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Mayolo-Deloisa, K. P.; Rito-Palomares, M. PROTENAS PEGILADAS: PRODUCCIN, PURIFICACIN Y APLICACIONES Revista Mexicana de Ingeniera Qumica, vol. 9, nm. 1, 2010, pp. 17-27 Universidad Autnoma Metropolitana - Iztapalapa Distrito Federal, Mxico
Disponible en: http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=62016243003

Revista Mexicana de Ingeniera Qumica ISSN (Versin impresa): 1665-2738 amidiq@xanum.uam.mx Universidad Autnoma Metropolitana - Iztapalapa Mxico

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Revista Mexicana de Ingeniera Qumica

Vol. 9, No. 1 (2010) 17-27
PROTE INAS PEGILADAS: PRODUCCION, PURIFICACION Y APLICACIONES PEGYLATED PROTEINS: PRODUCTION, PURIFICATION, AND APPLICATIONS
K. P. Mayolo-Deloisa y M. Rito-Palomares* Departamento de Biotecnolog e Ingenier de Alimentos, Centro de Biotecnolog a a a-FEMSA, Tecnolgico o de Monterrey. Campus Monterrey, Ave. Eugenio Garza Sada 2501 Sur, Monterrey, NL 64849, Mxico. e Recibido 7 de Noviembre 2009; Aceptado 15 de Febrero 2010 Resumen La PEGilacin es la conjugacin de una prote y/o pptido con una o ms molculas de poli(etilen o o na e a e glicol). El poli(etilen glicol) es un pol mero no txico, no inmunognico y est aprobado por la FDA (Food o e a and Drug Administration, USA). En los ultimos aos, la PEGilacin ha sido utilizada para mejorar las n o propiedades sicoqu micas de prote nas y drogas teraputicas, por lo que esta tecnolog ha impactado e a fuertemente a la industria bio-farmacutica. La PEGilacin permite prolongar el tiempo de residencia e o en el cuerpo, mejorar la estabilidad, aumentar la solubilidad, disminuir la protelisis y excrecin renal. o o Desde el surgimiento de esta tecnolog diferentes prote a, nas han sido PEGiladas para el tratamiento de enfermedades como: hepatitis C, leucemia, artritis reumatoide, etc. Este art culo de revisin presenta una o descripcin del desarrollo de la PEGilacin en los ultimos aos, as como de los procedimientos usados o o n para la produccin de bio-conjugados. Adems, se revisan las estrategias de puricacin utilizadas para la o a o recuperacin de prote o nas PEGiladas, siendo este uno de los grandes retos en el proceso debido a que la reaccin de PEGilacin puede generar bio-conjugados con diferentes grados de PEGilacin. Por ultimo, se o o o presentan las aplicaciones de dichos bio-conjugados y los retos futuros que se identican para su aplicacin o genrica. e Palabras clave: PEG, PEGilacin, prote o nas teraputicas, bio-conjugados. e Abstract PEGylation is the covalent attachment of protein and/or peptide to poly(ethylene glycol). The poly(ethylene glycol) is a polymer, non toxic, non immunogenic, and FDA (Food and Drug Administration, USA) approved. In the last years, PEGylation has been used to improve the physicochemical properties of some proteins and therapeutic drugs; this technology has impacted heavily on the bio-pharmaceutical industry. PEGylation prolongs the body-residence time and stability, decreases the proteolysis and renal excretion. Since the emergence of this technology, some proteins have been PEGylated for the treatment of diseases including hepatitis C, leukemia, rheumatoid arthritis, etc. This review presents a description of the PEGylation development in the last years and the chemical procedures used to obtain some bio-conjugated products. Strategies of purication used to obtain PEGylated proteins are reviewed; purication is one of the major problems to establish suitable processes due to the fact that the reaction can generate bioconjugates with dierent degree of PEGylation. Finally the applications of PEGylated proteins and the future challenges that are identied for generic application are presented. Keywords: PEG, PEGylation, therapeutic proteins, bio-conjugates.

* Corresponding author. E-mail: mrito@itesm.mx Tel: (52) 81 8328-4132, Fax: (52) 81 8328-4136

Publicado por la Academia Mexicana de Investigacin y Docencia en Ingenier Qu o a mica A.C.

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K. P. Mayolo y M. Rito/ Revista Mexicana de Ingenier Qu a mica Vol. 9, No. 1 (2010) 17-27

1.

Introduccin o

a)

H(OCH 2CH2)nOH

La revolucin biotecnolgica y nanotecnolgica o o o ha producido novedosos pptidos y prote e nas que estn siendo utilizados como nuevas drogas para a el trata-miento del cncer y de diversas enfera medades (Harris y Chess, 2003; Parveen y Sahoo, 2006). Algunas tcnicas han sido desarrole ladas para mejorar las propiedades teraputicas e de dichas macromolculas, stas incluyen la ale e teracin de la secuencia de aminocidos para reo a ducir su degradacin o la fusin de pptidos con o o e inmunoglobulina o albmina para incrementar la u vida media. Hasta ahora, la tcnica ms exitosa e a ha sido la conjugacin de pptidos y/o prote o e nas a una o varias cadenas de poli(etilen glicol) (PEG), llamada PEGilacin (Ryan y col., 2008). o El trmino PEGilacin ha sido utilizado dese o de 1977 despus de que Abuchowsky y colaboe radores describieran por primera vez un mtodo e para adherir covalentemente una o varias molcue las de PEG a una prote (Abuchowsky y col., na 1977). El PEG es un politer lineal o ramicado e con un grupo hidroxilo en cada extremo (Fig. 1), este pol mero es altamente soluble en agua as co mo en varios solventes orgnicos y est aprobado a a por la FDA para su administracin en seres huo manos (Morar y col., 2006; Wattendorf y Merkle, 2008). Muchos de los benecios de la PEGilacin o de prote nas estn ligados a las propiedades del a PEG. El PEG es inerte, no txico y no inmunogo e nico, adems es fcilmente desechado por el cuerpo a a a travs del rin (pesos moleculares del pol e no mero menores a 20 kDa), o del h gado (pesos moleculares arriba de 20 kDa) (Morar y col., 2006). La conjugacin de PEG con una prote geno na eralmente mejora sus propiedades debido a que aumenta su vida media, causa una reduccin del reo conocimiento de la prote por el sistema inmune, na aumenta su resistencia al ataque proteol tico, aumenta su solubilidad y estabilidad (Fig. 2). La mayor de estos fenmenos pueden ser explicaa o dos debido a la expansin del radio hidrodinmio a co del conjugado prote na-PEG como un resultado de la capacidad del PEG de coordinar numerosas molculas de agua y de la alta exibilidad de la e cadena polimrica (Gaberc-Porekar y col., 2008). e Existen varios mtodos qu e micos y enzimticos a para llevar a cabo la PEGilacin (Veronese y Pao sut, 2005). El primer paso en el proceso es la activacinde la molcula de PEG, la modicacin o e o de PEG ms utilizada es el metoxi-PEG (mPEG) a (Fig. 1) (Hamidi y col., 2006). El PEG activado puede ser ligado a un sitio espec co de las prote nas, frecuentemente sobre un grupo amino, 18

b)

CH3(OCH 2CH2)nOH (OCH OH

O

mPEG PEG c) mPEG O

CH 2 NH (CH2 ) 4

C
O

N
H

OH

Fig. 1: Frmulas estructurales del poli(etilen)glicol o (PEG). a) PEG, b) metoxi-poli(etilen glicol) lineal (mPEG) y c) mPEG ramicado (tomado de Hamidi y col., 2006).

suldrilo u otro grupo nucleof lico. En muchos casos, el sitio preferido para la modicacin es el o grupo amino de la lisina o el grupo amino Nterminal de la cadena polipept dica (Veronese y Pasut, 2005; Hamidi y col., 2006). Sin embargo, la PEGilacin del grupo amino genera un alto o nmero de ismeros lo que diculta en gran mediu o da el siguiente paso en el proceso de PEGilacin, o la puricacin de los conjugados (Veronese y Pao sut, 2005). Debido a los costos extremadamente altos de los procesos de produccin de prote o nas teraputicas, uno de los retos en la ingenier de la e a reaccin de PEGilacin es generar reacciones sitioo o espec cas lo ms ecientes posibles, que produza can un solo conjugado sin alterar las propiedades sicoqu micas de la prote de inters. na e La puricacin de prote o nas PEGiladas envuelve la remocin de todas las especies moleco ulares que no sean parte del producto de inters, e que pueden incluir a la prote no modicada y na a la prote con diferentes grados de PEGilacin na o (mono-, di-, tri-, etc.). Actualmente los procesos de puricacin de prote o nas PEGiladas estn doma inados por la cromatograf de exclusin molecular a o e intercambio inico. Otros mtodos tambin han o e e sido utilizados aunque con menor frecuencia, ejemplos de ellos son la cromatograf en fase reversa a y la cromatograf de interaccin hidrofbica, ula o o traltracin, electroforesis, electroforesis capilar, o dilisis, sistemas de dos fases acuosas, etc. (Dela gado y col., 1997; Fee y Van Alstine, 2006). Desde el surgimiento de la PEGilacin, un gran o nmero de prote u nas han sido PEGiladas en ellas se incluyen: factores de crecimiento, adenosin des-

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K. P. Mayolo y M. Rito/ Revista Mexicana de Ingenier Qu a mica Vol. 9, No. 1 (2010) 17-27 PEG son dos variables que limitan el proceso; por ejemplo, PEGs ramicados incrementan el peso molecular de la prote mono-PEGilada, pero na tambin pueden limitar la disponibilidad estrie e ca del sitio de PEGilacin. Adems, otros factores o a como el tiempo de reaccin, pH, temperatura, cono centracin de PEG y prote deben ser tomados o na en cuenta (Gaberc-Porekar y col., 2008). En una reaccin t o pica, un PEG activado se hace reaccionar con uno o ms residuos de lisina o a con el grupo amino N-terminal. La PEGilacin de o otros sitios nucleof licos tales como ciste na, histidina, arginina o tirosina tambin son posibles. e Por otro lado, es posible utilizar enzimas que se encarguen de la conjugacin de la prote con el o na PEG. Al llevar a cabo la reaccin, la solucin de o o prote es mezclada con el PEG activado bajo na condiciones de pH, temperatura y agitacin cono troladas. Las molculas de prote mono-PEGilae na das con los sitios ms reactivos son las primeras a en formarse, los sitios menos reactivos forman las especies di-PEGiladas y as sucesivamente (Morar y col., 2006).

Incremento de la solubilidad debido a la hidrofilicidad del PEG

Incremento en el tamao

Protena

Disminucin de la accesibilidad de enzimas proteolticas y anticuerpos

PEG

Fig. 2: Ventajas de la PEGilacin. La gura repo resenta la conjugacin de una prote con varias o na molculas de PEG (modicado de Veronese y Pae sut, 2005).

aminasa, asparaginasa, interferones, ribonucleasa A, albmina de suero bovino, -lactoalbmina, u u entre otras. Muchas de ellas estn siendo utia lizadas en el tratamiento de enfermedades como: leucemia, artritis reumatoide, hepatitis C, acromegalia, etc. (Veronese y Pasut, 2005; GabercPorekar y col., 2008). A pesar de que en los ultimos aos los tra n bajos en el desarrollo de los procesos de PEGilacin se han intensicado notablemente, an no o u se han encontrado mtodos ecientes que eleven e el rendimiento en la recuperacin de los produco tos bio-conjugados y disminuyan los altos costos de produccin. La ingenier qu o a mica y bioqu mica juegan un papel fundamental en el diseo de reacn ciones en donde se controle el sitio de PEGilacin o de manera que se evite la generacin de prote o nas multiPEGiladas. Otra rea de oportunidad es la a ingenier de bioseparaciones de prote a nas PEGiladas, puesto que an no se han encontrado proceu sos que puedan ser aplicados de manera genrica e en la etapa de puricacin. o El objetivo de este art culo es el de presentar un panorama general del estado del arte en cuanto a la reaccin de PEGilacin, las estrategias o o de puricacin utilizadas para la recuperacin de o o prote nas PEGiladas, las aplicaciones y los retos futuros que se identican en el desarrollo de dichos conjugados prote na-pol mero.

2.1.

Modicacin del grupo amino o

2.

Reaccin de PEGilacin: o o produccin de prote o nas PEGiladas

Para llevar a cabo la reaccin de PEGilacin, se o o deben tomar en cuenta varios factores que incluyen el objetivo por el cual una prote debe na de ser PEGilada. La estructura y el tamao del n

La modicacin qu o mica ms comn para llevar a u a cabo la reaccin de PEGilacin se da en los o o grupo -amino de los residuos de lisina, a travs de e alquilacin o acilacin (Fee y Van Alstine, 2006; o o Veronese y Mero, 2008). La alquilacin mantiene o la carga positiva del grupo amino, mientras que la acilacin genera una prdida de la carga deo e bido a la formacin de una amida (Veronese y o Mero, 2008). En una prote t na pica las lisinas constituyen el 10 % del total de los aminocidos, a su disponibilidad hace que la conjugacin sea seno cilla; sin embargo, el gran nmero de sitios preu sentes para la conjugacin diculta la posibilidad o de obtener un nmero espec u co de aductos por lo que es muy comn que se generen mezclas de u PEGmeros. Una forma de controlar la reaccin a o es cambiar el pH, a valores altos de pH (arriba de 8.0) se favorece la conjugacin con los gruo pos -amino de las lisinas presentes, mientras que una reaccin a pH cido favorece el enlace con el o a grupo amino N-terminal (Gaberc-Porekar y col., 2008). Los agentes para la modicacin de grupos o amino incluyen: mPEG-diclorotriazina, mPEGtresilato, mPEG-succimidil carbonato, mPEG-Nhidroxisuccimida, mPEG-propilaldeh do, mPEGp-nitrofenil-carbonato, etc. (Roberts y col., 2002; Veronese y Mero, 2008). En la Fig. 3, se muestra una de las reacciones ms utilizadas para llevar a a 19

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K. P. Mayolo y M. Rito/ Revista Mexicana de Ingenier Qu a mica Vol. 9, No. 1 (2010) 17-27 ina como sustrato, llamadas transglutaminasas (Veronese y Pasut, 2005). Sato (2002) report que o la glutamina de las prote nas puede ser el sustrato de la enzima transglutaminasa, si un PEG-amino es usado como donador nucleof lico, por lo que el PEG puede ser ligado a la prote a travs de un na e residuo de glutamina. La reaccin para la produccin de prote o o nas PEGiladas juega un papel fundamental en el proceso de PEGilacin, los productos que se obtienen o son a) la prote na en sus diferentes grados de PEGilacin, b) el PEG en exceso y c) la prote o na que no logr reaccionar. El conocimiento de la o estructura primaria de la prote es fundamenna tal, el uso de herramientas como la bioinformtica a pueden ayudar a predecir los sitios de PEGilacin o y las posibles consecuencias sobre la estructura tridimensional, adems de facilitar el proceso de a puricacin. A pesar de que la PEGilacin de o o ciste nas genera mezclas menos complejas, sigue siendo ms utilizada la PEGilacin de los grupos a o amino debido a que las ciste nas son aminocidos a que generalmente participan en el sitio activo o en la conformacin de la estructura tridimensional, o lo que en muchas ocasiones afecta negativamente a la prote na. El diseo de la reaccin debe de n o ser espec co para la prote de inters, depenna e diendo de sus propiedades sicoqu micas y de su aplicacin. o

O mPEGOCH 2CH2CH
1) ProtenaNH2 2) NaCNBH3

mPEGOCH 2CH2NHProtena

Fig. 3: Modicacin del grupo amino que o mantiene la carga positiva del residuo de la prote na (tomada de Veronese y Mero, 2008).
O
+ ProtenaSH

O S Protena

mPEG

mPEG

Fig. 4: Modicacin sitio-espec o ca de ciste utina lizando mPEG-maleimido (tomada de Veronese y Mero, 2008).

cabo la modicacin del grupo amino N-terminal, o en dicha reaccin el aldeh interacciona con la o do amina para producir una base de Schi que nalmente es reducida a una amina secundaria estable (Veronese y Mero, 2008).

2.2.

Modicacin o ciste nas

de

residuos

de

3.

Los pol meros utilizados para la modicacin o de ciste nas incluyen a: mPEG-maleimido (Fig. 4), mPEG-iodoacetato, mPEG-tiol, mPEGvinilsulfona y mPEG-piridildisuldo. La PEGilacin sitio-espec o ca de residuos de ciste rara na vez se lleva a cabo, debido a que este aminocido, a cuando est presente, se encuentra participando a en los enlaces disulfuro o es requerido para la actividad biolgica (Vero-nese y Mero, 2008). En o ausencia de ciste nas libres en la prote natina va, una o ms ciste a nas pueden ser insertadas por ingenier gentica; sin embargo, en ocasiones se a e pueden generar puentes disulfuro incorrectos y por lo tanto la dimerizacin de la prote (Roberts y o na col., 2002; Veronese y Mero 2008).

Estrategias de puricacin o de prote nas PEGiladas

2.3.

PEGilacin especca utilizando o enzimas

La conjugacin espec o ca de PEG al grupo amido de una glutamina o al grupo hidroxilo de las serinas y treoninas es solo posible utilizando enzimas. Existen enzimas que reconocen a la glutam20

La puricacin de prote o nas PEGiladas consiste en remover todas las especies que no formen parte del producto de inters, lo que involucra dos retos e principalmente: 1) la separacin de las prote o nas PEGiladas del resto de los productos de la reaccin y 2) el sub-fraccionamiento de las prote o nas PEGiladas en base al grado de PEGilacin y a o los ismeros posicionales o PEGmeros. La purio a cacin se complica debido a que no solo se deben o tomar en cuenta las caracter sticas de la prote na, tambin la naturaleza amptica del PEG afecta e a fuertemente al proceso de separacin (Fee y Van o Alstine, 2006). En la Tabla 1 se muestran algunos de los mtodos utilizados para la separacin de e o prote nas PEGiladas. En esta Tabla 1 es evidente que PEG de distintos pesos moleculares han sido utilizados para la obtencin de productos PEGilao dos. Adicionalmente, se ha documentado que para la recuperacin de las prote o nas PEGiladas, mtoe dos cromatogracos y no-cromatogracos han demostrado su factibilidad.

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K. P. Mayolo y M. Rito/ Revista Mexicana de Ingenier Qu a mica Vol. 9, No. 1 (2010) 17-27 Tabla 1. Mtodos de separacin utilizados para la puricacin de prote e o o nas PEGiladas. Prote na Factor de crecimiento epidrmico e Factor de crecimiento epidrmico e -interferon 2b PEG Intron R (Shering-Plough) -interferon 2a PEGasys R (Homan-La Roche Inc.) -interferon PEG (PM, kDa) 3.4 2.5 12 40 Mtodo(s) de puricacin e o Exclusin molecular , fase o reversa y ultraltracin o Dilisis y liolizacin a o Intercambio catinico y o exclusin molecular o Intercambio catinico o Referencia Lee y Park, (2002) Kim y col., (2002) Wang y col., (2002) Reddy y col., (2002)

20

Insulina -lactoalbmina u -lactoglobulina Albmina de suero bovino u Hemoglobina Insulina Ribonucleasa A Factor estimulador de colonias de granulocitos
PM, peso molecular

750 Da 2,5 10 20, 40 5 2y5 20 10, 20, 30

Intercambio catinico, ulo traltracin y exclusin o o molecular Exclusin molecular o Exclusin molecular o

Arduini y col., (2004)

Calceti y col., (2004) Fee y Van Alstine (2004)

Exclusin molecular y fase o reversa Dilisis, a intercarbio catinico y fase reversa o Interaccin hidrofbica o o Exclusin molecular, fase o reversa e intercambio inico. o

Li y col., (2006) Dou y col., (2007) Cisneros-Ruiz y col., (2009) Zhai y col., (2009)

3.1.

Mtodos cromatogrcos e a

Histricamente, la cromatograf de exclusin o a o molecular (Size Exclusion Chromatography, SEC) ha sido ampliamente usada para la separacin de o productos PEGilados debido al signicativo incremento del radio hidrodinmico de los conjugaa dos comparado con las especies nativas. El poder de resolucin de la cromatograf de exclusin o a o para diferentes especies PEGiladas no es muy alto (Fig. 5). Esta tcnica es inherentemente inadecuae da para resolver mezclas de ismeros que tienen o el mismo nmero de cadenas de PEG ligadas a u la prote na, pero en diferentes sitios (GarbercPorekar y col., 2008). La cromatograf de intercambio inico (Iona o Exchange Chromatography, IEC) ofrece la posibilidad de efectuar la separacin del PEG, la prote o na nativa y las especies PEGiladas en un solo paso. Debido a esto, IEC es comnmente utilizada u para separar prote nas PEGiladas; sin embargo, el mtodo requiere ser optimizado. Para ello, debe e tomarse en cuenta que el PEG es un pol mero neutral pero puede afectar la carga de las prote nas

en tres maneras diferentes. Primero, la presencia del PEG conjugado puede proteger la carga supercial de la prote y de este modo debilitar na el enlace con la resina de intercambio inico. Seo gundo, la conjugacin a residuos de aminocidos o a que altera la carga neta de la prote o cambia na a ciertos valores de pH altera la carga potencial y por lo tanto el punto isoelctrico (pI). Tercero, e la supercie de la prote en donde se localiza el na PEG puede formar puentes de hidrgeno (Fee y o Van Alstine, 2006). La cromatograf de intercambio catinico es a o especialmente ventajosa y parece ser el mtoe do ms no para separar mezclas de PEGilados a (Kinstler y col., 2002; Fee y Van Alstine, 2006; Garberc-Porekar y col., 2008). En la PEGilacin o aleatoria (bsicamente grupos amino), el orden a usual es que eluyan primero las especies altamente PEGiladas, despus las di-PEGiladas seguidas de e las mono-PEGiladas, la prote na no PEGilada eluye al nal; sin embargo, el mismo orden de elucin se puede obtener cuando se requiere separar o prote nas PEGiladas sobre un residuo de ciste na 21

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Absorbancia 280nm(mAU)

30 25 20 15 10 5 0 5 0 50

mono-PEG

di-PEG

RNasa A nativa

100

150

200

250

Tiempo(min)
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Fig. 5: Separacin de Ribonucleasa A nativa de o sus formas mono- y di-PEGiladas utilizando CroFigura 5 matograf de Exclusin Molecular (tomado de a o Cisneros-Ruiz, 2006). (Seely y col., 2005). Aunque la cromatograf de a intercambio catinico es altamente efectiva para o resolver mezclas complejas de prote nas PEGiladas, cargar demasiado la columna puede disminuir la resolucin. La mayor de los espacios o a de la columna estn ocupados por el PEG resula tando en una baja capacidad del medio en trmie nos de masa de prote por volumen de resina. El na tiempo de vida util del medio cromatogrco us a ado es relativamente corto, por lo que se requiere 27 empacar la columna en repetidas ocasiones. Todos estos factores contribuyen a generar altos costos de separacin, a pesar de el uso de resinas de intero cambio inico relativamente econmicas (Garberco o Porekar y col., 2008). La cromatograf de fase reversa (Reverse a Phase Chromatography, RPC) es una opcin o atractiva para la resolucin de conjugados o prote na-pol mero debido a que la cadena del PEG sobresale del conjugado actuando como un sitio hidrofbico y de esa manera dominar la interaco cin con la supercie hidrofbica (Daly y col., o o 2005; Cisneros-Ruiz, 2006). Sin embargo, RPC puede estar limitada por diferentes factores, incluyendo cambios estructurales en los productos prote de inters, adems de bajos niveles de recos e a cuperacin debido a la desnaturalizacin causada o o por el uso de solventes orgnicos (Cisneros-Ruiz, a 2006). La cromatograf de interaccin hidrofbica a o o (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) ha sido aplicada con menos frecuencia para la separacin de prote o nas PEGiladas. Esta tcnica e generalmente trabaja pobremente debido a que el PEG por s mismo tambin se liga al medio, lo e que interviene en la separacin (Fee y Van Alstine, o 2006; Garberc-Porekar y col., 2008). Cisneros-Ruiz y colaboradores (2009) reportaron que bajo ciertas condiciones es posible separar ribonucleasa A nativa de sus especies PEGiladas; sin embargo, no 22

es posible separar las prote mono-PEGilada de na la di-PEGilada. Algunos autores consideran que esta tcnica no ha sido debidamente explotada, e por lo que es necesario realizar ms investigacin a o al respecto (Fee y Van Alstine, 2006). En trminos generales, las tcnicas croe e matogrcas clsicas para la separacin de a a o prote nas, no ofrecen de manera individual un desempeo ptimo para la puricacin de conjun o o gados prote na-pol mero. En muchas ocasiones es necesario utilizar un conjunto de las tcnicas antes e mencionadas, algunos autores han sugerido que la cromatograf de exclusin molecular seguida por a o intercambio inico e interaccin hidrofbica poo o o dr ser la mejor propuesta de una aplicacin an o genrica para la puricacin de prote e o nas PEGiladas (Fee y Van Alstine, 2006; Garberc-Porekar y col., 2008).

3.2.

Mtodos no cromatogrcos e a

El incremento en tamao de los conjugados n prote na-PEG ha sido explotado para llevar a cabo su separacin haciendo uso de membranas de ulo traltracin. Con mayor frecuencia, dicha tcnio e ca ha sido empleada para remover el agua y la solucin buer del resto de los componentes de la o reaccin de PEGilacin; sin embargo, tambin es o o e posible separar la prote nativa de las molcuna e las PEGiladas as como retirar el PEG remanente (Lee y Park, 2002; Pabst y col., 2007; Molek y Zydney, 2007), adems ha sido examinado su uso a potencial para la separacin de los conjugados o de manera cuantitativa. El diseo y optimizacin n o para la aplicacin de la ultraltracin en la reo o cuperacin de prote o nas PEGiladas requiere de la adecuada seleccin del tamao de poro de la memo n brana, el pH, fuerza inica y el ujo del ltrado o (Molek y Zydney, 2007). Sistemas de dos fases acuosas (SDFA) tambin e han sido utilizados para la separacin de prote o nas PEGiladas; sin embargo, reportes que documenten la caracterizacin de prote o nas PEGiladas en estos sistemas no son muy comunes. SDFA es un mtoe do de separacin l o quido-l quido en donde la separacin est basada en la diferencia de particin de o a o los solutos entre las fases (Rito-Palomares, 2004), que se visualiza como una alternativa atractiva para la recuperacin de prote o nas PEGiladas. En este contexto, estudios previos mostraron que los conjugados PEG-prote de las prote na nas albmiu na, factor de estimulacin de colonias de granuloco itos y macrofgos e inmunoglobulina G, se coma portan diferente que sus equivalentes prote nas nativas en sistemas que utilizan PEG y dextrano

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K. P. Mayolo y M. Rito/ Revista Mexicana de Ingenier Qu a mica Vol. 9, No. 1 (2010) 17-27 como formadores de fases. Los resultados muestran que el coeciente de particin (K) incremeno ta con el nmero de molculas de PEG ligadas a u e la prote (Delgado y col., 1994; Delgado y col., na 1997). Si bien estos estudios demostraron el potencial de utilizar SDFA para la recuperacin de o conjugados prote na-PEG, la falta de una caracterizacin extensa del comportamiento de partio cin es evidente. Alternativamente, Sookkumnerd o y Hsu (2000) explotaron la distribucin a contrao corriente en sistemas de dos fases acuosas (PEGfosfatos) como tcnica para puricar conjugados e PEG-lisozima. Los resultados de esta investigacin o mostraron que a travs de esta tcnica es posible e e separar cada una de las especies PEGiladas y la prote nativa. A pesar de los estudios realizana dos, una extensa caracterizacin de los conjugao dos prote na-pol mero utilizando estrategias que explotan los mecanismos de particin en dos fases o acuosas es necesaria. Como se ha podido apreciar, se han realizado diversos esfuerzos por mejorar los procesos de puricacin de prote o nas PEGiladas, la mayor de a ellos utilizando mtodos cromatogrcos. Sin eme a bargo, los procesos siguen llevndose a cabo en a varias etapas, lo que prolonga el tiempo de recuperacin de los bio-conjugados e impacta negatio vamente en el rendimiento del proceso de PEGilacin. Es en este punto donde herramientas de o ingenier qu a mica y bioqu mica puede ser de gran impacto en el desarrollo de mtodos de sepae racin ms rpidos y efectivos. Lo ideal ser el o a a a diseo de procesos con dos etapas, una de recun peracin primaria (utilizando mtodos como ulo e traltracin, dilisis o sistemas de dos fases acuo a osas) en donde se separen el PEG y la prote na que no reaccionaron y una segunda etapa (cromatogrca) que permita la separacin de los a o diferentes bio-conjugados (mono-PEGilados, diPEGilados, etc.). Aunque los procesos cromatogrcos son los a ms utilizados en la separacin de bio-conjugados, a o hasta ahora no se conocen modelos matemticos a que ayuden a predecir el comportamiento de las prote nas PEGiladas en el proceso de puricacin, o lo cual ser de gran ayuda en la optimizacin e a o intensicacin de los mtodos de separacin. o e o lacin. La Tabla 2 compila los ejemplos ms o a importantes de bio-conjugados aprobados por la FDA, que explotando las ventajas de la PEGilacin, han sido utilizados en la terapia de dio versas enfermedades (Veronese y Pasut, 2005; Fishburn, 2008). PEG-amadasa bovina (PEGadenosin deaminasa, Adagen R , Enzon Inc.) fue la primera prote PEGilada en ser comercializana da satisfactoriamente. Fue aprobada por la FDA en 1990 para tratar la enfermedad de inmunodeciencia combinada severa (Severe Combined Immunodeciency, SCID). Adenosin desaminasa fue PEGilada aleatoriamente con PEG 5 kDa para extender el tiempo que permanece en el plasma y reducir su inmunogenicidad. Este fue un paso predominante en el desarrollo de la PEGilacin o porque se demostr por primera vez la viabilidad o de esta tecnolog (Veronese y Mero, 2008). a La segunda prote biolgicamente activa en na o ser conjugada con PEG fue L-asparaginasa (PEGaspargasa; Oncaspar R , Enzon Inc.). PEGaspargasa fue aprobada por la FDA en 1994 para pacientes en los cuales la prote no modicada (o na nativa) provocaba una reaccin alrgica. La cono e jugacin de la prote con mltiples cadenas de o na u PEG 5 kDa increment el tiempo de eliminacin o o tres veces ms comparado con la prote natia na va. El producto PEGilado fue tan efectivo como la droga nativa en el tratamiento de pacientes con leucemia linfoblstica aguda, adems mostr un a a o bajo grado de inmunogenicidad (Graham, 2003). El factor de crecimiento de colonias de granulocitos (Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF) es el mayor regulador de la granulopoyesis in vivo. Su tiempo de vida media es relativamente corto (3.5-3.8 h) por lo que a diario se requieren de mltiples dosis. El conjugado PEGu G-CSF, peglgrastim (Neulasta R , Amgen Inc.), fue producido por la unin de una molcula de o e PEG 20 kDa a el grupo -amino del residuo Nterminal de metionina. Peglgrastim permanece en el plasma el tiempo suciente para permitir una simple inyeccin subcutnea para tratamientos de o a quimioterapia (Kinstler y col., 2002; Veronese y Mero, 2008). Los interferones combinados con ribavirina son los tratamientos ms usados para tratar infeca ciones virales, en su forma nativa, tienen un tiempo de vida muy corto (4-5 h). PEG-interfern o 2a (Pega-sys R , Homan La Roche Inc.) fue obtenido por el acoplamiento covalente de PEGN-hidroxisuccimida 40 kDa a un residuo de lisina. Dicha reaccin produce una mezcla de cuatro o ismeros mono-PEGilados en Lys31 , Lys21 , Lys131 o y Lys134 . Recientemente, los ismeros de PEG-ino 23

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Aplicaciones, tendencias y retos futuros

Diferentes clases de drogas proteicas, como enzimas, citoquinas y anticuerpos han sido signicativamente mejoradas debido al proceso de PEGi-

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K. P. Mayolo y M. Rito/ Revista Mexicana de Ingenier Qu a mica Vol. 9, No. 1 (2010) 17-27 Tabla 2. Conjugados prote na-pol mero aprobados por la FDA. Nombre comercial Andagen R Oncaspar R PEG-Intron R Pegasys R Neulasta R Somavert R Mircera R Cimzia R Conjugado PEG - prote na PEG-adenosin deaminasa PEG-asparaginasa PEG-interferon 2b PEG-interferon 2a PEG-G-CSF PEG-GH (antagonista) PEG-eritropoyetina PEG-TNF PM PEG (kDa) 5 5 12 40 20 4-5 x 5 40 40 Indicacin o SCID Leucemia Hepatitis C Hepatitis C Neutropenia Acromegalia Anemia Artritis reumatoide y enfermedad de Crohn Ao de n aprobacin o 1990 1994 2001 2002 2002 2003 2007 2008

FDA, Food and Drug Administration (USA); PM, peso molecular; SCID, enfermedad de inmunodeciencia combinada severa; G-CSF, factor de estimulacin de colonias de granulocitos; GH, hormona del crecimiento. (Hamidi o y col., 2006; Fishburn, 2008; Veronese y Mero, 2008).

terfern 2a fueron separados cromatogrcao a mente y su actividad fue evaluada; los ismeros o Lys31 y Lys134 , fueron los ms activos. Lo que a demuestra que es posible disear nuevos PEGn interferones que retengan mayor actividad biolgio ca que la prote nativa, adems de que se evina a dencia que an hace falta investigacin sobre esu o trategias de puricacin ms ecientes (Veronese o a y Mero, 2008). Las ventajas de la PEGilacin no estn limo a itadas a su aplicacin en prote o nas teraputicas, e tambin han sido utilizadas para mejorar la estae bilidad en solventes orgnicos y la eciencia catal a tica de prote nas como la lacasa, utilizada en procesos de biorremediacin debido a su capacidad de o oxidar un amplio rango de compuestos fenlicos o y poliaromticos (Vandertol-Vanier y col., 2002; a Lpez-Cruz y col., 2006). Otra prote utilizada o na tambin como biocatalizador en reacciones de oxe idacin de compuestos de estructura qu o mica diversa y que representan un problema de contaminacin ambiental, es el citocromo C. El citocroo mo C ha sido modicado qu micamente mediante PEGilacin, lo que ha permitido aumentar o su estabilidad trmica a temperaturas mayores a e 100 C (Garc a-Arellano y col., 2002). La PEGilacin tambin podr ser utilizada para mejorar la o e a estabilidad de prote nas de anidad (v.gr. prote na A) utilizadas en lechos cromatogrcos para la a separacin de anticuerpos. o Adems de prote a nas y pptidos, otras molcue e las como: cofactores, oligonucletidos, l o pidos sacridos y bio-materiales estn siendo PEGilaa a dos, lo que representa un rea de oportunidad para a el desarrollo de diversas investigaciones en el rea. a Hasta ahora, el desarrollo de la PEGilacin de o 24

prote nas ha estado enfocado en su aplicacin tero aputica, que sin duda ha sido de gran impacto e para el desarrollo de nuevas drogas. Sin embargo, esta tcnica puede mejorar la estabilidad de e prcticamente cualquier prote de ah la necesia na, dad de profundizar la investigacin en este campo o pues an existen diversos retos por superar. u En cuanto a la produccin (reaccin) de bioo o conjugados, es necesario disear reacciones de n PEG-ilacin sitio-espec o cas que eviten la formacin de PEGmeros sin daar el sitio catal o a n tico; adems de conocer a detalle las caracter a sticas intramoleculares de las especies PEGiladas que ayuden a entender su comportamiento bajo diferentes condiciones. La optimizacin de la reaccin de o o PEGilacin es crucial, puesto que el exceso tanto o del PEG como de la prote que no reaccionan na aumenta la viscosidad de la solucin, lo que como plica el proceso de puricacin. Ser ideal contar o a con procesos compuestos por una etapa de recuperacin primaria (v.gr. ultraltracin, fases acuo o osas, etc.) y una de puricacin (utilizando mtoo e dos cromatogrcos). Otra alternativa es llevar a a cabo la reaccin de PEGilacin y la separacin o o o en un solo paso utilizando cromatograf de exa clusin molecular, esta es una tcnica que ha sido o e muy poco explorada por lo cual tiene que ser anada, pero ofrece la posibilidad de realizar tanto el proceso de produccin como el de puricacin o o a travs de una misma etapa con la ayuda de sise temas cromatogrcos. a

Conclusiones
La PEGilacin es una tcnica verstil que pero e a mite superar muchas de las limitaciones farma-

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K. P. Mayolo y M. Rito/ Revista Mexicana de Ingenier Qu a mica Vol. 9, No. 1 (2010) 17-27 colgicas de las prote o nas teraputicas. Durante e el desarrollo de esta tcnica han surgido impore tantes avances en cuanto a la reaccin de PEGio lacin, la generacin de ms bio-conjugados, el eno o a tendimiento de su comportamiento y las estrategias para su puricacin. Sin embargo, an se preo u sentan nuevos retos en materia de ingenier tana, to en la preparacin como en la puricacin de o o las molculas PEGiladas. Los mtodos clsicos de e e a separacin han sido utiles pero no ofrecen una reso olucin ptima; siguen siendo procesos en varias o o etapas, de alto costo y con rendimientos bajos, adems de que en casos muy espec a cos no ha sido posible separar los ismeros conformacionales. o De manera que es necesario profundizar en la investigacin de mtodos no convencionales de sepao e racin que puedan ser aplicados en la puricacin o o de prote nas PEGiladas. Los productos aprobados por la FDA son una clara demostracin del xito o e de la PEGilacin tanto en el mejoramiento de las o propiedades de las prote nas teraputicas como de e su aplicacin en el tratamiento de diversas enfero medades; sin embargo, an hace falta profundizar u sobre la aplicacin de prote o nas PEGiladas en diversas reas de la biotecnolog a a. vo evaluation of an oral insulin-PEG delivery system. European Journal of Pharmaceutical Sciences 22, 315-323. Cisneros-Ruiz, M. (2006). Chromatographic separation of conjugates polymer-protein. PhD Thesis. Tecnolgico de Monterrey. Montero rey, N.L. Mxico. e Cisneros-Ruiz, M., Mayolo-Deloisa, K., Przybycien, T.M. y Rito-Palomares, M. (2009). Separation of PEGylated from unmodied ribonuclease A using sepharose media. Separation and Purication Technology 65, 105109. Daly, S., Przybycien, T.M. y Tilton, R.D. (2005). Adsorption of poly(ethylene glycol)modied ribonuclease A to a poly(lactide-coglycolide) surface. Biotechnology and Bioengineering 90, 856-868. Delgado, C., Malik, F., Selisko, B., Fisher, D. y Francis, G.E. (1994). Quantitative analysis of polyethylene glycol (PEG) in PEG-modied proteins/cytokines by aqueous two-phase systems. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 29, 237-250. Delgado, C., Malmsten, M. y Van Alstine, J.M. (1997). Analytical partitioning of poly(ethyl-ene glycol)-modied proteins. Journal of Chromatography B 692, 263-272. Dou, H., Zhang, M., Zhang, Y. y Yin, C. (2007). Synthesis and purication of monoPEGylated insulin. Chemical Biology & Drug Design 69, 132-138. Fee, C.J. y Van Alstine, J.M. (2004). Prediction of the viscosity radius and the size exclusion chromatography behavior of PEGylated proteins. Bioconjugate Chemistry 15, 13041313. Fee, C.J. y Van Alstine, J.M. (2006). PEGproteins: reaction engineering and separation issues. Chemical Engineering Science 61, 924-939. Fishburn, C.S. (2008). The pharmacology of PEGylation: balancing PD with PK to generate novel therapeutics. Journal of Pharmaceutical Science 97, 4167-4183. Gaberc-Porekar, V., Zore, I., Podobnik, B. y Menart, V. (2008). Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins. Current Opinion in Drug Discovery & Development 11, 242-250. 25

Agradecimientos
Los autores agradecen el soporte nanciero del CONACyT (Proyecto 53654) y del Tecnolgico de o Monterrey a travs de la Ctedra de Bioingenier e a a y Nano-biopart culas ( CAT-161).

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