram-positvas e Grarr-negativas. Materiais + Alga de plate (becterioligica), + Alcoolacetona (descorante); + Bica de Bunsen; + Gristal-vioketa(corante): + Cultura de bactérias Gram-positvas e/ou cultura de bactérias Grarn-negativas + Fuesina ou Safranina (corante) + Laminas para microscopia + Laminulas, + Lugala 1% (merdent) + Microscépio éptic; + Geo de imerst, + Papel absorvente. htips:ifpublica car. uy briebooksiiptsplbacterologia_humanalartigo_ {html 3130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana Metodologia + Confecgio do estregage (colocar uma gota de salina sobre a mina, tocar com aka bacteriolégica a colénia igolada e espalhar na salina corn movimentos avais. Fixar corn calor, passando a lamina sobre chama de bico de Bunsen de? a 3 vezes até completa secagem do estregaco), + Cobrir com cristal violeta por 1 minuto. + Lavar com agua corrente, + Cobsr com Lugal1% por 1 rinuto; + Lavar com dgua corrente; ‘+ Aplicar o agente diferenciador dleool-acetona 95% por 10.8 20 segundos; + Lavar com agua corrente, + Cobrir com Fuesina ou Safranina (0.1 30.2%) por 30 segundos, + Lavar com agua corrente e secar com papelitro; ‘+ Observar ao ricrascépio éptico com abjetiva de imerso (100%) COLORACAO DE gue O |? \— 7.) © e je= », ¥ ¥ -— a_i | @ O20 Or | 6.xaminar a0 5.cobrir com fuscia 4. Aplicar sleoot mierosedpio fenleada ou satanina ae Figura 2 Btapas do procedimento da coloragio de Gram. Rome: acervo pri, Questées para Estudo 1. Na técnica de Grarn, qual soluedo 60 agente diferenciacor e qual é considerada rmordente? 2. Explique por que as bactéries Grer-negativas apresentam coloragao iferente das bactérias Grarm-positvas. Isolamento e Identificagao de Staphylococcus spp. Introdugao (0 género Staphylococcus possul esse norne por apresentar uma rnorfologia que se assemelha a cachos de uvas, embora possa apresentar autres formas, come eélulas tnicas, 1205 pares ou cadeias curtas. Séo coves Grer-positvos,isolados aos pares, traces, cadeias ccurtas ou cachos iregulares. A malaria dos estaflococos sao, iméveis, anaerdbios, facultativos, capazes de crescer em meios com altas cancentragbes de sal $do bactérias tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 4130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana meséflas(temperaturas entre 18 °C e 40°C) e ndo esporuladas. Colonizam a pele e mucosas de seres humanos e podem causar varios desfechos clinicas, como infecrdes de pele, ossos, tecidos moles, ato urindrio e infecgdes oportunsticas. Todos os estaflococes sao catalase positivo, entetanto, apenas 0 Staphylococcus aureus apresenta positvidade pare os testes de ‘coagulase e DNAse (MURRAY etal, 2003). Objetivos + Compreender os pasos para iolamento ea idntticagdo dos Staphylococcus spp + Visuaizar as possiveis formas apresentadas pelos estaflococos, Materiais + Acido cloridrico a 37% + Agar DNAse Agar manitol salgado (7.5% NaCl + Agar Mueller Hinton com discos de novobiocina contenda 5 pg: + Agar nutrient + Alga bacteriolégics + Amostra biolégiea (swab da nasofaringe); + Laminas laminas; + Peréxido de hidrogénio a 3% (10V); + Plasma, + Salina + Swab. Metodologia Para oisolamento de estaflococos sernear a amostra bicligica em égar manitol salgado, que 6 um meio seletivo eaitecencial & seetvidade do reo ocore pele alta concentragéo de cloreto de sécio (NaCl 7.5%) e €ciferencal pela mudanga de coloragio do meio de rosa para amarelo, ue ocorre apés 8 metabolizago do mantel pela bectéra. A degradagao do marital resultard na produgdo de dcido que ¢detectada pelo indicador de ph (vermetho de fenal) presente no meio, Staphylococcus sp cresce na concentragéo de NaCI7.5% e apenas 0 Staphylococcus aureus Ut epidermidis e S. saprophyticus cesce no égar manta, mas o meio continvaré com sus cor Ctginal(vermelno resado) e as colrias brancas;é . aureus, mudaré decor vermelhorosado para. o amareloe apresentaré colnias amaelas (Figura 3) Para real2agSo de provas adicionais para identicagso de espécies de Staphylococcus sp é necessério transfer as colérias do 6gar manitol slgado pare o dgarnutiente, pois o excesso de sal pode inererir os resultados '2 0 manitol como fonte de energ}a, Outras espécies como S. tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 5190soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana DIAGNOsTICO Exlafelecors MD ccmoce S cues C)= > bowenutmienre AGAR MANITOL SALGADO NEIOSELETIVO (73% Nac) E sas 810QUIMI DIFERENCIAL MANITOU) Peovas roca: Figura 3. Etapas de denifiesdo de StuphyTococeus spp. Fonte: cstv propio, ’As provas adicionais para identificagao de espécies de Staphylococcus sp so: Prova da catalase: se basea na decomposigo do perc de hidrogério era dgua e oxigéio, tendo ent formagée de gas (bolhas).Estaflocacos so catalase postive (Figura 4). feito pingardo uma gota de peréxid de hidrogenio a 3% em ura lena, e com um alga bacteriolégice err ums colénia do meio de cultura e encostar ne liina com movimentos circulates, bservando a forage ou nBo ce oés (volhas) Prova da coagulase: esse teste veiica se 0 microrganismo expressa a enzima coagulase. Os rmierorganismos que possuem essa enzima so capazes de coagularo plasma, par apresentar uma atividade semelhante & da protrombina, A coagulase pade ser encontrada de Stophylococcus sp mp © “ staPHYLococcus TESTE DESUSCETIBILIDADEA 4—= COAGULASE NECATIVA NevpstonmUR Staphylococcus RESISTENTE SENSIVEL, aureus Staphylococcus staphylococcus soprophyticus epidermidis Nase Figura 4 Proves bioguimica para identfcagdo de Staphylococcus spp. Fonte: acerv pri. Questées para Estudo 1. Bxlique por que o Agar Manito seletivo e diferencia 2, Por que o Agar Manito ica amarelo apés o cxescimento dos S, aureus? Isolamento e Identificagao de Streptococcus spp. Introdugao © género Streptococcus é composto por bactérias Gram-positvas, esféricas (coos), podem se apresentar em pares ou cadelas (diplococos). As colénias so discbides, mucéides, opacas ‘ou brihantes, Esses rierorganismos so considerados fastidiosos, pois exiger condigdes, cespeciais para o cultva, tals come reios enriquecidos com sangue ou sora, microaerafila e altas concentragées de didxido de carbono (capnoflice). Os estreptococos sao iméveis, nBo cesporulados, meséfilas e @ grande maioris anaer6bios facutalivos. Am disso $40 ‘fermentadores de carboidratas e anresentam perfilnegativo para o teste da catalase, liferenciando-os dos Staphylococcus (MURRAY etal, 2009). “Tratarse de importantes patdgenos hurnanos, com diferentes espécies dentro do grupo, sendo responsdivel por diversas patologias, como fascilte necrosante (gangrena estreptocécica), impetigo, escaratin,erisipela sincrome do choque téxico estreptocécico centre outras. Ha ts formas de diferenciar eclassitioar as bactérias desse género. A primeira 4 por propriedades sorol6gicas que s30 0s grupos de Lancefield, apresenta uma classiicag3o tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 7130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana de Aaté W. A segunda é por perl hemaltico (hemélise), podendo ser hemélise completa (beta-8), hemdlise incormpleta (alfa-a) e auséncia de hemélise (garna~y). Ea terceita lassificagdo se baseia em caractersticas bioqutmicas (MURRAY etal, 2009}. Objetivos + olor icentfiarbactras do géneroEareptococcue + Visualizar as possheis formas apresentadas pelos estreptococes. Materiais + Agar sangue; ‘+ Amostra a ser analisada (swab de orofaringe), + Antibidticos: bacitracina (0,004 v) € optoquina + Peréxido de hidrogénio a 3%, Metodologia ‘Semear a amastra em agar sangue e picotar 0 meva para prapiciar um ambiente rricroaeréfila, incubar por 24 a 48 horas a 37 *C. Logo apés realizar a prova da catalase, que tem corn principio avalar a presenca da enzime através de decomposigdo do peréxido de hidrogénio em dgua e oxigénio (fornagSo de bothas). Estreatococos é catalase negative. Em relago ao padro hemoltico, as bactérias podern comportar como fehemaltcas, _apresentando herndlise total das células sanguineas (halo claro ao redor das coldnias). © padrdo «sero ,spresenta hemdlise parcial e forma-se um halo esverdeado 20 redor das ccelénias, enquanto o y-hemoliice nao apresenta perfilde hemlise ‘Acespécie Streptococcus pyogenes, apresenta um pert fehemolitice ea confirago pode ser realizada através do teste de sensibildade a bacttracina, Jd S. pneumoniae, apresenta um perf de athemdlise e so sensiveis a optoquina, O perfil yhemélse é sugestivo de. faecalis ‘Figura 5). tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 8130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana Strplococesy spp AGAR SANGUE Z \ caTatase (= a-hemelise Behemolise Sugestivo de J Sugestivo de SS pneumoniae S. pyogenes SeNsiVELA SeNsivELA OFTOQUINA BACITRACINA [Figura 5. Esquema e identiicasio de Speptococeus spp. Fonte: acevo prépro Questées para Estudo 1. Classifique o perfl de hemélise das bactérias crescidas em gar sangue. 2, Qualonore de encima que confere# propriedade hemoltica aos Streptococcus pyogenes? Hemocultura Introdugao Hemocullura é definida core @ pesquisa de microrganismos patagénicos no sangue, ullizando meios de cultura especticos. A pesquisa de mictorganismo é indicads quando se suspeita de endocardite, sepse, infecgSes hospitalares, febre de origem ndo definida, infecgdes er pacientes imunodepximidos, meningites, pneumonias graves e bacteremia {OPLUSTIL et, 2004), ‘bacteremia ¢ definida como a presenga de bacteria na corrente sanguinea e pode ser INcuBAR 521°C J Om FRASCO DE HEMOCULTURA, ey ESTUFA35 21°C SEMEAR EM AS GRAM" —> FSTUPASS © Jo I—— seMear EM AS GRAM* EMITIR RESULTADO Lo PARCIAL ESTUFA35 21°C EM coz r DDENTIICAGROE IO x TESTE DA AVALIAGAO DA SEMEARUMA RESISTENCIAS AOS. Cora Em cHoc ANTIMICROBIANOS ® Bo aancos: eo 4 INCUBAR 30°C + TODIAS Figura 6, Processamento de hemocultras por metodlogiaconvensinal. *Na presenga de coesbacios ‘Gram-negativos semear também em CHOC; **auscia de cressimento no AS elou CHOC, com presenga de RESULTADO NECATIVO DESPREZAR © FRASCO tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 10130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana ‘bctcas no Gram, procedersemeadura cm snaerobiose; ***reultadospreliminaes das hemocultras snegatvasepostvasdevem ser emitdas aps 24 horas. AS=dga-sangue; CHOC dgar-hocolae, Fonte: ‘OPLUSTIL, 2010, p. 131. Imager adapada ‘Metodologias automatizad: ‘metodologia manual, menores chances de contaminagsio da armostra, Hé cversos aparethos ‘utomatizados para a realizacao dessas metodologias automatizadas (QPLUSTIL et al, 2004) (Figura 7) presentam maior eficiéncla erapidez em relagso & ETAPAS INCUBAR 5 21°C EM coz et \ ® st ct ot i i Ee Ss Ss resuitapo“reasco L i! L _— REINCUBAR — SEMEAREM IDENTICARE ayn e ‘Figura 7, Procedimente para hemocultura por metodolopias sutomatizadas.*Na presenga de bacilos gram- negatives, smear também em gar MacConkey; AS ~ ga-singue; CHOC ~ Sgarchocolte, Fonte: ‘OPLUSTIL, 2010, p. 133. Imager sdaptads Questées para Estudo 1. Diferencie bacteremia transitriainterritente e continua, 2. Qua's as principais espécies contarninantes das hemoculturas? Isolamento e Identificagao de Enterococcus spp. Introdugao O género Enterococcus (cocos entéricos) apresenta mais de 25 especies, dentre essas ‘espécies Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium so as mais importantes como patégenos humano. Enterococcus apresenta morfologia esférica (cocos) aos pares ou ccadeiss curtas. SE0 microrganismos imdveis (embore alguns possam epresentar mobildade), 1ndo esporulados, anaersbios faculativos. Apresentam crescimento com arnpla faixa de Temperatura, de 10°C a 45 *C, podem sobreviver em temperaturas de alé 60°C, além disso crescem em ampla faixa de pH suportam elevada presséo asmética, As colénias podem apresentarperfilhermoltico, sendo achemolhicas, f-hemolticas ou -herolticas. Sao capazes ‘ée oresce’ na presenga de concentragaes elevadas de NaCle sais billares, essas caracterstices sdo utlizadas para distinguir enterococos de outros cocos Grarn-positives ‘catalase negativos (MURRAY et al, 2008), Objetivos tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 11730soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana + Isolare identiiear bactérias do género Enterococcus, Materiais + Agar bile eseuina + Agar sangue; + Aga bacterclégica + aldo de NaCl 65% + Lamina + Peréxido de hidrogénio. Metodologia (0s enterococos apresentam crescirnento rapido em meios ndo seletivos, como gar sanguee chocolate. Apés 0 cutive da bactéria em agar sangue ou chocolate, c repique deve ser realizado em reios seletivos ¢ diferencias, no intuito de obter 0 diagnéstico confirnatério ‘© melo de cultura utlizado para isolar enterococos é 0 agar bile esculina, caldo NaCl 65% e pUrpura de bromocresol. Este égar tern a colorag inicial esverdeada e quando pasitvo (crescimento de enterococos) fica enegrecido. Em caldo NaCl 6,5% o crescimento da bacteria ‘causa tubidez. 0 purpura de bromocresol é feito em um tubo contendo glicose violet, com ccoloragio inicial purpura e quando a bacteria ferrenta fica amarelo (Figura 8) DIAGNOSTICO AGAR SANGUE PURPURA DE Acar [BROMOCRESOL BILE-ESCULINA CALDONACI 65% “@@ 0 tt 05 PURPURA AMARELO ESVERDEADO ENECRECIDO LIMPIDO TURVO ‘Fgura 8 Esquema de identiicagio de Emerococcus sp, Fonte: OPLUSTIL, 201, p. 133. Imagem adepiada, Questées para Estudo tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 12130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana 1. Quais as caracteristicas que distinguer os enterococos dos demais cocos Gram positive e catalase negativo. 2. Porque 0 4gar bileesculina alte a sua colorado na cultura de enterococos? Urocultura Introdugao Essa técnies tem como o principio © isolamento, icentificagao e quantiicagao de bactérias presentes na wrina. A urocutura deve ser realizada quando ha suspelta de infeceao co trato urinario, As principals bactérias causadoras de infecgso do trato urindrio so: enterobactérias ‘como, Escherichia col, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp. e cocos Gram-positives come Stashylococcus spp. e Enteracoceus spp. Nesse tino de infecgae geralmente epresenta grandes quantidades de leucécitos na arnostra(pidria). Para o diagnéstico & preciso analisar tanto 2 quantidade elevade de leucdcitos come a presenga de bactérias na amostra {bacterdra) (OPLUSTIL, etal, 2004), Objetivos + Compreendes os princpios a éerca de urocltura + Descrever as bactérias mais frequentes encontradas nas infecgdes urinarias, Materiais + Alges caloradas; + Amostra de urna, preferencialmente de jato médio,e em situagées especiicas pode utilizar urna ce prime'ro jato, urna de paciente com sonda vesical e urina coletada por pungdo suprapubica + Meios de culture (MacConkey e Cled) Metodologia Antes da coleta da amostra é necessério fazer a correta higlenizagio do local. 0 material clinico para realizar essa cultura deve ser a rina ato médio e antes da antisioticaterapia em frasco esteriizado, 0 transporte deve ocorrerna temperatura de 20°C a25*Ceo processamento realizado em até dues horas, Se néo for possivel processar nesse perfado a _amostra deve ser refrigerada 2 °C a 8 °C par ro mximo 24 horas. 0 dcido bérico pode ser utilzado quanda se deseja conservar etransportar as amostras em temperatura amiblente por at6 24 horas, Para realizar a cultura & recomendado urn volume de 2 mle para uransilse um volurne de 10 mb ‘A micrascopia é reslizade a partir da coloragao de Grarn, sendo necessério homogeneizar a “amostra sem centrfugar, ern seguisa colecar 10 pL da urina ern urna lamina, sem espathar {hxar pelo calor e proceder com a coloragsio. Apés analisar no microscdpio, o resultado é reportado através do ndimero de microrganismos encontrados, podendo ser raros,elguns ou ‘Aclture pode ser realizada de duas formas, por meio de semeadure semiquantitative em placa elarina-cultvo, tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 13930soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana ‘Semeadura semiquantitativa em placa: 1. Homogenetzar a amostra sem centrfugar: 2. imergir a alga calbrada de 0,01 ml. 040,001 mina urna na vertical 3. Semear quanttativamente er placa com agar MacConkey e Cec; 4. Incubar em temperatures entre 94°C € 36°C por 18.2 24 horas; 5, Fazer@ letura relacionar com a microscopia Interpretacao: + Grescimento com alga de 0001 mi ou 1 pl. (1:1000) ~ 1 cola = 1000 ou 108 UFC. + Crescimento com alga de 0.01 ml. ou 10 pl (1100) ‘colénia = 100 ou 102 UFC/EnL. ‘Como reportar o resultado: = UECIL; + Informar 0 método utilzado na caleta de urna + Emcaso de duvide + repeti + Cultura negativ Wo houve erescimento de mierorgansmos, + Cultura positiva = 100.000 UFC/mL de. cal Questées para Estudo 1. Quais os princioais agentes etioldgicos de infecgdes co trato urinario? 2, Por que a cultura deve ser realzada com a primeira urina da mana e de jato métio? Anaerdbios Introdugao Cultura em anaerobiose ¢ real zada com microrganismos capazes de sobreviver e de ‘multiplicer na auséncia de oxigénio. Os pricipais microrganismos causadores de infecgées anaerdbicas S40: Bacteroides do grupo fragilis, Peptostreptocaccus, bacilos Gramnegativos, (Prevotala spp. e Porphyromonas spp.) e fusobactérias. Essas bactérias podem causar infecgdes como, apendicite, bacteremia tite média sinuste e infecgdes pos-cirirgicas {OPLUSTIL et al, 2004). ‘Ainfeodo par anaerdbios tem algumas caractetisticas como odor fético, rénulos de enxcfre, presenga de gas, cor vermetho toto e necrose (OPLUSTIL et al, 2004), Objetivos + Isolere identificar microrganismos anaetébios, Materiais tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 1430soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana + Amostradlnic: + Camara de anaerobiose; ‘+ Meios de cultura, Metodologia (0 material elinico adequado para esse tipo de cultura é uma amostra aspirada com agulha e setinga ou fragmentos de tecido infectado. A coleta deve ser feta antes do uso de antrnicroblanas. © transporte deve ser realizado em no méximo 2 horas apés a coleta e em Temperatura ambiente, Algumas amostras como swab de orofaringe, nasofaringe, gengwa @ material de ferida superficial no so aceltaves, 0 diegnéstico de bactérias anaerdbias é realizado pelo exame macroscépico,exame miaroscépice e cultura, + Exame macroscépico da amostra: Algumnas caracteristicas so: odor fétido, presenga de 1985, cor vermehno-tjolo apés exposigao a luz ultravioleta, qrdnulos de ernotre e presenga + Exame microscépico da amostra: ¢ utllzaca a coloragao de Gram, evidenciando algumas caracteristicas particulares de cada microrganisno: «© Bacilos Grarr-negativos com presenga de esporos ~ sugestive de Clostridium so © Bacilos Grarn-positvos largos, sem presenga de esporas ~ sugestivo de Clostridium perfringens © Cocobacilos Gram-negativos ~ sugestivo de Prevotelle ou Porphyramonas; «© Bacilos Grarm-negativos finos com extrernidades afiladas ~ sugestivo de Fusobacterium spp. © Cocos grarmnegativos pequenos ~ sugestivo de Veillnella spp. + Preparo do material einoculagae nos melos de cultura 1. Amostras purulentas ~ hemogeneizar o material para assegurar uma distibuigso adequada dos microrganismnos e semear er placas ou em frasco de hemocuttura anaerétio, 2. Amostras de tecido ~trturar @ amostra em aproximadamente 1 mL de meio liguido toglicolata (THIO) anaerébio e inocular em placas eno caldo THIO. anaerébia; 8. Amostra de iquidos orgénicos ~ semear em placas e em caldo THIO anaerébio ou em frasco de hemoculure anaer6bia, 4 Medula éssea — deve ser inooulada ciretamente em frasco de hemocukura anaerébiay + Jarra de anaerobiose ~ Trel2-se de uma jar de acrlico com lampa de fechamento hermético, Para a formago de uma atmosfera de anaerobiase utllze-se um gerador de C0,, cue poder ser um envelope ou uma placa pldstica. Em sala de aula, utilza-se uma vela para consumir todo 0 oxigénio e fornecer um ambiente anaerdbico (Figura 9). tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 15130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana CULTURA @ eM Poy aanaave So — Sule ME Sem an i [Figura 9 Thastragio de Jarra de Anacrobiose ede Cimara de Anserobose, Fonte: Acervo proprio Questées para Estudo 1 Por que o oxigénio életal para as bactérias anaerdbias estas? 2. O que exolica 2 maior frequéncia de infecgdes causadas por enaerdbios estritos erm relagdo @ aersbios e ancerdbios facultatvos? Leitura de Laminas de Ziehl-Neelsen Introdugao © género Mycobacterium compreence haciles aerébios, iméveis, nda formadores de espores. ‘A parede celular desses microrganismos é complexa erica em lpidias, o que torna a superficie hidrofébica. Esse género 6 resistente a sclugdes dcldas descorantes, apresenta crescimento lento (cerca de 8 semanas para detectar em cultures), s8o resistentes a detergentes ea alguns antibidticos (MURRAY et al. 2009). ‘Accoloragao de Ziehi/Neelsen baseia-se na supracitaca capacidade das micobactérias resister a solugées dcidas descorantes éevido & composicao altamente lsiica da parede cellar. Senco assim, epés um processe de coloragdo especial, a quent, uma vez coradias, no sofrem aco de descorantes fortes, como a solugao de dlecoFcico, Deste modo, a fuesina de Zieh! cora todas as bactérias de vermelho e apés a descoloragio com lecabcido, somente os baclos élcool cdo resistentes (B.A.A.R) conservarso esta cor, Em seguida cora- s€ 0 fundo com azul de metileno, riando um contraste nitide entre elementos celulares € coutras bactérias (azuis) e 0s BAAR (vermelnos) (Figura 10). tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 16130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana LAMINA sacTERAS D0 GENERO _Mycabacteru spe. CORAM SE DE VERMELAO cess ‘comm. se De [Figura 10. Micoscopiademonstando mina de Zich-Neclen, Fonte: Acervo pri. Objetivos + Compreendeso princiio da coloragae de Zieh Neeaen + Analser a léming e verficar a presenica ou ndo de micobactéries. Materiais + Alcoobeido a 1%, ‘+ Amostra clinica (secregdes do trato respratério inferior, biépsias,tecdos, lquidos em cgeral e fezes) + Azulde metileno a 10% Fucsina de Zich/-Neelsen; + Glee de imerséo, Metodologia ++ Prepare do esfregace (espalher @ amastra com alga bacterilégica sobre alémina e fixar ‘com calor, passando sobre chama do bico de Bunsen de 2a 3 vezes até complete secagem do esfrega¢o} + Fixer pelo calor Coosr com fucsina de Zieh, + Aquecer @ part inferior da lamin, até emissio de vapores; + Lavar com agua corente; + Coariro esfregaco com dlecoldcido 1% dear por 1 minuto + Lavar com agus corente: + Gobir com azul de metlena 10% e deixar por 2-minutos; + Lavarcom dgua corrente + Secar ‘+ Observar ao microscépio 6ptico com objetiva de imerséo (100%) (Figura 11). tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 17130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana COLORAGAO DE Zichl-Necbser O |? |u| 21 © * eo 5 20 -_ <_ § +(e |>—_ [Figura 11. Ftapas da colorado de Zichl-Neclsen, Fomte: Accev pei, Questées para Estudo 1. Bxokque detahadamente a composigao ca parede celular das rnicobactérias. 2, Por que as micabactérias resistem aos métodos de colorago comuns? Coprocultura Introdugdo A coprocultura¢ 0 exarme mais utilzado pera a pesquisa de agentes becterianas em fezes. Os, principals géneros bacterianos relacionados com as gastroenterites incluern Salmonella, ‘Shigella, Escherichia, Staphylococcus, Aeromanas, Plesiomanas, Yersinia e Campylobacter. ‘Apesar da sua sensibildade, esse teste apresenta diversas limitagdes, principalmente relacionada a forma de coleta da amostra, As fezes devern ser colhidas na fase aguds (Giarréicas), em frascos estére's au ern swabs cor meio de transporte contendo conservante cespecifica (Cary-Blat). As fezes devem ser encaminhadas ao laboratro, preferencialmente ‘até dues horas apds a coleta, na presenga de conservante em temperatura ambiente, A amastra permanece estavel por até 48 horas se conservada no meio de transporte (Carry Blait), sob refrigera C). 0 uso prévio de antibiéticos ou artidiaréicos tamiaém pode interferirna coprocultura. Na rnaloria dos laboratérios clinicas so utiizados meios de cultwo seletivos para pesquisa de Salmonella, Shigella, Escherichia, Staphylococcus, Aeromonas e esiomonas. & pesquisa de Yersinia e Campylobacter é realizada apenas quando ocotre a solcitagdo especifica pelo prfissional. Este procedimento pode impactar na sensibildade da ccoprocultura, devide a grande incidéncia de Campylobacter associada a processos 4gastroentéricos (FILHO, 2073). Objetivos + Entender a finalidade da coprocultra + Identifier as princinais bactéras isoladas, tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 18130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana Materiais + mostra clinic: + Conservantes (Glicevina tampenada ou Cary-Bla’) “+ Melos de cukura Metodologia Meios de transporte: + Salina gicerinads e tamponada ¢ incicada pera Salmonella Shigela ‘+ Cary Blair indicado pare todos os patégenos bacterianos intestinals, exceto Shigella + Fezes e asairados gastrointestinals podem ser transportados sob retigeragao ern ‘rascos estéres ebiépsias padem ser conse-vadas com um pouce de salina en frasco até Rotina recomendada (quando nao houver especifico): ‘Salmonella, Shigella, Aeremonas, Pesiomonas, Yersinia: poder ser isolados em Mac Conkey e Salmonell- Shigella. Recomenda-se também inclur a cukura para Campylobacter, cue exige meio espectico, No caso de fezes com sangue, pesquisar EHEC (€ coll entero-hemarrigica), Em coprocuttura de criangas até 1 ano de idade considera-se rotina 8 pesquisa de Salmonela, higelia, EPEC (E. col enteropatogénica), EIEC (E. cof entercinvasora) & EHEC. Deverse inclur também a pesquisa de Yersinia enterocoltca, Aeromonas e Presiomonas Caracteristicas de alguns meios sélidos: + Agar MacConkey e Agar Easin Metilene Blue (EMB) so reios diferencisis, mes no seletivos entre os Gram negativos entérioos + 0 Agar Salmonella-Shigella funciona bem para Salmonella, mas pode inbir Shigella, +O Agar xlosetisina-desoxicolato (XL) é recomendado para Salmonella e Shigella, ‘mesmo as mais exigentes. ‘+ Agar Hextoen entérico (HE) é adequado pare Salmonella e Shigella + Agar verde brihante (VB) é seletive para Salmonella sp,rnas ndo é indicado para Salmonella typhi e S. paratyphi + Agar sulta de bisrnuto (Wilson & Blt) é seletivo para Salmonella, Caldos de enriquecimento: Indicado para detectar baixo niimero de Salmonella ou Campylobacter em portadores, Multos laboratérios estdo abanconando o uso de caldos de enriquecimento pela balxa recuperagéo «de patégenos + Caldo GN (Grarn Negative} -enriquecirento de Semonellae Shigelo spp. + Caldo Selento F- prineipalmente Salmonella spp. + Caldo tetvationato - apenas algumas esnécies de Salmonella spp. e exclu S. typhi tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 19130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana + Campytioglicolata- apenas para pesquisa de portadores de C. jejuni + Salina fosfatada e temponada pH 7,6 - para semear fezes e conservar em geladeira por {1és semanas para pesquisa de portadores de Yersinia enterocolitica, mas né indicado para rotina ‘QUADRO 1 - PROCEDIMENTOS GERAIS PARA © ISOLAMENTO DOS PRINCIPAIS AGENTES BACTERIANOS DEINFECGAO INTESTINAL USO DE CALDOS DE ENRIQUECIMENTO E FACULTATIVO, FONTE: LEVY (2004). Bactéra todo En ere Cetus gat of Camsyobacter cor Ineubacas em gato Came Suplerentos de anbiéticas como o melo de Skrow (Camnay-BAP (Blaser, t= Camoyobaces c jane ambiente No Trieroaerstlo 9.42 te senenchia coh 24.48 n aerobiose, ‘gar Maccockey ou Agar Enteropatoginca 353700 No coun ariae meters Ecol ‘gar derencit Agar nhemanigcs — 24 DaeEbON ay Magcorey srr (MAC) Ors7Hreouttes Ov Agar ac Coney. ‘Agar Salerelir Shigella, SelentoF% Caldo —Aiaccorkey ou Agar alose- 24-48 nacrobiose, Sclentor Call assrec . Isin-esoniolst ou ° ‘gar Hektoen entero (HE). ro choleoe V2 naerobioss,Agsapeotonade Ager TOSS cresoe em Mac prahaemojneus 356706 aksinnpere4 Corky Sainagicerineds Agar Salmarete Sigel vera eveocoten sargorade “5°Cor Agar Mactorieyemen {régseranas "do" Seo. Agr ots tecemendde. gaan rover Questées para Estudo 1. Quais 25 Imitagdes da coprocultura? 2, Por que o égar Salmonelle- Shigella € um rio seletvo e diferencia? Isolamento de Enterobactérias Introdugdo ‘A famila Enterobacteriaceae compreende um vasto grupo heterogéneo de bactérias de grande importancia médica. Sao bastonetes ou cocobacilos Grarnegatives, dstibuidos _amplarmente pela natureza (ubiquos)e fazern parte da microbiota normal da maioria dos animais, inclusive do hornem, Pade causar diversas doengas ern humanas, como diarrela, pneumonia, infeceso do trato urinéro (ITU), infecgSo do trato respratéro (TR), bactererias, -meningite e dentre outras. Aoresentarn matiidage variével, anaerébios facultativos e nao esporulados. Sto posttivas para teste da catalase, fermentam a glcase com ou sem produgdo de gis, s80 oxidase negativos,reduzern nitro anitrato, possuer exigéncias nutricionais simples, crescem de forma satisfatéria em meios seletivos endo seletivos. Sdo bactérias resistentes a sais bliares ‘@apresentarn na parede celular sey principal antigeno, o lipopalissacarideo (LPS), que é ‘composto por ts partes: antigeno 0 (mals externo), un cerne polissacarideo (mais central) 0 lipideo A (mais interno) e com atividade de endotoxina (MURRAY et al, 2009} tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 20130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana Objetivos Realizar igolamente e a ciferenciago entre as espécies de Enterobactérias; Compreender os princfpios dos meios de cultura e as testes bioquimicos utlizados. Materiais Agar Citrato de Simmons (CITRATO), ‘Agar Fenilalanina (FA); ‘Agar MacConkey, ‘Agar Sulfeto de Hidrogénio, Indol e Motiiade (SIM), Agar Triplice-Ferso (TAF); Alga bacteriolégics; Amostra de col6nias 'soladas de enterobactérias, Bico de Bunsen; aldo Ureia de Stuart (UREIA); aldo Vermelho de Metis (VM) Metodologia ‘Agar MacConkey: melo seletivo para Enterobacérias é composto porlactose, sais bllares © cristal violeta. © meio édiferenc’al pela presenga da lactose e seletiva pela presenga dos sais, bilares e cristal violeta, que so inibidores de Grarr-positivas. As bactéias lactose positvas. crescem no gar com a coloragio das colénias rose ou vermelha,jé as lctoses negativas ficam com 2s colfnias incolores, uma vez que ndo fermentam a lactose e sim a peptona, ‘convertendova ern arnénia (Figura 12} a cokeyy (eatsouanese CRISTAL VIOLETA) (CRAM NECATVAS ‘CRAM POSTIVAS (enesciveNto) (Sem CRESCIMENTO) DIFERENCIAL ‘WAcrose) (ovoNiAs ROSASLASOU (colSnias NcoLoRES) ‘Figura 12, bolameato de enterobactvias no Agar MacConkey. Fonte: Acero pprio. Agar Triple ‘meio possulIndicador de pH vermetho de fenol que ern rneio cide muca sua coloragdo de vermelho para ararelo, ou se, se bacteria fermentar algum dos aqucares o meio tern sua ccoloragio alterada, Por meio deste proved mento podem ser avaliados trés pardmetros: tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! Fro (TAF): rmeio composto por trés spucares: lactose, sacarose egcose. Este 21130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana ‘ermentagio de carboidratos, produgo de sulfeto de hidrogénio (meio flea enegrecido) € produedo de gis (forma-se espace no tubo). Par convene letura da prova é reaizada do pice para a base, A= deido, K alealino (Figura 13). AGAR vx iplice- her? (ko FeRMeNTADoR) LACTOSE E SACAROSE a (FERMENTA APENAS cicose cuicose) Ala (FERMENTAOS SCARBOIDRATOS) Figura 13, Esquema ilustrativo do Agar Tsplce-Ferr (TAF), Fonte: Acervo pri, ‘Agar Sulfeto de Hidrogénio, Indol e Motilidade (SIM): elo ser-sélido que permite avallar se a bactéria sintetiza a enzime triptofanese, Esta enzirma sinttizada pela bacteria é capac de ‘metabalizaro tiptafano em indal, que é evidenciado pela forrmago de um anel verretho apés ‘a.aciggo do reativo de KOVACS, Este procedimento possibita também verificar a produgSo de sulfeto de hid-ogénio (meio fica corn coloragio enegrecida) e 2 motlidade (turbidez) (Figure 14) AGAR Has Sulfele de Hheoge™ ee Judol ¢ idee @ ii-i- Figura 14, Esquema iusto do Agae Suleto de Iidrogénio, Indole Motiidae. Romte: Acervo pri, ‘Agar citrato de Simmons (CITRATO): cio utlzado para identticagao de bactéras que Lllizam o citrato com dna fonte de carbon, 0 meio tem a coloragao incial verde, se @ bactéria metabolizar o citato presente no meio, ele card azul devo ao indicador azul de bromotimol. A mudanga de cor ocorte pela alelnizagao do meio (Figura 19) tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 22130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana Renn Cavite de Semnes vane — Positive 4 j (MEIO ALCALINO) nko VERDE METABOLIZA ‘crTRATO NECATIVO, = (E10 NEUTRO) VERDE [Figura 15. Eaguomailustativo do Agar Cita de Simmons. Fonte: Acrvo proprio CCaldo Ureia de Stuart (UREIA): esse meio € utlizado para avalia se @ bactéra é produtora de cenzima urease. 4 urea presente no meio é degradada pela erzima urease em duas moléculas de aménva, A aménia forrada alcaliniza 0 meio e oindicador de pH, vermelho de fen presente no meio, se torna rosa pH. Orighnalmente o meio tem @ cor mbar e apés a alealinizagao se tora rosa (Figura 16) (BIO ALCALINO) cA me ve de Stud excrésian00Uz [—] pono Urveiw UREASE = BACTERIA NAO pRoDUZ AMBAR UREASE Necarivo — (E10 AciD0) AMBAR Figura 16, Esqemsiustsivo do Cali Urs de Star, Fonte: Acero prio ‘gar Fenilalanina (FA): rio uilizado para ifereniagio de baclos entrcos quanto 8 ccapacidade de produrr cco fenpirivic a partir da cesaminacéo ¢a fenlslanina por ago cenzimdtica. O melo incalore se os baclosentércos forem FApasttives, 0 meio apresentard uma coloragdo esvercieada na supece apés a acigdo do cloreto fério (Figura 17). tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 23130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana sulla GAR Fesilalarien — 5 ee A vee IncotoR > oth nowve DESAMINAGAO} Caldo Vermelho de Metila (VM): teste pare idenificar espécies bacterianas fortes, fermentadoras a partir da gcose. 0 meio tema cor nical amarelo, se a bactéra for uma forte produtara de dcidos ficard vermelho, er fungdo da presenga do indicador de pH vvermelho de metila © ponto de viragem deste meio 66 pH 44 (Figure 18), caLpo de medida osivo Voonelhe ones) venmewo A 2 samnneto [Figura 18, Exquema iusirativo do Calo Vere de Matis, Fonte: Acervo pri, Questées para Estudo 1. Exalique por que o Ager MacConkey ¢seletivo e diferencial? 2, Explique o principio dos reios utlizados para identiicagao das enterobactéria. Identificagado de Pseudomonas spp. Introdugdo (0 género Pseudomonas leva esse nome pois estdo dispostas ern pares de células que lembram uma Unica oélua, Apresentam positvidade pera o teste da oxidase, so méve's & tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 2430soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana possuem exigéncias nutrcionals minimas, Séo microrganismos Gram-negativas, ubiauos, ‘acrébios,toleram variagdes ambientaise crescer em temnperaturas cue variam de 4*C.a 42 *C, Possul inueros fatores de viruléncia, come toxinas (exoroxina Ae S), enzimas (elastase, protease, fosfoipase C),alginato e una cépsule de polissacarideos. Algumas cepas podem produzir pigmentos difusiveis como pioverdina e piocianina (MURRAY et al, 2009), Objetivos ‘+ Realizaroisolamente ¢ identficagao de Pseudomonas, Materiais + Bactéra a ser isolade; + Meios de cultura, Metodologia © primetro passe éa coloragéo por Gram. Utlize-se também o meio OF (melo para oxidacdo e fermentago), que serve para avai a oxidacSo ou fermentacSo por parte da bacteria. Tern ‘come cor rignalo verde com incicacor de pH azul de brornotimale pode adquiiras coloragbes: amarelada se a bacteria ealzaroxidagdo (melo acid), colorado azulaga (melo alcalino} ou néo ter ateragso de cor (meio neutr). Na presenga de Pseudomonas © topo do tubo fica amarelo, mostrando que howve accificagéo do meio por oxidacso, eo resto do tubo cortinua com a cor erginal 0 Cald Ureia de Stuart (Urea), presenta coloragéo incl amarelada, se a bactéria produzira enzima uiease, esta hidrolisa aurea em dus moléculas ¢e oménia,o meio fies alain e observace 8 mudenca psra a cor rosa. A Pseudomonas; nesse meio, presenta coleragdo amareada, pois ndo é uma bactéiaprodutora ce urease. 0 ‘gar Suet de Hirogér, Indole Malidade (SIM), com colragéoinicial amarelada,avalia se-bactris tem a capacidade de metabolizartriptofeno em idol, sendo evidenciado a formagéo de um anelvermeho apés aacipdo do reatvo de KOVACS, No SIM também é vertieado se a bactéria produ sulfeto de hidrogénio meio fica enegrecido) e a motiidade {turbider). A Pseudomonas apresenta matéade, por este motivo 0 melo fica turvo;ndo produ suleto de hirogénio, portante# colorag0 nical do meio no se altera.Além cisso, 8 bactria ndo metabolzaotriptofeno, no tendo oss a formagSo de ndol(anel vernetho} ‘So bactérias DNAse negativas. 0 Calo Tioglolata avalia 0 erescimento de microrganismos aerébios, anaerdbios facultativos e microaerfilos. Nesse caldo éadicionad a resazurina, um indicador de presenga de oxigénio, ue é observada pela cor rosa na parte superior co tubo {Contato com o oxigéia).Bactérias erSbias crescern na sunerfcie co mei, bactéras anaerdbias exescem no func do caldoe bactrias microaetélas exescem entre o rreie mais ‘xigenatio ¢ 0 menos, Gomo Pseudomonas so microrganismos aerébios eles evidenciam um crescimentona superficie do Celdo, epresentando turbdez (OPLUSTIL, eta, 2004). Para Pseudomonas aeruginosa hd um meio seletivo e diferencial que € 0 dgar cétrimice. 0 meio éseletvo, pois na sua composigao tem a cerimida, un composto quatemrio de amério que iibe o crescimento de uitas bactérias, inclusive espécies de Pseudomonas, ‘exceta Pseudomonas aeruginosa. Ee €diferencial por apresentar cloreto de magnésio e sulfato de potdssio que promove a produgdo de piocianina, na presenga de P aeruginosa. Este ‘melo possui coloragSo incial mbar ena presen da bactéra fica azul ou azul esverdeado, 0 Agar cétrride promove o sumento de produgo de plocianina, sendo a P seruginose a Unies cespécie de Pseudomonas e de bactérias Grarmnegativas que excreta piocianina (Figura 19), tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 25130,soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana DIAGNOSTICO Pyewdlorornsr PROVAS: RA, om DNASE ee ~~ Gb: _ ew =U 22. = - i iL why nocito | | + wioremwenra [Fgura 19. Esquema de idewticagdo Preudomonas spp. Fonte: Acervo peo. Questées para Estudo 1, Por que o agar cétrimide é um meio seetivoe diferencia para Pseudomonas aeruginasa? 2, Quala principal diferenga entre Pseudomonas e Enterobectérias? Cultura de Secregao Genital Introdugao Diversas petologias podern ocorrer no trata gentle pocem ter etiologia bacteriana fingica, parasitétias e vial. Multas dessas infecgGes sdo assintornaticas, passando despercebidas pelo paciente. A suspeita clinica deve ser ber definida, urna vez que, dversos agentes podem ‘causar esse tino de infecgio, sendo necessirio a diagndstice correto no intulto de estabelecer ‘omelhortratamenta para a infeccdo, As doengas mais comuns no sexo feminino so ‘ulvovaginite, vaginase bacteriana, cervisite, daenga infamatér'a pélvica (DIP) ¢ lesbes genitals, Jno sexo masculino as principals so urtrte, prostatiteelesbes genitals, A coleta adequade é de sume importéncia pare o sucesso no diagnéstico correto (OPLUSTIL etal, 2004), Muitos rnicrarganismas colenizam nermalmente essa regido, porér variagées hormanais, poder fazer com que bactérias de microbiota normal passem a ser consideradas patogénicas. Essa variago ocorre em recérr-nascido, durante puberdade e gravidez eer coutras situagses. Objetivos Conhecer quais as reais necessidadesdesse tipo de cultura Saber como realizar a cole ea cultura Aprender sobre as principals bactérias que colonizam o rato genital Materiais + "Swab tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 25130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana + Alga bacteriologica: + Amostras + Kitde coloragdo, + Laminas e laminas; ++ Meios de culture, Metodologia ‘A coleta da amostra poce ser realizada com “swab convencional, sendo armazenada ern termperatura de 20 °C a 25 °C tendo vabildade de cvas horas, Se for necessario 0 transporte utilze-se urn “swab” com melo de transporte, em temperaturas de 20°C @ 25°C, nessas concigGes a vieblidade da amostra é de doze hores. ‘A micrascopia pode ser realizada por exarne direto a fresco, Incialmente é colocada urna gota <éa arnostra sobre uma larnina,fixada pelo calor e em seguida subrnetida a coloracao de Gram A lamina é observada ao microscépio na objetiva de 40x (Figura 20), ESFREGACO Seoregcd vag? nal Lactobaciles sp ‘Figura 20, Lamina de sergio genial Fonte: Acervo proprio. Cultura + Semeadura das amostras colhidas em “swab: rola o “swab em uma pequena Area das placas AS (Agar sangue) e TM (Agar Thayer-Martn} ¢ mergulhéo ro caldo TODD (Caldo TODD-Hewitt) no caso de pesquise de estreptococos co grupo B, nesse sequéncia; esiriar es placas com alga bacteriologica em trés diregbes ciferentes. “+ Semeadura das amostras colhidas por pungéo: Colocarprimelro wna gota da emostia fem meio liquide (THIO)¢, a seguir, uma gota nas placas de MC (MacConkey), AS (Agar ssangue), ASANA (Agar Sangue Anaer6bio) eTM (Agar Thayer-Martin) e, or timo, cconfeccionar um esfregago para 0 exarne microscépico, Iniciar a semeadura a partir do meio ndo seletivo em trés dregées diferentes + Semeadura das amostras quantitativas: 1. Esperma ou liquide prostatico + Homogeneizar @arnostra, + mergir a alga calibrada de 0,01 mi. (1:190) na amostra, de forma vertical + Semear em AS e TM pela téonica quantitativa. tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 27130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana + Interpretagao: alga de 0,01 ml. (1:100) 1 colonia = 100 ou 102 UFC/enL, 2.Urina de 1*jato + Centifugar 10 mL. de urina a 1.800 rpm por § minutos, 1 Retirar 9 mL do sobrenadante e semear 0 sedimento com alga calbrada de (0.01 rt em AS ETM. + Interpretago: alga de 0.01 ml (1:700)~ 1 cotbni dda amostra por centifugay0) ou 10 UFC/mL, 100 + 10 (concentragao + Temperatura e tempo de incubagao © Apés a sereadura incubar as plecas de AS e TM em estufa de C02, 05 meios liquidos eo MC em estufa aerdbia @ 35:41 °C por até 72 horas, com litre dria. Questées para Estudo 1, 0 que pode causara varlagdo da microbiota? E em quais casos sso acontece? 2. Como deve ser a coleta adequada para esse procecirnento? Cultura de Liquido Cefalorraquidiano (LCR) Introdugdo ‘Ameningite é ur pracesso inflaratério das meninges, considerado um dos agraves mais ‘cornuns do sisterna nervoso central, Pode ser causada por agentes infecciosos, como vis, fungos e bactérias, ou por processos como, ago de medicamentos e neoplasias. Devido @ sua gravidade exige diagnéstico répide e preciso, A cultura do liquor e a identificagso do agente etiol6gico 6 um importante auxlo para o diagnéstico. 0 quer ou liquido cefalorraguid'ano (LCR) 6 um fluido corporal estéri e incolor encontrado no espago. subaracndideo do cérebro, entre as meninges aracnoide e pia mate, ¢ da medula espinhal (OPLUSTILet al, 2004) Para a caleta de liquor 0 ideal é uilizar pele menos trés tubos: quando néo ha indicagSo ‘especifica na pedido, o primeiro deve seguir para a bioqulmica (no 60 indicado para a cultura, pois é mais propicio 8 contaminago); 0 segundo, pare microbiologiae testes, sorobigicos:o terceita, para hematologia; € outros tubos, pare dernais procedimentos. Essa coleta deve ser felta em hospital por espectalistas, antes de se nicarterapia com antimicrobianos. Aamostra clinica para cultura deve ser encaminhada de Imediato 20 laboratéro, ou no prazo méximo de 3 h, sempre em temperatura ambiente. Amostras com volurne superior a1 mL dever ser centrfugadas. Com 0 sedimento realiza-se a bacterioscopia e semeacura, enquanto destina-se o sobrenadante & execugso das provas de detecgiio de antigenos bacterianas (LEITE etal, 2076), Na meninglte bacteriana, a transmissao€ interpessoal,pelas vias respiatérias, por meio de 1.000/mL), aumento de proteinas (=100 mg/mL) @ hipoglicorraquia (LEITE etal, 2078), Objetivos tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 22130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana + Conhecer quais o8 procedimentas envolvidas nas etapas da cultura de Vauor + Reconhecer quando se deve realizar esse tipo de cukura, Materiais + Agar sangue de carmeito 5% (ASA), + Alga bacteriologica: + Centrifuge citlégica (citocentrifuga). = Centriuga + Laminas de microscdpio novas e impas; + Reagentes para coloragéo de Gram: + Tioglicolato (110); + Tubo cénico estér + Tubos com tampa de roses estéil Metodologia 1. Processamenta nical do liquor: processar, semeare incubar as amostras; 2, Reportar a aparéncia do liquor: se claro, hemorrégico, turvo, xantocrémico e o volume: © Seo volume do fquor for <1 mL Homogeneizare realizar semeadura e 0 Gram diretamente do material © Seo volume do Kquar for 51 mt Cerisifugar par 10 min a 2000 ep Debxar a centrituga parar espontaneamente, sern usar o frei: Verter 0 sobrenadante er um tubo estéit Hornogeneizar o secimento vigarosarnente até ressuspendéo. Se necessétio, usar 6 agitador para misturar 0 sedimento, pois as bactéras e as Ccéulas poder aderira parece do tubo e causar resultados falsos negatives (este passo é ortico para a qualidade do resultado), Inocular o sedimento nas placas de reio eno caldo: ‘Com uma plneta de 150 pi retirar o secimento e processarna citocentrifuga- Preparar amostras biolégicas em centrifuge citolégica Debxar secar a temperatura ambiente; Alternativarente, deixar a lamina secar em uma superficie aquecida Fixar a lbmine corn metanol¢ corar para Gram, Questées para Estudo 1. Quala caracterstica morfotiniorial da Neisseria meningitisis? 2, Como deve ser realzada a coleta do LCR? Referéncias Brasil Ministerio da Saude, Biosseguranca em satide prioridades e estratégias de agdo/ Ministéio da Sade, OrganizagSo Pan-Americana da Sade, - Brasila: Ministério de SaUde, tipsifpublica.ciarufy.briebooksiptspibacterologia_humanafartigo_.him! 29130soinsi2024, 21:51 Bacteriologia Humana 2010. 242 p:il.~ (Série B. Textos Bésicas de Satide) BROOKS, GF. et al Microbiologia Médica: ce JAWETZ, MELNICK e ADELBERG. 252 Ed, Féitora AMGH, 2012. FILHO, H. M.T. Gastroenterites Infecciosas, J8M. Margo/Abril 2013, vol. 101, 9.2. LEITE,A A etal Andlise do iguide cefalorraquidiano cevisdio de Meratura,Atas de Ciéncias da Satide,v. 4, 3,p. 1=24, 2076 LEVY, E. Manual de Microbiologia Clinica para o Controle de Infecgéo em Servigos de ‘Sause. Manual de Microbiologia Comemorativa do IX congresso Brasileiro de Controle de Infecgdo Hospitalar,v. unico, 01-381, 2004, MADIGAN, MT. et al. Microbiologie de Brock 12a Ed, Editors ArtMed, 2010 MURRAY, PR; ROSENTHAL &.S; MICHAEL, AP, Microbiologia Média. 6a Ed, Editora Elsevier, 2009. OPLUSTIL, CP et al. Procedimentos Bésicos em Microbiologia Clinica. 3, £4. Sé0 Paulo: ‘Sarvier, 2004, TORTORA, GJ, FUNKE, BR, CASE, C.., Microbiologia, 10a Ed, Edtora ArtMed, 2072 ‘TRABULSI, LR; ALTHERTUM, F Microbiologia. Sa Ed, Edtore Atheneu, 2008, ZOCHIO.L. 8. 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