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    9 a = Ps O ca Ss uu a < > Z < = ea’ FACIEN BIOLOGIA CELULAR EDITH MARIELA BURBANO ROSERO. SANDRA JAQUELINE MENA HUERTAS SANDRA LORENA ALVAREZ MARIA ELENA SOLARTE CRUZ GLADYS MILENA GUERRERO FLOREZ JULIO SOUZA WEICH LUZ ESTELA LAGOS MORA UNIVERSIDAD DE NARINO FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA 2017 [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR] EE Manual de laboratorio de biologia celular / Edith Mariela Burbano Rosero... [et al].~ Pasto: Editorial Universitaria ~ Universidad de Narifio, 2017, 79 pig. :i Contenido: Introduccién; Objetivos generales de la asignatura; Recomendaciones generales para el trabajo en laboratorio; Presentacién de informe de laboratorio - bitécora; practicas de Laboratorio, incluye referencias bibliograicas, gréficas ISBN: 978-958-8958-29-3 1LEstructure celular. 2. Moléculas constituyentes. 3. Laboratorios - normas Bioseguridad |. Mena Huerta, Sandra Jaqueline |. Alvarez Sandra Lorena ll. Solate Cruz, Maria Elena lV. Guerrero Florez, Gladys Milene V. Souza Weich, Julio VI. Lagos Mora, Luz Estele 574872 M292 ~ SCD ~E4.20 Biblioteca Alberto Quijano Guerrero BIOLOGIA CELULAR MANUAL DE LABORATORIO Edith Mariela Burbano Rosero, Sandra Jaqueline Mena Huertas, Sandra Lorena Alvarez, Maria Etena Solarte Cruz, Gladys Milena Guerrero Florez, Julio Souza Weich, Luz Estela Lagos Mora. Derechos reservados ©2017, Prohibida la reproduccién total o parcial de este material, sin autorizacion por escrito de la Universidad de Neri. ISBN: 978-958-8958-29-3 91I7895881958293 ~Universidad de Narifio~ 2 [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR) EE CONTENIDO INTRODUCCION OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO PRESENTACION DE INFORME DE LABORATORIO-BITACORA PRACTICAS DE LABORATORIO BIOSEGURIDAD UTILIZACION DEL MICROSCOPIO DE LUZ MEDICIONES MICROSCOPICAS MACROMOLECULAS DE LEVADURA. ACTIVIDAD ENZIMATICA OBSERVACION Y RECONOCIMIENTO DE CELULAS PROCARIOTAS DIFERENCIACION DE CELULAS VEGETALES: IDENTIFICACION DE CELULAS SANGUINEAS ACTIVIDAD DE LA MEMBRANA CELULAR SEPARACION Y ESPECTRO DE ABSORCION DE PIGMENTOS VEGETALES ACTIVIDAD DE LOS LISOSOMAS MITOSIS: MEIOSIS: Universidad de Narifio- [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR) EE 1. INTRODUCCION ‘Conociendo la organizacién y los procesos que se generan a nivel celular y sub-celularse puede comprender la fisiologia de todas las organizaciones vivientes desde virus hasta animales; un examen superficial de las estructuras y funciones celulares tipicas sugiere que de manera burda, las propiedades de todo organismo mutticelular son el reflejo de las propiedades de sus componentes celulares microscopicos; de alli la importancia del curso de biologia celular tanto para estudiantes de biologia como para disciplinas afines @ las ciencias biol6gicas, tal es el caso de las Ciencias agricolas, Ciencias pecuarias, Ciencias naturales y Ciencias de la salud, Por otra parte, la base histérica y modema de la biologia celular es la microscopia. Sin embargo, hoy en die los métodos microscépicos se han fusionado con los de la bioquimica, la genética y la biologia molecular para producir una perspectiva mas amplia en el estudio de las células como unidades vives y eficientes. La naturaleza dindmica de la célula es evidente por sus variadas respuestas a muchas clases de estimulos, su repertorio de mecanismos de regulacién para enfrentarse a un ambiente interno y externo constantemente cambiante, su actitud para funcionar sola o en conjunto con otras células, en el tubo de ‘ensayo 0 en el organismo, y por sus propiedades de renovacién, crecimiento, reproduccién y flexibilidad para la evolucion, El propésito de las practicas planteadas en este manual es entender las estructuras celulares y sus moléculas cconstituyentes. Para tal efecto cada protocolo propuesto describe en detalle la metodologia que se va 2 ejecutar, y mediante el reporte de la practica realizada (bitécora) motiva al estudiante a fundamentar bibliogréficemente las temiticas de cada una de ellas para poder comprender y analizar los fendmenos ‘observados durante su desarrollo y asi plasmar de forma coherente los resultados y conclusiones. Para lograr un mejor aprovechamiento del manual se sugiere que los estudiantes lean las practicas con anterioridad y hagan la revision literaria correspondiente a cada tematica, asi se comprenderén mejor los. resultados obtenidos durante su desarrollo y el estudiante tendré suficientes herramientas para hacer una discusion adecuada en su bitscora Los experimentos que aqui se incluyen estén diseniados para realizarse con el equipo de laboratorio con el ‘que cuenta nuestra universidad, la metodologia incluida esta centrada en el desarrollo de habilidades de ejecucién y de razonamiento que permitan al estudiante tener un buen desempefio en un laboratorio de biologia celular, fomentando ast, tanto el trabajo individual como colectivo. Ls autores “Universidad de Narifo- A [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR] EE 2. OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA © escribir ta estructura, composicién quimica y fsiologia de las células como un fundamento para la ccomprensién de los organismos vivos. WB complementary relacionar los conceptos presentados en la clase tedricn con las cbservacones patches © Entrenar en ta manipulaci del microscopio de uz (instrumentobisico para el estudio de a cul) ® Fomentar en el estuciante el desarrollo de hébitos adecuados para el trabajo en laboratorio siguiendo las normas de bioseguridad. Facilitar al estudiante el desarrollo de competencies cientificas mediante el sequimiento del método cientifico en todas las pricticas programadas. Universidad de Narifio- [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR) EE 3. RECOMENDACIONES INICIALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO © Noes permitida la entrada de los estudiantes después de iiciada la préctica de laboratoro, Log estudlantes deben estar en el laboratoto con varios riautos de aniipeden pare der lnicio a practca a la hora en programed © Laasistencia de los estudiantes es controlada por llamada 2 lista. Las sesiones de laboratorio no pueden ser recuperadas. @ Las clases practicas son basadas en el manual de laboratorio. Para un mejor aprovechamiento de las sesiones précticas, el estudiante debe haber leida el protocolo correspondiente con bastante tiempo de antelacién, © Una ver los estuctantes hayan recibido as instruciones para la préctica de aborstorio, deben actuar por inca propia ®@ Atfinal de cada practica de laboratorio, el estudiante debe responder las preguntas, después de haberias iscutido con los colegas del grupo de trabajo o haciendo uso de relevantes y pertinentes referencias bibliograficas. 1 cL grupo de estudiantes es responsable por el material (vidvieta, pinzas, Liminas, mierascoplo, ete) que se le he entregado al inicio de la préctica. Debe velar por el cuidado de los mismos, recordando que otros colegas utilizarén el mismo material para préximas practicas. “Universidad de Narifo- rf [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR] EE @G@6@6 @ 4, PRESENTACION DE INFORME DE LABORATORIO-BITACORA Elabore los informes siguiendo las instrucciones dadas por el profesor que dirige la practic. Ellenguaje debe ser claro, sucinto y objetivo. Los diserfos y graficos deben ser realizados con lineas firmes y con lépiz. Si usa colores para los dibujo, ellos deben ser fetes lo observado en laboratorio (no copiar los dibujos de ables, de medios audiovisuales 0 de sus colegas) Para cada experiencia de laboratorio se debe realizar un informe en su bitécora considerando el siguiente orden de los items: Titulo, Introduccién, Objetivos de la préctica, Metodologia realizada (narracién en pasado y en tercera persona), Resultados obtenidos (se incluyen dibujos biolégicos, graficas, tablas, esquemas y fotografias, etc), Discusion de resultados (debidamente referenciada y contrastade con literatura pertinente), Conclusiones, Recomendaciones, Referencias Bibliogréficas. “Universidad de Narifo- : [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR) EE 5. PRACTICAS DE LABORATORIO 5.1, BIOSEGURIDAD Biosegurided es el conjunto de acciones que se encuentran orientades a le prevencién, disminucién 0 {eliminacién de los riesgos inherentes a las actividades de investigacién, produccién, ensefianza, desarrollo tecnolégico y prestacién de servicios, las cuales pueden comprometer la salud del hombre, de los animales, del medio ambiente 0 de la calidad de los trabajos desarrollados. Los agentes biol6gicos son considerados de acuerdo con la patogenicidad para el hombre, la virulencia, el modo de transmisién, la endemicidad, la existencia o no de la profilaxis y de la terapéutica eficaz, Existen 4 grupos distintos: Grupo © Esta clase posee bajo riesgo individual y colectivo; @ Na constituyen riesgo para el medio ambiente: Grupo2 © Esta clase posee riesgo individual moderado y riesgo colectvo limitado. ® Microorganismos que pueden provocar enfermedades en el hombre, con poca probabilidad de alto riesgo para los profesionales de laboratorio, Ejemplos: Schistosoma mansoni, Wuchereria bancrofti y Sporothvix schenckii Grupo 3 © Esta clase posee riesgo individual elevado y riesgo colectivo bajo, puede causar enfermedades graves alos profesionales de laboratorio. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis, HIV y Trypanossoma cruzi Grupo 4 @ Esta clase agrupa los agentes que causan enfermedades graves para el hombre y representan riesgo serio para los profesionales de laboratorio y para la colectivided @ Posee agentes patogénicos altamente infecciosos que se propagan facilmente, pudiendo causar la ‘muerte rapidamente. Ejemplos: Virus Ebola; Lassa; Machup; Marbug, ‘AEROSOLES ~ Son macroparticulas sélidas o liquidas con dimensién aproximada de 0,1 y 501, que puede permanecer en suspension en condiciones viables por varias horas. Vias aéreas de penetracién Pipetaje, centrifugacién y abertura de la centrifuga en funcionamiento; Maceracién de tejidos, sonicacién, agitacién; flameo con asa de platina; @ Abertura de ampollas lioflizadas; @ Manipulacion de fuidos orgSnicos, abertura de frascos con cultivo de células Via de penetracién cuténea © picada con agujas contaminadas; @ vidrieria quebrada o fragmentada; ‘© Corte por instrumentos perforocortantes contaminados; Universidad de Narifio- [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR] EE Contaminacién via ocular @ Se presenta en recurrencia de ausencia de proteccién en los ojos por géticas de material infectante. @ Los cculares da micrcscopios e tnstrumantes dpticns contaminados pueden ser grandes fuentes de infeccion Contaminacién via oral @ Pipetaje conta boca; ® Habito de fumar, © comers as ues © Comer dentro del lboratorio. Proteccién ind @ Protector facial © Uso de bata de laboratorio de color blanco y botones © Gates de seguridad © Guantes de cirugia (Preferiblemente de nitriloy libres de talco) Pipeteador 0 pera @ Miscara idual Proteccién colectiva © Cabinas extractores 0 cabinas de flujo laminar, segin procedi Duchas para lavado de emergenca, Procedimiento de desinfeccién en caso de accidentes 1. Derramamiento simple de material liquido contaminado, con poca formacién de aerosoles (grupo de riesgo 1 y 2) ‘© Cubrir el rea afectada con papel toalla © Colocar el desinfectante apropiado sobre el papel ‘ Esperar por 30 minutos © remover los papeles con pinza y colocarlos en una bolsa pléstice usando guantes. © Aplicar nuevamente desinfectante 2. Derramamiento de material liquide contaminado con formacién de aerosoles. Ejemplo: gotas cayendo de la pipeta: ® Sostener la respiracion. © Abandonar el rea por algunos minutos @ Proceder como en el caso de derramamiento simple. 3, Caida de medio de cultivo liquido o sélido con quiebra de recipiente: @ sostener la respiracién ® Abandonar el rea @ atrancar la puerta colocando un aviso © Aguardar 30 minutos Universidad de Narifio- [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR] EE ® Certificarse de la naturaleza del microorganismo involucrado pera decidir sobre la proteccién necesaria y el desinfectante a ser utilizado. Consideraciones finales © Accidentes son causados por actos inseguros o condiciones inseguras; @ Nunca permanecer en un laboratorio sin un docente o técnico responsable. @ Reactivos quimicos o agentes patogénicos presentan mayores riesgos. © siempre tener en lugar visible los teléfonos de emergencia asi yo no sé algo??7?? PERGUNTAR ES LA e UNICA SOLUCION! Instrucciones de Laboratorio, reconocimiento y manipulacién del microscopio Orden 1, Organizar el material necesario para la practice, esto evita confusiones. 2. Use siempre el material de barrera necesario (bata de laboratorio, guantes, mascara, etc) 3. Marque cuidadosamente todo el material 4, Después de usar, lavar y limpiar, coloque todo el material en el lugar indicado. Limpieza 1. Después de usar, lavar la vidrieria y enjuagarta varias veces con agua limpia 2. Nodescartar el material usado en el avaranos 3._Deje el materialy el lugar de trabajo tan limpio como gustaria encontrario. Precauciones: 1. Siempre que ocurra un accidente en el trabajo, avise inmediatamente al profesor. Cuando caliente tuna sustancia en tubo de ensayo, no apunte la extremidad abierta para usted o para otras personas. Nunca pruebe una solucién, Si cualquier sustancia cae en su piel, lavar varias veces con agua corriente. Lea los rétulos de los frascos antes de usar las sustancias en ellos contenidas. ‘Cuando alguna sustancia cae en el piso o en la mesa de trabajo, impie inmediatamente el lugar. Cuando manipule el material de vidrio, proceda con cuidado para evitar quiebras y cortes peligrasos. 7. Sustancias inflamables deben ser calentadas en baflo maria o en estufa eléctrica. “Universidad de Narifo- a [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR) Aptitud: 1- Use el tiempo de laboratorio para realizar solamente el ejercicio indicado en la clase practca, 2 Lea antes de la clase las instrucciones para el ejercicio del dia 3. Siga todas las instrucciones cuidadosamente. 4- Registre los resultados en su bitécora de laboratorio ATENCION: CUALQUIER ACTITUD DEL ESTUDIANTE QUE COLOQUE EN RIESGO DE ACCIDENTE AL LABORATORIO O A SUS COLEGAS, IMPLICARA SANCIONES DISCIPLINARIAS. El personal de laboratorios de Biologia trabaja por definici6n con organismos vivos, algunos de los cuales pueden ser patégenos, otros son completamente inocuos. Evitar ta contaminacin, la infecciGn ola atraccion de los organismos de trabajo es un elemento primordial de la competencia profesional del personal. El laboratorio de biologia de la Universidad de Narifio se clsifica como un laboratorio basico con nivel de biosegurided minimo que sirve apara ensefianza bésica y el trabajo se hace en la mesa de laboratorio al Esto significa que et digmetro de la imagen ha Ocular = 6x. ‘aumentado 240 veces Objetivo x Ocular x Tubo | 6X x 40X x 1 = 240X » Preparacion de las muestras para observacion Los materiales que se van 2 observar se colocan sobre una pieza de vidrio llamada portaobjetos o lémina, y la mayoria de veces se cubren con una lamina de vidrio mas pequeria y delgada llamada cubreabjetos (0 laminilla). Ambas deben limpiarse muy bien antes de userse. 1. Montaje himedo de una placa para observar al microscopic: Con unas tijeras corte un pedazo de papel periddico (3 x 3 mm) que contenga una letra “a" 6 “e" (impresa por un solo lado); coléquelo fen el centro del portaobjetos y con un gotero deposite una gota de agua. Coloque luego el cubreobjetos sobre el papel. Para evitar que queden burbujas coloque el cubreobjetos de tal manera ‘que forme un angulo de 45° con el portaobjetos y déjelo caer lentamente. Si quedan burbujas ejerza presién suave sobre el cubreobjetos. 2. bina vez vercado que no hay burbujas en el montae realice una observacién de lz placa en el ‘objetivo de menor aumento (esto le permitiré realizar un enfoque adecuado de la imagen) y posteriormente realice el enfoque en 10X y 40X; realice los dibujos correspondientes a les imagenes ‘observadas en 10X y 40X 3. En cada uno de los dibujos que presente después de hacer una observacién en microscopio deberé incluir el aumento en el cual observe el material 4. Compare la posicién de la imagen de la letra que observé, con su posicién real en el portaobjetos. Se ve en a misma posicién? Explique el porqué de ese fendmeno. 5. Mueva el portaobjetos en direccién contraria a usted (orientacién hacia el brazo del microscopic). #En qué direccién se mueve la imagen? Por qué sucede esto? 6. Al sustituir el objetivo de menor aumento por el de mayor aumento, scambia la posicién de la imagen? Por qué? 7. Realice un montaje himedo de papel fotografico que le seré suministrado por el auxiliar de laboratorio, 8. Con respecto al montaje anterior, jcudl es la diferencia entre lo observado a simple vista y lo ‘observado al microscopio? «Qué poder es evidente en esta observacién? 9. Dibuje lo observado teniendo en cuenta las normas del dibujo biol6gico, 10. Con un hisopo 0 palillo raspe la superficie interna de le mejila y frotelo sobre un portaobjetos perfectamente limpio, fijarla placa mediante flameo. Agregue una gota de azul de metileno al 0.2% ‘durante 1 minuto, lave y seque la placa. Observe al microscopio con el objetivo de LOX. 40X y 100X. Dibuje 11. Desprenda un fragmento de epidermis de cebollz, depositelo en el portaobjetos cuidando que ‘quede completamente extendido. Coloque el cubreobjetos y por uno de los bordes, adicione cuidadosamente una gota del colorante lugol de Gram, que va entrar por capilaridad a la muestra ‘Observe con el objetivo de 10x y de 40X. Dibuye. “Universidad de Narifo- Pa [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR] EE [TARE Esquematice las células de las muestras observadas con el objetivo escogido por el docente, enotando el nombre de la célula, los componentes celulares icentificados, asi como el aumento total empleado (para lo ‘cual se multiplica el aumento del objetivo por el eumento del ocular) Con base en sus resultados y tomando como guia los siguientes enunciados, redacte la discusi6n de la prictics 1. Indique la importancia del microscopio de campo claro en la investigacién cientifica 2. Que importancia tiene realizar la iluminacién de Kohler? 3. {Que cuidados hay que tener al utilizar el aceite de inmersion? 4. Indique los componentes celulares que haya observado en esta practica en cada muestra Esquematice siguiendo las normas para dibujo biolégico. 5. Diga las diferencias y semejanzas que hay entre las células animales y vegetales. 6. Al sustituir el objetivo de menor aumento por el de mayor aumento, jcambia la posicién de la imagen? ;Por que? 7. {Se logré el objetivo de la Practica? {Por qué? Bibliografia 1. Barrera-Escorcia H, Cérdenas-Reygadas, R. 1997. £1 Microscopio Optica Plaza y Valdés Editores, México, DF 2 Ducolomb Wvone, Fierro, Reina, Gonzdlez. Cristina, Ortiz Rocio, Rodriguez, Emesto. Manual de Practicas de Laboratorio de Biologia Celular. 2012. Division de Ciencias Biolégicas y de la Salud. Universidad AutSnoma Metropoltens. Unided itapalaca. México, 3. Karp, 6.2008. B/ologia celular y molecular: conceptes y experimentos. McGraw-HiV/Interamericana. México. 4. Keller, € Goldman, 0. R. 2006. Light Microscopy. En: Basic Methods in Microscopy. Protocols and Concepts from Cells: 5. Laboratory Manuel. Spector 0, Goldman RD eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York 6. Pita-Lpez, Carmen. Contenido Didactico del Curso de Biologia 210101. 2013, Universidad Nacional Abiertay ‘a Distancia UNAD. 300 pigiras, 7. Zeiss, 203 Car Zeiss Light Microscopy. Instrucciones de manejo Axiostar Plus. Microscopio de lu transmitids y FL wnnwaess.e/micoo “Universidad de Narifo- x [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR) EE 5.3, MEDICIONES MICROSCOPICAS La unidad de longitud més frecuentemente utilizada en microscopia es la micra (um) y equivale a una milésima de mitimetro (1 um = 10%m 6 0,001mm). Gran cantidad de objetos que los bidlogos estudian con ‘el microscopio tienen forma y tamafios definidos. Para hacer observaciones cuantitativas de esas caracteristicas es necesario utilizar el micrometro. Sino se cispone de este aparato, se debe tener una manera de medirias utilizando el microscopio para medir objetos de tamafio tan pequefio que es imposible hacerto con regla Muchos estudiantes confrontan la dificultad para encontrar y estudiar debidamente un espécimen, por ‘cuanto lo buscan y lo observan usando demasiado aumento. Los objetivos de alta potencia no son superiores 2 los de baja potencia, solo porque magnifican més. Los especimenes grandes se ven perfectamente con bajos aumentos. Trate siempre de localizar el espécimen con el objetivo de menor aumento (3X 6 4X) y luego si es necesario vaya aumentando consecutivemente la observacin con el objetivo siguiente. Objetivos Estimar las dimensiones del campo del microscopio para los objetivos de menor y mayor aumento Relacionar el tamafto del campo del microscopio con los objetos observados Materiales y reactivos Microscopio Porta y cubreobjetos Lugol Solucién limpialentes Cultivo de levadura Lancetas (1 por grupo) CCapsula de vidrio Solucién cristal violeta para coloracién de Gram Hojas de Elodea* Tela ojo de pescado o papel limpialentes* Papel de revistat Lapiat Gotero" Guantes* Tijeras Pinzas (depilador)* Bisturi o cuchills de afeitar* ‘Compas Calculadora* Papel toalla* Marcador de vidriot Jabén antibacterial para lavado de manos* *Los materiales sefialados con asterisco deben ser suministrados por los estudiantes. “Universidad de Narifo- es [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR] EE Procedimiento 1. Determinacién del aumento total para cada objetivo El aumento total para cade objetivo es calculado multiplicando el aumento del lente ocular por el ‘aumento del lente objetivo x el lente del tubo (si el tubo de su microscopio sefiala que tiene aumento), Calcule el aumento total pare cada uno de los objetivos de su microscopio. ‘OBJETIVO LENTE OCULAR | _LENTE OBJETIVO | AUMENTO TOTAL De exploracién De bajo poder De alto poder De inmersion 2. Calculo del diametro del campo visualy drea del campo El campo de visiGn de un microscopio es la zona circular que se delimita al observar a preparacion bajo un determinado aumento. Para medi el campo de visién de un microscopio, se debe usar una Unidad llamada micra. Una micra equivale 2 0,001 mm; en otras palabras, hay 1000 micras en un rmilimetro. 1 didmetro de este campo es su medida. Utilice la férmula para determinacién del digmetro del campo visual para cada uno de los objetivos, realice la conversion respectiva en micras. Didmetro del Campo visual para un objetivo X en mmz= ICV/Aobjetivo x q 2: puede ser cualquier objetivo 1 Indice del cmpo ual ‘Achjetive: Aumento del objeto prac de tubo. Teniendo como base el diémetro del campo visual, determine el érea del campo visual de su microscopio, usando la formula Area del campo visual=Ttr? El aumento de los objetivas es inversamente proporcional a los didmetros de sus campos, compruebe esto efectuando los calculos respectivos, 3. Estimacién del tamafio celular utilizando el micrémetro Para medir células y otras muestras al microscopic, es necesario utilizar une regla, al igual que para ‘medir objetos mayores. Con este fin, se utiliza una regla dividida en unidades (Figura 10) que se ‘encuentra en un ocular micrométrico. Las divisiones tienen una longitud indeterminada por lo que ‘es necesario medias con una regla de unidades conacidas. Antes de realizar la medicion microsc6pica de longitudes hay que averiguar el valor del micrémetro ode la escala de la combinacién de objetivo/plaquita para el ocular empleado (Figura 11), “Universidad de Narifo- = [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR] EE ocular regilla Figura 11. Combinacién de las escalas de objetivo y placa para el objetivo empleado. Fuente: Los autores, En el preparado, este valor de escala es exactamente el trayecto que equivale a una subdivision de scala del micrémeteo reticular equipado en el ocular. Para la calibracion, las escalas de micrémetro de objeto y del micrémetro reticular se posicionan paralelamente entre si para el efecto girar el ocular, y se ponen a coincidir con suma exacttud las lineas de cero de ambas escalas (Figura 12) Si por ejemplo, tal y como se evidencia en la figura 11, 99 subdivisiones de escala (10 ym cada una) del micrémetro de objeto equivalen a exactamente 1100 subdlvsiones de escala del micrémetro reticular, entonces para la combinacién de objetivo y Plaquita para ocular utilizada (Objetivo A-Plan 10x/0,25 y mictOmetro reticular 10:100) resulta un valor de escala K’ de: K’= (99/100) x 10 uM = 9,9 pM Después de cambiar el micrometro de objeto por el preparado que ha de ser medido, el trayecto de ‘medicin L buscado se calcula multiplicando la cantidad de subdivisiones de escala del micrémetro reticular para oculares (supuestas les décimas) por el valor de escala K’, de lo cual se obtiene un resultado, por ejemplo: L= 35,5%9,9 uM = 351,5 uM Las estructuras de grande tamafio de los preparados también se pueden determinar usando las escalas de nonios (0,1 mm) dispuestas en ta platina en cruz. Para obtener el trayecto de medicién deseado eventualmente se debe realizar un célculo matematico con base en las direcciones X y ¥ (Pitagoras) (Figura 12). ~Universided de Nerifio~ a [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR) EE hd iid o6 8 29S + feb oO oO wu Figura 12, Medicién de longitudes. Fuente: Modificada por los autores de Keller E. Goldman, 0. R 2006. instrucciones de manejo del microscopio Axiostar Plus. Microscopio de luz transmitida. En_ nuestro caso, para medir longitudes microscépicas con el microscopio Axiostar Plus disponible en el laboratorio, se necesita el micrémetro reticular para oculares 10: 100, d=26 mm (Figura 13). Micrometro reticular 10:100/ d= 26 mm Cédigo: 474066-9901-000 Longitud de escala = 10 mm Subdivision de escala = 0,1 mm Error de subdivisién < 0,001 mm. Figura 13. Micrémetro reticular 10:100/ d= 26 mm usado en el laboratorio para determinacién del tamajio celular. Fuente: Los autores, “Universidad de Narifo- a [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR] EE Para realizar la medici6n de las células de la levadura y eritrocitos, entonces: 1. Cuente las lineas desde el punto cero y cuente el rnimero de divisiones que tiene 2. Multiptique por el valor de la subdivsién respectiva y divida ese valor por el aumento real det microscopic (ocular x objetivo) 3. EL valor es dado en mm, multiplicamos por 1000 para reportar el valor en micras. Preparaciones en fresco 1. Realice un montaje hiimedo de células de elodea, observe en aumento de 10X y 40K. Estime el tamafio aproximado de las células de elodea, teniendo en cuenta los datos encontrados con respecto al microscopio utiizado (diémetro y area del campo visual). Deduzca los calculos, respectivos para la determinacién del tamaiio celular en la preparacién de epidermis de cebolla inicamente. 2. En.una cépsula de vidrio colocar § mL. de reactivo diluido (1/10) de cristal violeta (utlizedo para coloracién de Gram), adicionar Iml de células de levadura Saccharomyces cerevisiae previamente crecida en caldo, homogenizar y colocar una gota en el portaobjetos para ser observada bajo el rmicroscopio. Estime el tamatio aproximaco de las células de levadura, teniendo en cuenta los datos del micrometro del microscopio que utilizar’ para esta medicidn (Longitud de escala 10 mm, subdivision de escala 0.1 mm, error de subdivision = 0,001 mm). 3. Realice un montaje de células sanguineas (eritrocitos). Observe en aumento de 10X y 40X. Estime el tamafio de los eritrocitos usando el micrémetro. GD e.rcneie 1. Esquematice las células de la muestra observeds indicando las mediciones realizadas con los objetivos escogidos por su docente, anotando el nombre de la cétula, los componentes celulares identificados, ast como el aumento total empleado (para lo cual se multiplica el aumento del objetivo por el aumento del ocular Con base en sus resultados y tomando como guia los siguientes enunciados, redacte la discusi6n de la practica 2. gCual es la importancia de la calibracién en el microscopic? 3. Alobservar una misma célula 2 10X y a 40K. @Hay variaciones en cuanto a sus medidas? Si las hay, @2 qué pueden deberse? “Universidad de Narifo- Pa [MANUAL DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR) EE 4. ¢Puede calibrarse el microscopio para observar muestras con el objetivo de 100X o cualquier otro ‘objetivo diferente a los de 10X y 40x?

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