Toxicologie 1, LP 5 Metode de identificare si dozare a substantelor toxice {In probele de analizat unii compusi potexista in mod natural, dar datoritd cresterii concentrafiei ei pot deveni toxici, iar alfii nu trebuie sa existe. Din aceste considerente, metodele analitice pot fi clasificate in: ‘«metode.calitative, care semnaleaz prezenja compusului toxic in proba ‘«metode.cantitative, prin care se evalueazii cantitatea compusului toxic din proba Alegerea unei metode trebuie s& tind cont deo serie de factori cum ar fi: « sensibilitate; sensibilitatea reprezinta concentrajia minima de substansa ce poate fi determinaté: cw o anumiti siguranja. Alegerea unei metode de analiza depinde de sensibilitatea ceruta. Cu cat este mai mica proba si cu cat compusul de interes in proba este mai pufin prezent, cu atat metoda trebuie sa fie mai sensibila «precizie; precizia se refera la corectitudinea rezultatului objinut cu metoda propusa, Ca si sensibilitatea, precizia variaz& de lao metoda la’alta. Practic, se va alege metoda care furnizeaz gradul de acuratete cerut selectivitate; selectivitatea constituie proprietatea unei metode de a furniza 0 precizie mai mare la determinarea unel anumite substante dintr-un amestec, comparativ cualte substante coprezente. Cu cat proba este mai complexi, cu atatmetoda trebuie si fie mai selectiva. Adesea se mai foloseste termenul de specificitate. Daca selectivitatea arat o anumita preferinta pentru o substanta, notiunea de specificitate intr-o metoda analiticd, implica un raspuns specific. In general, ins, metodele analitice nu sunt complet specifice fafa de un anumit component “catemaiieftiné si:sixdurezespufin: timpul si costul realizirii unei analize sunt corelate cu dotarea laboratoarelor cu echipamente adecvate si existenta unui personal calificat. in cazul analizarii mai multor probe similare (ex. controlul de calitate), poate fi necesara folosirea unor mijloace de automatizare. Adesea, scurtarea timpului in care se execut’ o analiza se face pe seama preciziei care, in anumite situatii, poate fi admis’. Metodteleamalitive se impart in metode chimice si metode instrumentale. ‘Metodele'chimtice se bazeaza pe diferite operatii chimice folosind sticlaria wzuala de laborator format din aparate simple. In general in aceste metode se masoara masa sau volumul. Avantajele metodelor chimice: procedeele sunt simple si precise; metodele se bazeaza in general pe masuratori absolute; echipamentul necesar nu este scump. Dezavantajele_metodelor chimice: uneori lipseste specificitatea; realizarea unei analize ia de obicei un timp destul de lung; precizia scade odati cu micsorarea cantitatilor de proba (misuratori absolute); sunt lipsite de flexibilitate; sunt poluante pentru mediul inconjurator.Metodelewinstrumentale implica utilizarea unui echipament complex, bazat pe principii electronice, optice sau termice. In aceste cazuri, se masoara diferite proprietati corelate cu compozitia probei. Avantajele metodelor instrumentale: determinarea este foarte rapida; pot fivutilizate probe mici; pot fi cercetare probe complexe; prezinta o sensibilitate ridicati; dau umgrad mare de sigurantai rezultatelor masuratorilor. Dezavantajele metodelor instrumentale: este necesara o etalonare-initiala sau continua a aparatului; sensibilitatea si precizia depind de aparatura sau metoda chimica de etalonare; precizia final se afl adesea in domeniul +5%; costul initial si pentru intretinereaechipamentului este ridicat; intervalul de concentratie este limitat (masuratori relative); in mod obisnuit, necesit’ spafiu destul de mare; implica un personal cto pregatire speciala, ‘Metotielerterestaresselectate pot fi, in general: ‘«metode de screening *metode de confirmare ‘Metodelede:screening sunt in general calitative, relativ simple si ieftine si realizate cu scopul dea maximiza sensibilitatea Testele de screening nu sunt standardizate. Metodele de screening pot produce un numar semnificativ de rezultate fals-pozitive. in prezent cele mai utilizate metode de screening se bazeazi pe metode imunologice. Metodeledeconfirmare sunt realizate pentruaaveao specificitate aproape perfect’, de aceea tind sa fie tehnic mult mai complexe si mai dificile. Acestea au o important relativscdauta in cazul toxicologiei de urgent’, de aceea se-utilizeaza in principal in cazuri medico-legale, in care trebuie sa se stabileascd prezenja si cantitatea unui anumit compus. in prezent, in laboratorul de toxicologie, pentru determinarea toxicilor, se folosesc urmatoarele tehnici: \temetode\colorimetrice (spot test strip) - specifice pentru uni compusi toxici - cromatografiain=stratsubfire, pentru identificarea unor grupe de pesticide (organoclorurate, organofosforice, derivati cumarinici) - cromatografiade gaze, pentru identificarea si/sau confirmarea unor insecticide, a piretroidelor, a altor compusi ca fipronilul si tiametoxamul, a unor medicamente, precum sirealizarea testelor screening - cromatografia de lichide de inalta presiune cuplata cu spectrometria de masa, pentru identificarea si/sau confirmarea unor raticide, a stricninei, a unor biotoxine, precum si realizarea testelor screening - spectrometria"de-absorbtievatomic’, pentru determinarea unor toxici metalici (cadmiu, plumb, arsen, mercur ete.) -\spectrometriasde=masacusplasma=cuplaté=inductiv, pentru. determinarea simultana ametalelor ‘Teste deculoare Un test de culoare este o procedura chimica in care substanfa de testat reacyioneaza cu un reactiv care determina 0 schimbare’a acestuia, producand, astfel, o culoareobservabili sau schimbarea culorii. Testele de culoare pot fi folosite pentru a determina prezenja anumitor compusi sau a unei clase generale de compusi. Procedurile sunt, de obicei, rapide si usor de realizat. Analiza rapida a probelor de urin’ este cea mai folositoare dintre testele de culoare in toxicologie, deoarece aceasta poate fivanalizata in mod:direct, fra proceduri de extractie consumatoare de timp. Un exemplu de test de culoare este ,testul lui ‘Trinder” pentru detectarea salicilatilor din sfnge sau urina. Un reactiv de azotat de fier si clorura de mercur se amesteci cw 1 mide sange sau urind; in cazul in care sunt prezenti salicilatii se obgine o coloratie violet. Ca si in toate celelalte teste toxicologice, prezenta salicilatilor trebuie si fie confirmata si printr-o alti metodai de analizi\, deoarece se poate obfine un test ‘Trinder pozitiv pentru: acidul. salicilic (metabolit al aspirinei), salicilamidei si salicilatului de met. Un test fals-pozitiv, care conduce la obsinerea unet culori specifice atunci cand nu este prezent salicilatul, poate fi observat in cazul-urinei:pacientilor cu diabet zaharat care excreta acid acetoacetic si la pacienfii tratati cu doze mari de fenotiazinice, Toxicologii trebuie sa fie constienti de limitarile testelor si, in special, de producerea reactilor fals-pozitive. Cromatografie in strat subtire (CSS) CSS este o tehnica de separare tn care amestecul de solvent ce formeazaifaza mobili (developantul) se deplaseazi printre particulele de adsorbant (depus in strat subtire pe placa cromatografic’), care reprezinta faza stationara. Pe masurd ce progreseaz’ frontul developantului, substanyele din amestec se separa in zone distincte situate de-a lungul stratului de adsorbant. Cand frontul amestecului de solvengi a atins extremitatea plicii cromatografice, aceasta se scoate, se usucd si apoi se identificd substangele separate. Identificarea se face intotdeauna prin comparatie cu o substanta cunoscut’, numita standard. Relevarea (identificarea componentelor izolate) se realizeaz prin examinarea plicii in lumina UV si/sau prin pulverizarea cu deferiti reactivi, indicati pentru fiecare substanta sau grup de substante, Adsorbantii folositiin CSS trebuie si indeplineasca anumite condi sa nu reactioneze cu compusii de separat sau cu developantul #5 nu reactioneze cu reactivul de identificare sa reziste la temperaturi de 120°C (temperatura de activare a_placii cromatografice) sa prezinte o suprafata activa ‘58 aib’.o suprafaya specificd mare, respectiv 0 granulatie fina (sub 100 jum) si un numar de pori de diametru mic Adsorbanfii utilizati pot fianorganici (silicagel, oxid de aluminiu, kieselgur, oxid de magneziu, silicat de magneziu, talc) saw organici (celulozii, poliamida, sephadex, rsini schimbatoare de ioni). Developantii trebuie sa indeplineasca anumite condi sd separe complet toate substantele dintr-un amestec +54 produca separari de substante sub forma de spoturi simetrice, fra cozinu trebuie si produc’ transformari chimice ale substanjelor de separat ‘*nutrebuie si reactioneze cu reactivii de identificare Exemple de developanti: eter de petrol, hexan, cloroform, acetat de etil, acetond etc, sau amestecuri de solventi. -Gazcromatografia (GC) GC este o metoda aplicabilit in special pentru separarea amestecurilor si depistarea ulterioard cu ajutorul detectorului conductibilitatii termice, cu ionizare in flacdrd, cu capturd de electroni etc. Metoda are o' mare sensibilitate si specificitate, insi, necesita o aparatura complex. GC este 0 tehnic& cromatografica care utilizeaza 0 faz mobil’ gazoasa si o faz’ stationar’, care poate filichida sau solid’. Gazcromatograful are trei componente principale: injectorul, cuptorul de termostatare a coloanei cromatografice si sistemul de detecyie (unul sau mai multi detectori), la care se adauga sursa de gaz purtator (faza mobild) si un computer cuun soft special, care coordoneaza GC. Probele introduse in gazcromatograf pot fi gazoase sau lichide. Lichidcromatografia (LC) LC este o tehnicd de separare in care faza mobil este reprezentata de un lichid. LC poate fi efectuata atat tn coloan’, cit $iinplan. in prezent LC care foloseste particule foarte mici si presiuni relativ ridicate este denumita cromatografie in lichid de inalta performanta (HPLC). Un HPLC este compus dintr-un rezervor cu solventi, pompa de gradient, injector, coloanii de separare, detector si un computer cu un soft specific. in HPLC proba este fortata de catre faza mobila care este un lichid la presiune inalta continua sa treaca printr-o coloand umpluta cu asa numita faza stationara, Metoda este adecvati, in special, pentru compusii sensibili la cildur’, care se pot descompune atunci cénd se volatilizeaza in GC. Ca si in cazul GC, compusii eluati sunt identificayi_pe baza timpului de retentie specific, iar semnalele la detector sunt proportionale cu concentratia de compusi prezintiin proba. Spectrometria de absorbtie atomica (AAS) Principiul spectroscopiei atomice are la baza proprietatea atomilor dea emite sau absorbi radiatii electromagnetice specifice elementului in anumite conditii fizice. Pani la aceasta etapa, este necesar sa se elibereze elementele care urmeaza a fi investigate intr- © proba din compusii lor, in general printr-o absorbyie de energie si si le fac disponibile ca particule libere. In AAS, elementele de analizat sunt transformate prin absorbfie de energie termica in stare atomica liber, intr-un dispozitiv de atomizare, unde atomii au capacitatea de a absorbi radiajia specific’ elementului. La acest nivel, este introdusi’in traiectoria razei de atomi o lampa catodica cu filamentul confectionat din elementul care urmeazai a fi investigat in AAS. in functie de concentratia elementului de determinat din proba, o partedin intensitatea radiatiei limpii catodice este absorbiti de atomii formati. Intensitatea radiajiei neatenuate si radiatia dupa parsirea dispozitivului de atomizare este masurati de doud foto-multiplicatoare. Concentratia elementului in proba poate fi calculata prin diferenta dintre cele doua intensitati, -Spectrometria cu plasma cuplata inductiy (ICP) ICP este un tip de spectrometrie deosebit de sensibili, utilizat’ pentru determinarea concentratiilor foarte mici a numeroase metale si nemetale. Domeniile sale de aplicatie sunt toxicologia medicala si legal’, patologia in general (disfunctii metabolice, hepatice si renale, directsawindirectasociate dezechilibruluiionilor metalici). Spre deosebire de spectrometria de absorbtie atomic (AAS), ICP permite detectia simultand/a unui numirmare deelemente deanalizat. in acest mod de analiz energia este produs’ intr-o plasma de argon si transferat laelementele de analizat. Temperatura inalt& (6000 K) evapora si calcineazi constitue probei si transform’ atomii in stare excitatd sau ionizata. La revenirea din aceste stiri cu viafa foarte scurti, de mare energie, este emisi o radiatie specifica elementului. Pentru fiecare element, lungimea de unda a radiatiei este caracteristic’, iar intensitatea este proportional cu concentratia lui in solutia probei. Prin acest procedeu este posibil si se determine pana la 70 de elemente in mod simultan. Marele avantaj const in determinarea multi-element foarte rapida si cu o interferenté scizut, Exist mai multe tipuri de detectoare ce se pot cupla cu ICP mirind sensibilitatea analizei: AES (spectrometric de emisie atomicd), OES (spectrometrie de emisie optica), MS (spectrometrie de masa) etc. Pe kang& probele clasice de sol, apa, hrana, in prezent prin ICP-MS pot fi analizate o gami largi de probe biologice, atat solide, cat si lichide (sange, urina, plasma, ser, fluide interstitiale, organe, dinti, oase, par si chiar celule).