Travaux dirigés (TD1) Techniques chimiques pour la biologie Semestre 3, Filiére Sciences de la vie Exercice 1°1 On dispose d’une solution mére de sulfate de cuivre 4 | mol.L". Différentes dilutions ont été réalisées 4 partir de cette solution. On mesure l'absorbance de ces différentes solutions a la longueur d’onde 655 rim qui correspond au maximum de la courbe A = f(2) pour une solution, de sulfate de cuivre. La largeur de la cuve est de lem. Les résultats obtenus sont reportés sur Je tableau suivant : ‘Concentration C 0.20 0.10 ‘ad 0.020 | 0.010 (mol) ‘Absorbance A oer [0302 0151 [0.060 | 0.031 Faire un schéma de principe d’un spectrophotométre UV-visible. Pourquoi a-t-on choisi de travailler a cette longueur d’onde ? La loi de Beer-Lambert est-elle vérifi¢e ? Déterminer le coefficient d’absorbance lingique molaire dans ces conditions. Quelle est la concentration d'une solution de sulfate de cuivre dont I’absorbance est A= 0.200. wane Exercice 2 Quelle est la concentration de l'acide aminé tyrosine sachant qu'il a une absorbance de 0,70 obtenue a une longueur d’onde (lambda) précise en utilisant une cuve de spectrophotométre de | om d'épaisseur, Le coefficient d'extinction molaire pour Tyr (Epsilon) est 1 420M" x om"). Quelle sera absorbance d’une solution de 0,35 mM de tyrosine? Exercice 3 Le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH) est le coenzyme de nombreuses déshydrogénases. Calculer l'absorbance a 340 nm et & 260 nm d'une solution de NADH 0,05 g/litre, placée dans une cuve dont le trajet optique est de | em. PM signifie le poids moléculaire, « signifie le coefficient dlextinction molaire (unités : M'' x em")PM NADH = 709 g/mol s NADH (4340 nm) = 6 220 Mem"! © NADH (a 260 nm) = 15 400 Mem b- Au cours d'une manipulation, lon réalise $ ml d'un mélange NADH/NAD+ mais on a oublié de noter les concentrations respectives sur le flacon. Pour trouver ces valeurs, on a effectué des mesures au spectrophotomeétre avec une cuve de | cm de trajet optique; DO340nm = 0,44 DO260nm=1,31 Quelles sont les concentrations en NADH et NAD+ dans le mélange sachant que: e NAD+ (a 340 nm)=0 Mem! & NAD+ (a 260 nm) = 15 400 M'em™ Exercice 4 On s'intéresse un fluorophore hydrocarboné aromatique linéaire ;'anthracéne. Les spectres @ absorption sont enregistrés pour des échantillons de différentes concentrations. Ses spectres absorption dans I’éthanol sont donnés ci-dessous. Les valeurs des absorbances (ou densité optique) #A= 355 am sont également données différentes concentrations. omansnion [AD ste ~ ‘noi : Te am 8 a : nr 08 Z a ast 2 sag 2362 no am 1530 oy tive te ‘Commenter les spectres d’absorbance de l’anthracéne dans I’éthanol Tracer I'absorbance A = 355 nm en fonction de la concentration. Qu’observe-ton ? €) Une solution M d’anthracéne de concentration inconnue a été étudiée pour déterminer sa concentration. La solution M a subi une dilution de 100 fois dans ’éthanol (solution M1). Cette demiére solution a donné une absorbance de 0,15 4 = 355 nm. Quelle est fa concentration de la solution M?— A (mm) eprcparer mw Llve A ume ppbilion moire Amok ce Nacl peer S52) , on metine clay um Macon ef om ype com, intilheenyuryn' on ortive & 4 Glee. o prdparer 250 mbjale pubbate de cuime cl’ ume nobrion mire Amol Cx $0;, “5 453 6910 459769 —— 4acomll kW = 250m! © prepare U50ml de nrlfale de uirnre d'ane pobdion de AD bane Ame dé G. $2, —> 459,;69/) Ho-'\mol —@ 45,963/0 45,369 ——> 4.200 mf a = 3) =e 250mlby le Cotffcient dialoraloance + A=3¢ Keel > ene = DB cw ml NP 5) A= effec C= A Sul, Spey aoe book -& BhOnm ee C=Q059/0 Lhgw PM = 409g )mck. Fog Ss Amol ©, OB — > F,05 410 mob /P A- ec = 6220 «4a 4,05a10-* eos -2@ mm Aa _ Obl = F, OF lo”? sl/0 LE aon 62201 - a Az REO Me Doz Dolan) + DO (waot) Beene) 6, + Susann) 2 Oo Do-£CG+G) — (2 = Enos Eyasr) CoG = ee c= Do_aq.li 431 -Foraio> - v3 Pe 5 ae A, 3010 ml) 0. Ltecinn 2: A-O27% 4. dem © = A420 te 4 20 mol car! Diep tor de Beer — lambert Az Z€c => ce orn = bh, 9B tom) 2Berwelis a Pabraboce ert varies elm La Baugent donee. ein a & méme allure pow bout Ler concentiodions « Pabrrbance et propothinnele x Le concendathon b- Bn Rote M2 BE nw ge Mabrottance bt motel On dlue O, rbdion prin Linepuer La valeu d'abrsbance peur D,1S eu a Wibe concerdticction cle 244 lo clone Q. concerbrectiom de polihkan M. Ce 1 utc a o8P = 9,44 0? moll &.Travaux dirigés (TD2 ) Techniques chimiques pour la biologie Semestre 3, Filiére Sciences de la vie Exercice 1: ‘On sépare un mélange d’histidine, vatine, alanine, isoleucine et acide glutamique par chromatographie échangeuse d’ ions. 1, Donner l’ordre d’élution des acides aminés'si on utilise un gradient de pH allant de pH=9 a pH=2, dans le cas d'une colonne de : Résine échangeuse de cations Résine échangeuse d’anions 2. Quelle est la colonne qui donnerait la meilleure séparation ? 3. La valine, alanine et l'isoleueine peuvent étre séparés efficacement par chromatographie échangeuse d’ions alors que les pHi de ces acides amings sont presque identiques. Pourquai ? 4, Dans le cas d’une'résine échangeuse de cations, doit-on choisir une résine polystyrénique substituée par des groupement sulfonates (-S03-) ou des groupements carboxyliques (-COO-) ? 5. Le méme mélange, est séparé par électrophorése sur papier, * Donner le principe de séparation de ces acides aminés. + Quels sont les paramétres qui influencent la séparation électrophorétique de ces les aminés ? histidine valine alanine | isoleucine Ac gutamique PI iu 5,96 6 5,94 322 Le chromatogramme suivant représente le profil d’élution des trois acides aminés (A, B et oConcentration dans I'éluat 1) Quel est le type de chromatographie utilisé ? Donner son 2) Que pourraient étre les acides aminés élués ? principe. Données : Acide aminé pHi Acide aminé [pHi Glycine 3.57 ‘Asparagine 34 Alanine 6,02 Acide glutamique 3,22 Valine 5,97 Glutamine 5,65 Leucine 5,98 Lysine 9,74 | Isoleucine 6,02 ‘Arginine 10,76 Sérine 5,68 Histidine 7,58 Thréonine 6,53 Phénylalanine 5,98 Cystéine 3,02 Tyrosine 5,65 Méthionine 5,15 ‘Tryptophane 5,88 Acide aspartique 287 Proline 6,10 Exercice 3 Dans le but de déterminer le poids moléculaire d"une protéine X, on a réalisé une chromatographie d'exclusion. La limite de séparation du gel utilisé est comprise entre 40000 et 400000 de MM. Le tableau suivant montre les poids moléculaires et les volumes d°élution des différents marqueurs de poids moléculaires. ‘MM (Da) Ve (ml) Bleu dextran 2000000 45 Fibrinogéne 340000 60 Catalase 230000 75 ‘Lactoglobuline 19000 132 J Te volume d’élution de la protéine X est Ve= 105 ml. Déterminer son poids moléculaire.Serie 2: ened Owe ue pclae a Pinticlme, Yalline, eloniwe » drobeuci ‘ee rR cy oh o=u Cc na Na 3 «> \/ g's eb Procicle glitonique CH, Coon PH At PHS PH, AT PH. = PH; > Ae alla de PH=D% PH=2 tow fer PA Ranged mdayctvement donc ba rivne de eHdions(-) aie eagle pr AA ek La rbrime elaniow Lt) tows Be, PA revert captéer. 2)_ Be PH ork dinimne cle SR % dit leide Raosticine Valine , colomine irchencine Neh Pideicl oedamicpue se phone LcBompger demBrrcyu: onne fe. -meiMoure ne porclion 3) - une difference hea cael quelqwenque det Che 72> cle A difference. Bycompotomed de cor AA bors cle le. Promctorpaphic Diexonen. de Ro biscbre de cor BAM morke une moclifi: cation cle conectees Raphuphobe cle fa cRatne Mnterele 4) - Beepelibenedd riGenoter ($0.) et pls fot que Ao qutbenet caseseyeques (Coo)5) - me patkok et Rargee eleciquenedt ent rowmin & an Panp abecsgac € 7 aéplce ves & pSle eppore & da Borge fo me re léphece pea) (4% pedeak now Ranger ~ be Borge De temperctire » Le paces molec i be whkene che megrdion va the yariabR , cequc peymet be réponadion cle cliffdert pacteulky. _exercive 2. 1 dogo Bie. A! eRe je hisny 1) & Chances Lions rent der macromotiiaderrpote ce, qtedhementy ionirablh qud ot Ae prophceld cle a pager nerewbh coda de four sows u 2) A: acade ofbdtamicue B. abnne | valine | Racine om Lyne EE Bnimctoonaphce Alec repaatdntvdesmoticubes rehr. Lew, beh, Vobome d chtern Lb doik que B. velour obben me rnd par cle coube ri mow ow lot mocifics de gelModule : Techniques chimiques pour la biochimie Travaux dirigés Semestre $3, SVI Exercice 1 Line des étapes de purification des protéines est la précipitation fractionnée par addition d'un sel dans la solution protéique : on ajoute trés progressivement une masse donnée de sel (le plus souvent le sulfate d'ammonium : (NH;):SO,, jusqu’a atteindre un certain pourcentage de saturation (voir Tableau). L’addition du sel se traduit par une augmentation du volume de la solution, La grandeur qui tient compte de cette augmentation est le volume spécifique (c’est Pinverse de la densité). a. Calculez la concentration molaire d'une solution saturée de (NH.)2$O, 4 0°C. b. Caleulez, 4 0°C, la quantité de (NH,)2S0, solide & ajouter 4 500 mL d’une solution 4.40% de saturation pour l’'amener a 60 % de saturation. Bwendes : eoF + solubilité de (NH,)2S0,=" ~ g/ 1000 g H20 a 0°C + volume spécifique de (NH,)2SOs= volume oceupé par 1 g de (NH,):SO,= 0,565 T mLg ‘+ pourcentage de saturation = concentration d’un sel exprimée en pourcent de la concentration maximale (solution dite" saturée ") de ce sel A une température donnée «masse molaire (NH,)2$0,= 132'g.mol'' Exercice 2 1) Quel est le principe de la précipitation différentielle des protéines? 2)- Comment procéder pour récupérer une protéine d’intérét, soluble dans du sulfate d’ammonium 50% mais insoluble 475% ? Cette protéine est contenue dans un volume de 260 ml. 3} Quelle technique faut-il utiliser pour éliminer le sulfate d’ammonium aprés récupération de la protéine d’intérét? Expliquez Exereice 3 On étudie une enzyme du métabolisme du tryptophane. Lun des substrats de l'enzyme est le tryptophane lui-méme dont on veut déterminer le nombre de site(s) de fixation. Aprés incubation de l'enzyme (& une concentration constante de 5 10° M) avec des concentrations ‘variables de tryptophane marqué au '“C, on trouve :pac Trpllié 10% 1 2 4 oy 55 7 9 Tac Tipllibee 10% 0,56 1,23 3.40 ™ 6,00 170 | 43,70 & Aad 4,63 ANt 0,51 oso o® A pattir de ces valeurs, calculez le nombre de site(s) de fixation du tryptophane par molécule dlenzyme, et la constante de dissociation Kp pour le complexe enzyme-tryptophane, Exercice 3 Le bromure d’éthidium (Bet) interagit par interactions hydrophobes avec les cycles des bases : des acides nucléiques NH HAN’ CH2CH, Bromure d'éthidium La fixation du Bet est étudiée par dialyse a 'équilibre avec de courts fragments d'ADN a une concentration de 1 wM. On peut ainsi déterminer le nombre de molécules de Bet fixées par fragment d’ADN pour différentes concentrations initiales de Bet. Le tableau suivant en donne Jes valeurs : [Bet] libre (4M) 0,042 0,092,204 0,526 1,150 [Bet] (lig #libre) (UM) 0,292 0,590 1,204 2,531 4,150 A partir de ces Valeuts, calculez le nombre de site(s) de fixation du Bet par fragment d'ADN, et laconstante de dissociation Kp.Bene 3s exercia | ey On Derebe diabnd Liaucretation de volume Preveqiser par be pobbubedion de 6979/0. 0,665 & 69FT = 393,28 mLl= 0,333.0 mR M2 48% 343,13 mob 0 [ omy, J = = v Vv 9,393 b) Dope a ele de salucton dgk exode 43069 de sult eh clranSnitinn po has we scturation ch GOL, 4305 —> ooo! Ee _— 500 ~L Vv 659 exerci 2: ater Ge DQ aracentoge de an ced Ae Orn adi tne bev PO nohe protene ol prs Re ops mapas doo = fhe er apbaneccte CA A inkowck podk prcceplee ae O° zy Te fe pecepiiction B 50% 2)- & yee ove 22 2) a toconl 260k Acces On eyorte 66 de ped pate CL! ammoniumpor Pa mate ow fail ame a préapitation & Sl ow a inticlement 507, de prediction deuce 1599/2 452 ay ——> 4000 rb i, 3h 2— 2EOms owe on ayote Ut, Bh 9 te mulfade elem sation CSininer Le rebfnte J commer path technique de recipies comtenack tm Qparel volume de tamper cb ow oud don tancin: apipencabls ete sade aden ok malformed om be rwlpebe lem onivme ve difuer Clewr Bevmnbd de vobme soe eines cmptones ple Jomennion 2S Poperadkion phaser for exercice 3: ee BD- pe Oo 059 | &2 EE 4,79 | 4,63 | 4,4t RL y _ membre de riter Glamtelen t= 1A 2 104 10% 5 ato med 10 4 aloS _ be conrtomte ce dipoaakion Ky Ky- Y.- 4 oe AL Ka > %ea —— FH) a] oss | ove [4 2,008 3 [ren 595 out | 4,92 B91 2,60 { Nas Ry = 433 aloo MM o> Ky = aModule : Techniques chimiques pour la biologie Travaux dirigés Semestre S3, SVI I Liiode (Ix) présente une grande solubilité dans l’éthanol et également dans le dichlorométhane. 1) Pour ’extraction de l'iode a partir d'une solution aqueuse, on utilisera le dichlorométhane et non I’éthanol, Pourquoi ? 2) Le coefficient de partage de I'iode entre le dichlorométhane et leau, est égal a 100 a 25 °C. Définir le coefficient de partage. 3) A 10 ml de solution aqueuse d'iode a 10g/l, on ajoute 10 ml de dichlorométhane . Déterminer la concentration en iode dans le dichlorométhane et dans l'eau, aprés agitation et décantation Il- Le chloroforme est un solvant organique que !’on peut utiliser pour l’extraction de la caféine a partir du café. Certaines caractéristiques du chloroforme sont présentées dans le tableau suivant 1)- Quel est l'état physique du chloroforme a 25°C ? 2)- On dispose d'une préparation a base de café qui contient entre autres, dela caféine dissoute dans l'eau. Sachant que la caféine est peu soluble dans |’eau, proposer un protocole opératoire permettant d'extraire la caféine de cette préparation. Faire un schéma illustrant Pétape principale de extraction en précisant la position des diverses phases. Justifier votre réponse. 3)- Comment procéde-t-on pour éliminer le chloroforme et récupérer la caféineRE Seteomts nom mincitice Th enc tanD)-O- ow pet par dicbrer GidkBansl pose Prertacken de Piiocle cor 2! EkRamal of mirtilobe anee Plea @- te ceefpedent de patage Key ost gale ou rapper de & concerduahion cl'aim peobte Ke = [ettos [ cde ay dere od ; Ler clewx by oer ck Pen ow B+ or Rouffe a tee pyoparer ee TEP Y, Rorefrne mi & “De cofetne ow ferns rode (esecle).Mesure de lactivité enzymatique Les enzymes se trouvent souvent en quantité faible et il est difficile de mesurer leur quantité denzyme en unités de masse ou de concentration molaire. Leur quantité est évaluée par Fintermédiaire de leur activité. Cette activité est définie en termes de vitesse de réaction (la V étant directement proportionnelle a la quantité d’ enzyme), La mesure de l’activit8 enzymatique consiste & évaluer la quantité de substrat transformé ou de produit appara par unité de temps dans des conditions opératoires bien déterminées. Done activité d’une enzyme se mesure : soit par la vitesse de disparition dun substrat, Soit par la vitesse d” apparition d’un produit ou également par la vitesse d'utilisation d’un cofacteur Ce sont les conditions qui permettent d’avoir une vitesse constante et maximale. 2) Milieu tamponné pour éviter toute variation du PHI et déterminet la force ionique. Verifier que le tampon ne contient pas @’inhibiteurs. b) Milicu thermostaté pour stabiliser la température optimale c) Choix du substrat (gde affinité) et concentration saturante [S] = 10 Km (pour atteindre la Vmax) 4) Ajout de coenzymes si nécessaire ¢) La durée d’incubation 1) Le S doit étre pour lequel 'enzyme ale plus d’affinité et on exige que S > 10 Km pour atteindre Vmax Méthodes de mesure existe 2 méthodes de mesure de l’activité enzymatique : 1- Méthodes en point final ou « A deux points » : Cette méthode nécessite utilisation d'un témoin, Le témoin consiste en une prise d’essai identique mais dans laquelle on a inactivé l'enzyme. Ce témoin est surtout nécessaire lorsque le produit de la réaction que I’on dose préexiste dans I’échantillon ou bien dans certains cas le $ risque de se transformer sans |’intervention de l’enzyme, dans les conditions de essai. Cette méthode consiste a -Laisser l'enzyme catalyser la réaction pendant une durée déterminée d’ incubation, -A arréter son action,-Puis ajouter un réactif qui réagit avec le S ou le P et avec lequel il est capable de donner un produit coloré dont Pintensité de coloration, hue & une } déterminge, est directement proportionnelle & "AE Exemple: Test colorimétrique du dosage de ?ALAT o-cétoglutarate + L-Alanine > Glutamate + Pyruyate - Tempon contenant: L-Ala et a-cétoglutarate; - Prise d’essai de sérum contenant l’enzyme & doser; Incubation du mélange pendant 30 min 37°. -Additionner le réactif de coloration: Dinitro-2,4 phénylhydrazine (agit sur PYR) P coloré rouge brun (Dinitrophénylhydrazone ); Lecture de la DO a 530-546 nm aprés 20 min @ incubation 425°C -Calcul de AE aprés réalfsation dun étalon ou détetmination graphique aprés réalisation a une courbe d’étalonnagg a aide d’une solution mere de PYR. Si le produit ou le substral présentent une absorbance & tine longueur donde déterminée, Lajout de réactif n’est pas nécessaire. La durée de la réaction doit étre mesurée avec une extréme _précision : -Le temps (0) est celui ott la réaction est déclenchée. -lorsque la durée d incubation s'est écoulée, il est nécessaire de bloquer rapidement la réaction : soit en chauffant 100°C brutalement, soit en se plagant rapidement en dehors de la zone de pH, en ajoutant un agide ou une base, soit en ajoutant un dénaturant d’enzyme. 2- Méthodes cinétiques ; on ne fait généralement pas de témoin, le zéro optique de Pappareil est fait sur essai de temps zéro. La méthode cinétique eonsiste a suivre I’évolution de la réaction en fonction de temps; La substance dont on mesure la vitesse de disparition ou d’apparition doit posséder une propriété spectrale spécifique dans I’ UV (Ex NADH) ou le visible (Ex : peroxydase). Lorsqu’aucune de ces conditions n’est pas réunie, 88 opére a l’aide de réactions couplées appelées réactions indicatrices. L’enregistrement des variations d’absorbance en fonction du temps est la technique la plus simple, la plus rapide et la plus spécifique. Dans les méthodes cinétiques & enregistrement continu, la durée de réaction n’a pas besoin d’étre fixée avec rigueur. La réaction est déclenchée, par addition d’un réactif (appelé réactif déclenchant) ou par addition de enzyme, aprés avoir attendu que le milicu se stabilise. Elle évolue et enregistrement de la courbe : P = f{t) permet la détermination de l’activité sur graphe. étique enzymatique en Ultra-violet Le couple NAD/NADH ou NADP/NADPH est usuellement employé.«La plupart des enzymes sont mesurées par des réactions en cascades en UW mettant A+ NADH, H” AH, + NADP” 9A + NADPH, H™ {NAD*] > 10 Kmyap+ Le NADH présente deux bandes d’absorption ‘une & 260nm, autre & 340 nm; le NAD tune seule #260 nm, Si la réaction enzymatique évolue dans le sens de la réduction du NAD‘, tbo a 340 nm augmente; inversement, si elle évolue dans le sens d’oxydation de NADH, la 10 2340 nm diminue. Le coefficient @extinction molaire du NADH ou NADPH & 340 nm est: ¢= 6300 mol.!'em" Réactions enzymatiques couplées Lore, dont on mesure 'activité, n'est pas une déshydrogénase & NAD" ou NADP* et que ri Set ni P ne possédent de proprietés spectrales, alors on couple la premiére réaction & une deuxiéme, catalysée par une déshydrogénase dont P est le substrat. “La Lere réaction est dite réaction principale +La 2eme réaction est dite réaction indicatrice Exemple.* Ac aspartique + Ac a-cétoglutarique ~ASAL, Ac oxaloacétique 4 Ac glutamique. + AOA+ NADH,H* MEH Malate + NAD? L’AOA, produit de la lére R (principale) est le S de Ja R indicatrice. +A chaque molécule d’AQA apparaissant, correspond l'oxydation dune mole de NADH,H’. +Dans ces conditions la variation de DO/min & 340 nm correspond a I’activité de la transaminase. AEL = AE2 Dans ces conditions la R principale est limitante pour la seconde VL=V2 Etude de trois réaction couplée Lorsque P n'est pas le $ d’une déshydrogénase,on couple la lere R & une réaction auxiliaire, elle-méme couplée une R indicatrice, Et E > s —L,p 2 ox wt " fo cate te R principale Raunitiaine R indicatrice