Producdo, determinagdo ¢ calibracdo da concentragao de indculo em suspensdo 107 desenvolvimento do fungo que cresce ndo somente na superficie, mas em todo o meio, e, conseqiientemente, obtém-se maior produ¢ao de micélio. Apés 0 periodo de incubacao, 0 micélio é lavado em agua destilada esterilizada, para remover 0 excesso do meio de cultura, sob filtraao a vacuo e triturado por 1-2 min em homogeneizador do tipo Polytron ou liquidificador. Na segunda técnica, o inéculo € produzido sobre papel-celofane previamente esterilizado e mantido sobre o meio de cultura utilizado rotineiramente Para o crescimento do patégeno de interesse. Essa tiltima técnica € simples, facil de executar e requer a utilizacao de poucos recursos laboratoriais. Figura 4.1 - Coletor de esporos: A - Detalhe do coletor; e B - Coletor acoplado a uma bomba de succao. 3 Determinacao e Calibragao da Concentracdo de Indculo A determinagao e calibragdo da concentracao de inéculo, para esporos em suspensao, sao extremamente simples; no entanto, para inoculagées realizadas com esporos a seco ou com micélio triturado, sao despendidos maiores cuidados e padronizagées dos procedimentos, a fim de garantir a repetibilidade dos expe- rimentos.108 Aifenas, Zaza © Vesa 3.1 Determinacao e calibragao da concentragaéo de indculo em suspens6es de esporos A quantidade de esporos por unidade volumétrica, nas suspensées de inéculo, pode ser estimada mediante o uso de uma lamina especial denominada Hemacitémetro ou Camara de Neubauer (Figura 4.2). Atualmente, existe ainda uma possibilidade mais eficiente, que consiste na utilizagao de urn contador au- tomético de particulas ou células em suspensao (Figura 4.3). Neste tltirno equi- pamento, além de ser possivel determinar com maior precisdo e com maior rapi- dez a concentracéo de inéculo, ha ainda a possibilidade de gerar informagées quantitativas sobre o inéculo, como o tamanho minimo, mdxirno e médio dos esporos, 0 desvio-padrao dos dados ete. 3.1.1 Hemacitémetro Ha varios modelos de hemacitémetros, e 0 mais comum consiste de uma lamina retangular em forma de H (Figura 4.2 1), tendo no centro dois compartimentos delimitados, um ao lado do outro, cada um com superficie de 9 mm?e profundidade de 0,1 mm, circundados por uma pequena canaleta. Cada um dos dois compartimentos descritos é, por sua vez, dividido em nove compartimentos de 1 mm? de area (Figura 4.2 Il). Esses nove compartimen- tos sao de trés tipos, A = B = C, em que: “A” — localizados nos quatro cantos e subdivididos em 16 quadrados (“a”), sendo a area do subcompartimento “a” igual & area do compartimento A dividida pelo nimero de subcompartimentos em A, ou seja, a = 1/16 = 0,0625 mm?; “B” — localiza- dos entre os compartimentos “A” e subdivididos em 20 quadrados (“b”), sen- do a area do subcompartimento “b” igual & area do compartimento A dividi- da pelo ntimero de subcompartimentos em B, ou seja, a = 1/20 = 0,05 mm?; e “C” — localizados no centro e subdivididos em 25 quadrados (“c”), sendo a area do subcompartimento “c” igual a area do compartimento A dividida pelo néimero de subcompartimentos em C, ou seja, a = 1/25 = 0,04 mm?. 0 subcompartimento “c” ainda é dividido em 400 quadrados (c’), sendo a drea do subcompartimento c’ igual & do compartimento A dividida pelo ntimero de subcompartimentos em c, ou seja, a = 1/400 = 0,0025 mm? (Tanaka, 1987).Produgdo, determinagdo e calibragdo da concentragdo de inéculo em suspensdo 109 & A A A — ac=— , 4c 20 25 400 vane N° médio de esporos em A x 1,0 x 10° N° médio de esporos em a x'\,6 x 10° N° médio de esporos em b x 2,0 x 10 N° médio de esporos em ¢ x 2,5 x 10 N° médio de esporos em ¢” x 4,0 x 10 = esporos/mL. Figura 4.2 - Esquema de um hemacitémetro tipo Neubauer: lamina retangular em forma de “H” (I), compartimentos (A, B e C) e subcompartimentos (a,b e c) da lamina (II).110 Alfenas, Zauza e Mafia Controle de volocidade do agitador Controle de altura do aaitador. Botées para ligar o desigar Visor de focaizagio Boles de controle da foco “Terminal de dads Visor do cristal liquide “Tectado numérico cursor Tedlado Figura 4.3 - Esquema de um contador de esporos ou particulas tipo Coulter 22. Fonte: Beckman Coulter 1 ‘A dea dos compartimentos A = B = C é de 1 mm? ea profundidade, de 0,1 mm, Assim, tem-se um volume de 0,1 mm? = 0,00001 em? = 0,00001 mL. = 10+ mL, Logo, as formulas usadas para estimar a concentracao de esporos 40 obtidas da seguinte maneira: a) Numero médio de esporos no compartimento A: N° médio de esporos nos compartimentos A 104 mL, Concentragao de inéculo (Ci) imi Cj = (n° médio de esporos nos compartimentos A) x 10" Es eC“lll Producdo, determinagao e calibragdo da concentracdo de inéculo em suspensao b) O compartimento A é subdivido em 16 subcompartimentos “a”. Assim, para obter o ntimero médio de esporos em “a”, calcula-se: N° médio de esporos nos compartimentos “a” x 16 104 mL Concentracao de inéculo (Ci) ImL Ci = (n° médio de esporos nos compartimentos a) x (1,6 x 10°) c) O compartimento B é subdivido em 20 subcompartimentos “b”. Assim, para obter o ntimero médio de esporos em “b”, calcula-se: N° médio de esporos nos compartimentos “b” x 20 104 mL. Concentragio de inéculo (Ci) mL Ci = (n° médio de esporos nos compartimentos b) x (2,0 x 105) d) O compartimento C é subdividido em 25 subcompartimentos “c”. Assim, para obter o ntimero médio de esporos em “c”, calcula-se: N° médio de esporos nos compartimentos “c” x 25 104 mL Concentragao de inéculo (Ci) 1lmL Ci = (n° médio de esporos nos compartimentos c) x 2,5 x 105) e) O subcompartimento “c” é também subdivido em 400 subcompartimentos c’. Assim, para calcular 0 ntimero médio de esporos em c’, calcula-se: N° médio de esporos nos compartimentos c’ x 400 104 mL. Concentracao de inéculo (Ci) ImL Ci = (n° médio de esporos nos compartimentos c’) x (4,0 x 10) Para preparar uma suspensao de inéculo, proceda contagem de esporos, obedecendo aos cuidados descritos a seguir (Tanaka, 1987}: a) A suspensdo de esporos ou células deve ser agitada para que haja uniformi- dade e a alfquota tomada seja representativa. b) Recubra, cuidadosamente, a lamina com laminula apropriada e, enquanto sob agitagao, pipete a suspens4o com o auxilio de uma pipeta Pasteur ou micropipeta e aplique uma gota da suspenséo em um dos cantos da laminula. Incline a IAmina aos poucos, para que o liquido preencha os compartimentos, porém sem extravasar para as canaletas.112 Alfenas, Zaza e Mafia c) Uma vez preparada a lamina com a suspensao, aguarde 2 a 3 min antes de efetuar a contagem, a fim de que haja perfeita distribuigéo dos esporos. d) Muitos esporos ficam exatamente sobre as linhas de demarcacao internas dos subcompartimentos. Para evitar que eles sejam contados duas vezes, reco- menda-se a seguinte convengao: contam-se apenas os esporos que estiverem nas linhas da esquerda e superior do mesmo campo de observacao. Quando se trabalha com suspensdes mais dilufdas ou esporos grandes, recomenda-se efetuar a contagem em cada um dos quatro compartimentos ‘A’, calcular a média e utilizar para este modelo de hemacitémetro a [6rmula: Média do némero de esporos em “A” x 10! = y esporos/mL. Para esporos menores e suspensao ligeiramente mais concentrada, po- dem-se empregar os subcompartimentos “a”. Para isso, efetue a contagem em dois subcompartimentos “a” nos cantos diagonalmente opostos de cada quadrante, perfazendo um total de oito leituras. Calcule a média e aplique a formula: Média do néimero de esporos em “a” x 1,6 x 10° = y esporos/mL. Se a suspensdo de esporos for moderadamente concentrada, utilizam-se os compartimentos “B”. Recomenda-se efetuar contagens separadas em dois subcompartimentos (“b”) dos cantos, localizados em diagonal, e em um localiza- do na regio central. Calcula-se a média das trés contagens e aplica-se a formula seguinte: Média do ntimero de esporos em “b” x 2 x 10° = y esporos/mL. Para suspensées de esporos muito concentradas ou esporos pequenos, normalmente se usa 0 compartimento “C”, Recomenda-se efetuar contagens individuais nos quatro subcompartimentos “c” dos cantos e no do centro, Calcu- la-se a média das cinco contagens e aplica-se a formula: Média do ntimero de esporos em “c” x 2,5 x 10° = células/mL. 3.1.2 Contador automatico de esporos Este equipamento (Figura 4.3) possibilita contar e classificar automaticamente, quanto ao tamanho, células, esporos e particulas. O modelo Coulter 22 6 empre- gado para espécimes com dimensées na faixa de 1 — 120 mm. Ha, contudo, mo- delos mais caros que abrangem faixas abaixo de 1 mm e podem ser empregados para contagem de células bacterianas. Sua grande vantagem em relagao ao hemacitémetro é a rapidez e presiséo na quantificagao do inéculo em suspengao, principalmente quando se trabalha com um ntimero elevado de amostras.113 Producdo, determinagdo e catibragdo da concentragio de indculo em suspensio Ressalta-se, contudo, que é um aparelho de preco relativamente elevado e exige que a amostra nao contenha residuos que possam obstrur 0 orificio do tubo de leitura. A seguir sero apresentados os passos para utilizar 0 contador de esporos. 1) Prepare as amostras em solucgao de “Isoton NaC! 0,9%". Homogeneize a amostra e filtre-a em camada dupla de gaze para evitar impurezas 2) Retire 0 excesso da solucao de limpeza (Ifquido azul) do eletrodo e do tubo de abertura com a solucao Isoton, 3) Ligue o aparelho (Figura 4.3, botéo 1) e espere por 10s. 4) Desligue e ligue-o novamente para que o sistema possa ser acionado. 5) Com a amostra posicionada na plataforma mével (botao 2), pressione Setup no teclado (botao 3) e apareceré no visor (botéo 4) S1:Setup. Calibre o nivel superior e inferior utilizando 0 teclado numérico (botao 5) e os cursores (bo- to 6), de acordo com as dimensées do esporo. 6) Tecle Setup e aparecera $2:Setup e ajuste “Aperture Kd” para 57,06, utilizan- do o teclado numérico. 7) Tecle Setup até aparecer no viso $10: Setup. Com os cursores, ajuste o nt- mero de contagens a serem realizadas por amostra. 8) Tecle Start para iniciar a contagem. 9) No final, aparecerd no visor o ntimero total de esporos. Para mais detalhes, tecle Output e aparecerd o ntimero de esporos/mL, além do grdfico mostran- do a flutuacéo no tamanho dos esporos e algumas fungées estatisticas (mé- dia, mediana e moda) acessadas com os cursores. Ao ligar © aparelho, a limpeza do tubo de abertura automaticamente acionada. Assim, é recomendado ~ sempre apés a primeira leitura e caso se faca outra amostragem — realizar a limpeza do tubo. Para isso, tecle Function e seleci- one com o cursor Flush Aperture e tecle Start, Apés a limpeza, para fazer uma nova leitura, tecle Setup e em seguida Start. Caso ocorra entupimento do tubo de abertura, deve-se limpa-lo, Para isso, tecle Function, selecione Vent aperture e tecle Start, Em seguida, repita a opera- cao para a contagem de particulas. Realizada a contagem, desligue 0 aparelho e limpe os componentes que estavam em contato com a amostra, utilizando a solucao Isoton NaCl 0,09%. A seguir, deixe o tubo de abertura, 0 eletrodo e o agitador de repouso na solugao de limpeza (azul) até a proxima utilizagao.