OUFU UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA GRADUACAO EM BIOTECNOLOGIA RELATORIO DE ESTAGIO PROFISSIONAL Titulo: Produgio in vitro de embrides bovinos Aluno: Ana Luiza Ferreira Chieregato Numero de matricula UFU: 11721BTC004 Orientador na UFU: Nilson Nicolau Junior Instituto de Biotecnologia Universidade Federal de Uberlindia Uberlindia - MG Supervisor Externo: SOmox: enty> Samantha Bielert do Nacimento Supervisora de Estagio In Vitro Brasil - ABS Pecplan Uberaba - MG Carga Horaria: 380 horas Abril 2022 Scanned with CamScannerUNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA INSTITUTO DE BI IOTECNOLOGIA GRADUAGAO EM BIOTECNOLOGIA RELATORIO DE ESTAGIO PROFISSIONAL Relatério de Estigio Profissional apresentado a Coordenacio de Estagio do Curso de Graduagio em Biotecnologia da Universidade Federal de Uberlindia como requisito para integralizagao de carga horaria de componente curricular Estagio Profissional Abril 2022 Scanned with CamScannerI. INTRODUCAO Atualmente, o Brasil enquadra-se como um dos principais paises no desenvolvimento de produtos de origem animal, com destaque para a bovinocultura, tanto na cadeia reprodutiva da carne quanto na do leite. Com isso, cada vez mais vé-se a necessidade de intensificar 0 sistema de produgao de gado através de biotecnologias reprodutivas, devido & sua grande importincia econémica (SOUZA, 2019). Dessa forma, os programas de melhoramento genético em animais propdem-se a ter nao so uma maior produtividade, mas também maior rentabilidade. De modo geral, 0 melhoramento genético em bovinos consiste na selegdo do touro e da vaca que gerardo uma prole para melhor atender 0 mercado (de leite ou de carne). E nessa selegao sio escolhidas as caracteristicas genéticas mais importantes para seu desenvolvimento, elevando, portanto, o padrao genético (BUSCAR RURAL, 2021). Desse modo, a produgdo in vitro de embrides (PIVE) surge como uma importante tecnologia reprodutiva assistida, ou seja, hd a formacio de um embrido fora do trato reprodutivo natural, em um ambiente controlado. Essa técnica envolve diversas etapas, como coleta de odcitos, maturagao, fecundagio e cultivo. E a partir disso é possivel acelerar a produgdo de animais que possuem uma genética superior (GONCALVES et al., 2008). No Brasil existem diversas pesquisas e estudos voltados para o aprimoramento de biotecnologias reprodutivas, tal qual empresas que se dedicam em atender 0 mercado, produzindo embrides bovinos in vitro em larga escala. O laboratério IVB Technologies da empresa ABS Global, é um dos grandes destaques no cenario nacional. A ABS é lider mundial no fornecimento de genética bovina, servigos de reprodugio, tecnologias e produtos, fundada em 1941, quando conquistou o pioneirismo no melhoramento genético animal. Desde entdo, a empresa fornece solugdes personalizadas para ajudar os produtores a produzir leite e carne de alta qualidade. objetivo geral desse estégio foi conhecer as técnicas empregadas na PIVE, acompanhando a equipe do laboratério, desde 0 momento do preparo do material para a aspiragao dos odcitos a campo até a entrega dos embrides prontos para transferéncia, aplicando também conhecimentos adquiridos ao longo da graduagio no curso de Biotecnologia. O Estagio Profissional foi realizado na empresa “ABS Pecplan”, sede em Uberaba (MG). Scanned with CamScannerIl. DESENVOLVIMENTO DO ESTAGIO IL - 1. Objetivos Especificos Os objetivos especificos do estdgio foram conhecer as técnicas envolvidas na PIVE: * Seleciio e maturagdo de oécitos; Fertilizago in vitro; Cultivo embriondrio; Avaliagio da clivagem; Avaliagio do desenvolvimento embrionario; Envase de embrides. Criopreservagao de embrides (VIT e DT), eee ee IL. 2. Atividades Desenvolvidas I1.2.1 Selecao e maturagao dos odcitos Os o6citos eram aspirados por uma equipe da propria empresa ou por terceiros, selecionados e classificados, depois levados ao laboratério em uma transportadora nos tubos de maturagao previamente preparados pelo laboratério. Esses tubos contém o meio de maturagéio e éleo mineral, a lavagem ocorre em tubos que contém 0 meio de lavagem. Apés a chegada no laboratério, os tubos eram mantidos em uma incubadora por 24hs para posterior realizagdio da fertilizagdo in vitro (FIV). Esse processo de selecao dos o6citos 6 considerado 0 D-1 (dia -1). 11.2.2 Fertilizagao in vitro Antes de realizar a FIV, era necessario descongelar as doses de sémen. O sémen é armazenado em palhetas ¢ mantidos em botijao de nitrogénio. Ao descongelé-los, em um descongelador proprio de sémen, eles cram transferidos para eppendorfs, onde era adicionado uma solugéo de percol e submetidos a centrifugagdo. Apés a centrifugago 0 sobrenadante ¢ removido e os espermatozoides transferidos para outro eppendorf. Aqui, faz-se uma avaliagio da motilidade e vigor dos espermatozoides. A FIV ¢ feita em placas de 35x15mm, que contém gotas com meio FIV imersas em éleo mineral, e, nessas gotas também é adicionado antibiético, heparina e PHE (penicilamina, hipotaurina e epinefrina). Essas placas sao colocadas sobre garrafas aquecidas que contém agua destilada. Entdéo, apés a maturagéo dos odcitos ¢ separagaio dos espermatozoides, pode-se realizar a FIV. Os odcitos siio transferidos para essa gota, posteriormente ¢ feita a fecundagao diretamente nas gotas de FIV, onde ja esto os oécitos, calculando a Scanned with CamScannerdose inseminada minima, e as garrafas sao armazenadas em incubadoras entre 18h-22h. A FIV é considerada o D0 (dia zero). 11.2.3 Cultivo embrionario Apés esse periodo de incubagao, & esperado a formagio de estruturas apés as sucessivas mitoses que ocorreram. Essas estruturas sfio primeiramente lavadas em placas de 90mm, passando por 3 gotas: 1* gota com meio de lavagem, 2* gota meio de lavagem + meio de cultivo e 3* gota apenas meio de cultivo. Além disso, sao avaliadas, contabilizadas e anotadas em fichas e posteriormente transferidas para outras placas de 35x15mm, mas que agora contém gotas de meio de cultivo. Essas placas também sao colocadas sobre as garrafas e incubadas novamente. O cultivo é considerado 0 D1 (dia um). 11.2.4 Avaliagio da clivagem Esse passo é realizado apenas no D4 (dia 4), enquanto isso, os embrides permanecem em incubadoras com umidade controlada ¢ 5% O2, 5% CO? e 90% No, e temperatura de 38,5°C. Nesse passo, as estruturas so avaliadas a fim de contabilizar aquelas que sofreram clivagem, ou seja, que passaram por sucessivas divisées mitéticas, até atingirem o estagio de morula (MO) ou mais adiantado, blastocisto (BL). As estruturas que nao foram clivadas, ou que nao possuem mais que 2 células, sio retiradas da gota. E, aps essa contagem, é adicionado nas gotas um novo meio que ajuda o desenvolvimento. 11.2.5 Avaliagao do desenvolvimento embrionario A avaliagao do desenvolvimento embrionério é uma etapa que ocorre no D6 (dia 6), e ela consiste na contagem de estruturas vidveis para realizar envase ou congelamento no dia posterior. As estruturas sao passadas das placas para tubos, que contém apenas éleo mineral e H-SOF. Porém, se as estruturas estiverem muito adiantadas, ¢ necessario realizar 0 envase ou congelamento delas no proprio D6. II.2.6 Envase de embrides O envase de embrides é realizado no D7 (dia 7), onde & esperado que a classificagio da maioria das estruturas seja em estégio de blastocisto, e assim, possam ser envasados a fresco (transferéncia de embrides-TE) ou criopreservados por vitrificagaio (congelamento rapido) ou direct transfer DT (congelamento lento). Na transferéncia de embrides, os gametas sao transferidos, 1 a 1, para palhetas, e colocados em transportadoras de embrides. No Scanned with CamScannercongelamento lento, os embrides sio gradativamente expostos a temperaturas cada vez mais baixas, a partir do uso de aparelho programavel que realiza automaticamente a curva de resfriamento adequada (GALBINSKI et al., 2003). E, para essa parte de congelamento, existem estagidrios especificos na empresa que auxiliam os técnicos. Ja no congelamento rapido, os embrides sao imersos em nitrogénio liquido quase que imediatamente apés seu contato com a solucao crioprotetora (ctilenoglicol e DMSO) e sao depositados em OPS (open pulled straw). Em ambos congelamentos, depois de ‘prontos’, os embrides sao depositados em raques identificadas e armazenados em botijées de nitrogénio. II.2.7 Atividades Complementares Além das técnicas envolvidas na PIVE, também foram realizadas outras atividades didrias e semanais na empresa. Algumas dessas atividades eram: limpeza e higienizagio dos fluxos, esterilizacao ¢ organizagio dos equipamentos de trabalho da equipe, mantendo 0 estoque sempre abastecido ¢ organizado. Além disso, fazer/completar as caixas de lacradores para envase a fresco, kits de viagens, auxilio na montagem de tubos de maturagio, tubos de previsao, fichas de cultivo, envase e vitrificagdo, por fim, auxiliando em todo o necessario para a produgio dos embrides até a saida dos mesmos para transferéncia ou estoque. Ill. CONSIDERAGOES FINAIS A partir do trabalho exposto, nota-se a importincia de se otimizar 0 processo de PIVE, afim de nao s6 aumentar a produgao, mas também produzir embrides de qualidade, que 0 mercado exige. Além disso, 0 aprendizado ao longo da graduagio fez total diferenga na aplicaco das técnicas e foi possivel ter um enorme crescimento profissional ¢ pessoal, aprimorando trabalhado em equipe, organizagio e gerenciamento de tempo. Por fim, agradece-se a oportunidade de realizagdo de estigio na empresa ABS Pecplan — Uberaba, que propiciou um grande aprendizado ¢ crescimento para o inicio da carreira de trabalho. Scanned with CamScannerIV. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS GALBINSKI, S. et al. Viabilidade e Fertilizagio in vitro de O6citos Bovinos apés Vitrificagao. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetricia, v. 25, n. 8, p. 553-559, 2003. GONCALVES, P.B.D; FIGUEIREDO, J.R.; FREITAS, V.J.F. Biotécnicas aplicadas A reprodugio animal. 2. Ed, Sao Paulo: Roca, p.395, 2008. MELHORAMENTO genético animal: rebanho mais produtivo ¢ rentavel. Buscar Rural. 21 jul. 2021. Disponivel em: . Acesso em: 16 fev. 2022. SOUZA, Gabriel L. I. Micro-RNAs espermaticos correlacionados com a fertilizagéo e 0 desenvolvimento inicial de embrides bovinos (Bos taurus) in vitro. 2019. 70f. Dissertag’o (Mestrado em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas) — Instituto de Ciéncias Biomédicas, Universidade Federal de Uberlandia, Uberlandia, 2019. 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