LUNASAM. ING. SANITARIA, [MANUAL DE MICROBIOLOGIA 1. MANOUANO A IV.PROCEDIMIENTO Preparacién de la muestra Tomar 10 mio 10.0 gramos de la muestra si es sdlido moler y mezclar. 2. Adicionar el alimento a 90.0 ml de agua peptonada u otro diluyente al 0.1 %, licuar y dejar en reposo de 2-3 minutos. 3. Realizar diluciones hasta 10°* g/ml con agua peptonada al 0.1 %. En caso de trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2° y 5 °C. Prueba presuntiva 4. Afiadir 1.0 ml de la dilucién 101 (g/ml) a cada uno de 3 tubos con 10.0 mi de caldo lauril sulfato de sodio, 5. _ Afiadir 1.0 ml de las diluciones 10-? (g/m) y 10° (g/ml) a dos series de 3 tubos cada una con caldo lauril sulfato de sodio. 6. Incubar a 35-37°C durante 24-48 h. 7. Los tubos después de la incubacién, se registrarén como positives si presentan crecimiento y produccién de gas. Prueba confirmativa de Coliformes totales, fecales y Escherichia coll. 8. De los tubos positives inocular (asa de siembra en aro de 3 mi), en caldo BRILA y caldo EC. 9. Inocular los tubos de caldo EC e incubar a 44.5. + 0.2°C por 24-48 horas, los tubos de caldo E.C. que muestren formacién de gas son positives para Coliformes fecales. 40. Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positives de Coliformes fecales; sembrar en placas de agar Mc Conkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa. 44. Incubar las placas a 35 + 0.5°C durante 24 + 2 h., observar las colonias tipicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales biliares. 12. Hacer tincion de Gram para observacién de la morfologia de las bacterias. Seleccionar 1 0 més colonias aisladas para realizar pruebas IMViC. Todos los cultivos que: Fermenten la lactosa con produccién de gas dentro de las 48 h. a 35°C Sean bacilos 0 cocobacilos Gram-negativos no esporulados. Si se obtiene las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++-) 0 Biotipo 2 (++) son consideradas como Escherichia coli. Calcular el NMP de E. coli basandose en la proporcién de los tubos positivos de caldo EC. 46