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Rhizobium Aislamiento e identificacin del genero Rhizobium

Resumen

Son bacterias que viven en el suelo ,pero dada su movilidad, se aproximan a las leguminosas apropiadas para infectarla y causar la formacin de ndulos y participar en la adquisicin simbitica del nitrgeno .presenta una variedad de formas durante su ciclo vital ; bastones mviles, formas cocoides,formas elipsoidales muy pequeos y altamente mviles ,bacteroides ,formas irregulares en X y Y .en cultivo puro ,se observa como bacilos desprovistos de espora Gram negativos ,con tamaos que varan de 0.5-0.9um de ancho y de 1.2 -3.0 um de largo , a veces capsulados y mviles ,comnmente poseen grnulos poli-B hidrooxibutirato.moviles por un flagelo polar o subpolar o 2 a 6 flagelos peritricos . Es difcil el cultivo de las bacterias en medios ordinarios, pero el desarrollo en agar manitol es rpido, con tendencia a la diseminacin, las colonias son circulares, convexas, brillantes, semitranslucidas y mucilaginosas usualmente de 2 a 4mm de dimetro alrededor de 3- 5 das. Son bacterias aerobias estrictas, poseen un metabolismo respiratorio con oxigeno como aceptor final de electrones, su temperatura optima 25 a 30C utilizan la glucosa y en algunos casos otros azucares, produciendo acidez con ausencia de gas .juegan un papel en la agricultura, porque enriquecen los suelos con el N2 que fija, haciendo posible que siga funcionando el ciclo del nitrgeno.

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO INTRODUCCION El frijol comn (Phaseolus vulgaris L.) es una fuente importante de protena y caloras para el consumo humano en pases tropicales y subtropicales de Amrica Latina (Debouck e Hidalgo, 1985). En Costa Rica es cultivado principalmente por pequeos agricultores en suelos de baja fertilidad y con contenidos subptimos de nitrgeno y fsforo. La reducida fertilidad del suelo as como el alto costo o la escasez de fertilizantes contribuyen a los bajos rendimientos observados (Rosas, 1983; Rosas y Bliss, 1986). Una alternativa para mejorar los rendimientos en este cultivo, es la utilizacin de inoculantes con rizobios para incrementar la fijacin biolgica de nitrgeno. El frijol hasta hace poco era conocido como una de las leguminosas pobres en el establecimiento de una simbiosis efectiva y en su capacidad de fijacin de N2 atmosfrico, debido principalmente a la presencia de cepas nativas con poca eficiencia y altamente competitivas en el proceso de infeccin; sin embargo, hoy da se ha determinado que existe potencial para el incremento de la fijacin de nitrgeno en este cultivo mediante una adecuada combinacin entre cepas y Cultivares (Graham, 1981; Rosas, 1983; Han, 1981; Piha y Mumns 1987; Zamora y Acua, 1991). Estos ltimos autores sugieren inoculaciones con cepas seleccionadas que sean efectivas y competitivas. Las bacterias pertenecientes al gnero Rhizobium son capaces de fijar N2 en simbiosis con leguminosas, debido a una compleja interaccin entre la planta, los rizobios y el ambiente. Para su utilizacin se debe contar con cepas que presenten competencia saproftica con otros microorganismos del suelo, competencia con otras cepas de Rhizobium por puntos de infeccin sobre las races y alta eficiencia en fijacin de N2 (Silvester et al., 1987; Zamora y Acua, 1991). Una cepa es efectiva (habilidad para fijar N2) cuando sta presenta infectividad (habilidad para infectar las races de las plantas), persiste y crece en el suelo, tolera las condiciones locales, compite por sitios de infeccin con otros organismos de la rizosfera y, manifiesta estabilidad gentica (Silvester et al., 1987). Han demostrado que, entre un 25 y un 75% del N requerido por la planta de frijol, proviene de la fijacin simbitica. Las cantidades de N2 fijado suministran entre 25 - 125 kg N2/ha, dependiendo del cultivar. Determinaron que no hubo un aumento significativo en la produccin de frijol, cuando ste fue inoculado con rhizobios introducidos de otros pases. Uribe et al. (1987, 1990), Rosas (1986), Piha y Munns (1987).

En las zonas de Monterrey de San Carlos y San Pedro de Prez Zeledn, Costa Rica, donde no se obtuvo respuesta significativa a la inoculacin, el comportamiento de los tratamientos testigos fue aceptable. Estos resultados que
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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO podran indicar la presencia de cepas nativas efectivas. En general el efecto observado, con la inoculacin de cepas introducidas puede atribuirse a tres razones principales: i) ii) iii) las condiciones ambientales y edficas en nuestro medio difieren de las que imperan en el lugar donde las cepas fueron aisladas; la diferente capacidad de nodulacin y fijacin entre cepas (Grahan, 1981; Morales, 1987); las poblaciones nativas de Rhizobium que compiten por puntos de infeccin con las cepas introducidas. Debido a lo expuesto anteriormente, se deduce que es necesario contar con cepas efectivas y competitivas en la fijacin biolgica de N2 (FBN), seleccionadas de una amplia variedad de aislamientos obtenidos de diferentes lugares; para la elaboracin de inoculantes que puedan ser utilizados por los agricultores en plantaciones comerciales de frijol.

Como criterio de seleccin se pueden utilizar varios parmetros: i) ii) peso seco de la parte area de las plantas en la etapa de floracin (R6) (Debouck e Hidalgo, 1985); incremento en la masa, peso seco, distribucin, color y nmero de ndulos por planta, en la misma etapa (Somasegaran et al., 1981).

La evaluacin exacta de la actividad de los ndulos en la fijacin biolgica, por medio de la enzima nitrogenasa, puede lograrse a travs de varios mtodos: a) reduccin del acetileno, donde se determina la produccin de etileno e indirectamente la actividad en la fijacin; b) determinacin de la acumulacin total de N2 en la parte area por el mtodo de microkjeldhal, y c) determinacin de uredos (Somasegaran et al., 1981; Silvester et al., 1987; Castro, 1992).

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO El NITROGENO Se trata de un elemento que, cuantitativamente, y tras el carbono, oxgeno e hidrgeno, es ms abundante en la materia viva, de la que constituye un 8-16 por ciento. Cualitativamente, forma parte de molculas tan importantes para la actividad biolgica como son los cidos nucleicos, donde se asienta la informacin gentica, o las protenas y enzimas, componentes estructurales fundamentales en la organizacin de la materia viva y catalizadoras de los procesos biolgicos respectivamente. Como constituyente de las protenas, lo est en una proteccin del 0-15 por ciento. En los pases desarrollados se cuenta con una dieta de protenas mucho ms elevada que en los inmersos en el subdesarrollo. Un suministro inadecuado de protenas prolongado durante aos, conduce al estado de malnutricin es el del nio alimentado con azcares, almidn y otros hidratos de carbono, pero sin protena, el llamado sugar baby (lit. nio azcar). Aun cuando toda conclusin cientfica sobre un proceso ha de ir acompaada de estudios estadsticos que la confirmen, quizs sea, en el caso del nitrgeno, simplemente necesario observar la relacin causa-efecto, en cualquier organismo vivo, para deducir su inexcusable participacin en los procesos metablicos fundamentales del individuo.

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FIG. 1. Distribucin de nitrgeno (N) en la Tierra, expresada en millones de Tm. A: corteza; B: biosfera; C: atmosfrico; D: combinado; E: orgnico; F: inorgnico; G: orgnico terrestre; H: o. acutico; I: en materia orgnica muerta; J: en biomasa; K: en plantas; L: en microbios; M: en animales. Rosswall, T. (1979). Manifestando lo anterior, conviene hacer un inventario de nitrgeno de nuestro planeta, con el fin de sealar la potencialidad de los recursos nitrogenados puestos a disposicin de la biosfera para el cumplimiento de las actividades biolgicas. La Tierra es muy rica en nitrgeno, con ms de 60.000 billones de toneladas, de los que el 94 por ciento se encuentran en la corteza terrestre. Del 6 por ciento restante, el 99,86 por ciento se halla en la atmsfera como nitrgeno molecular (N2), y el 0,04 por ciento aparece en los organismos vivos, suelos y aguas, en forma de compuestos orgnicos e inorgnicos (fig.1). El aire que respiramos contiene un 79 por ciento en volumen de nitrgeno, lo cual significa que sobre cada hectrea de terreno, teniendo en cuenta el espesor de la capa atmosfrica, existen 75.000 Tm. De este elemento. No obstante, ese nitrgeno que se encuentra en estado molecular (N2), y que entra en nuestros pulmones, y sale tal cual, reflejando un acusado carcter inerte, no es utilizable por los organismos vivos, excepto por los pocos que pueden convertirlo en compuestos aprovechables. De hecho, las plantas, los animales y casi todos los microbios, slo pueden utilizar nitrgeno combinado, es decir, nitrgeno integrado en un compuesto qumico. En efecto, las plantas y la mayora de los microbios son dependientes de formas inorgnicas de aquel elemento, como nitratos (NO- 3), amonio (NH+ 4), etc., mientras que los animales requieren nitrgeno orgnico obtenido directa o indirectamente de las plantas. El nitrgeno combinado se encuentra en muchos suelos en concentraciones muy bajas y constituye, despus del agua, el principal factor limitante del desarrollo de los vegetales, no obstante vivir inmersos en una atmsfera cuyas 4/5 partes son nitrgeno. El nitrgeno, al igual que todos los elementos biolgicamente importantes, pasa por cambios cclicos, de modo que puede ser utilizado y a la vez repuesto dentro de lo que se conoce como ciclo biogeoqumico del nitrgeno, por medio del cual un tomo de nitrgeno pasa del estado orgnico al inorgnico y viceversa, en una secuencia de procesos que implican actividades de organismos vivos y conversiones no biolgicas.

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FIJACIN BIOLGICA DE NITROGENO Aunque es un fenmeno muy extendido, la fijacin biolgica aparece nicamente en bacterias, algas cianofceas (algas azul-verdosas) y actinomicetos, microorganismos que aparte de ser procariticos (sin membrana nuclear) y tener la capacidad de utilizar el nitrgeno atmosfrico, poco tienen en comn. En efecto, entre los ms de 60 gneros conocidos se encuentran formas aerobias, facultativas, anaerobias, auttrofas y hetertrofas, con hbitats muy dispares, tanto terrestres como acuticos, y con requerimientos ambientales de temperatura, aireacin, humedad, pH, etc., muy heterogneos. La Tabla 2 contiene algunos de los gneros con incidencia en la produccin agrcola. De cualquier modo, es interesante sealar algunos problemas conceptuales, por ejemplo, cmo hacen los microbios para reducir el nitrgeno a amonaco cuando la industria necesita para la misma operacin un gran aporte de energa y elevadas presiones y temperaturas?, o por qu solamente los procariotas pueden puedan fijar nitrgeno? Las respuestas a estas preguntas no son sencillas y ocupan a muchos grupos investigadores, si bien parecen estar relacionadas con las caractersticas y composicin de la atmsfera de nuestro planeta en tiempos remotos, y en los que ya existan estas formas vivas. De la cantidad de nitrgeno fijada anualmente (175 millones de Tm.) por va biolgica, 140 millones de Tm. se fijan en los ecosistemas terrestres, y 35 millones en los marinos. Los primeros se distribuyen en 45 millones de Tm. para tierras de cultivo, 45 en prados y pastos permanentes, y 50 en reas forestales y otras.

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO ASOCIACIONES FIJADORAS DE NITRGENO Las asociaciones entre microbio fijador y planta admiten varios grados de interdependencia de ambos simbiontes. En el nivel inferior, con un menor grado de relacin, se encuentran las rizocenosis detectadas por J. Dobereiner en Brasil. Las simbiosis con Rhizobium y Frankia, respectivamente, se establecen como resultado de la expresin de unas caractersticas propias del microbio, de la planta hospedadora, y de la asociacin de ambos, Entre las propiedades de las simbiosis cabe destacar:

Simbiosis Rhizobium-leguminosa
El establecimiento de la simbiosis para atrapar el N2 entre Rhizobium y el N2 leguminosa es un proceso complejo, donde la formacin de ndulos la captacin del N 2 se da en etapas sucesivas. Rhizobium induce en la leguminosa el desarrollo de ndulos en su raz, los dos organismos establecen una cooperacin metablica, las bacterias reducen N2 a amonio (NH4), el cual exportan al tejido vegetal para su asimilacin en protenas y otros compuestos nitrogenados complejos, las hojas reducen el C02 en azcares durante la fotosntesis y lo transportan a la raz donde los bacteroides de Rhizobium lo usan como fuente de energa para proveer ATP al proceso de inmovilizar N2. La asociacin se inicia con el proceso de infeccin, cuando las bacterias son estimuladas por los exudados radicales y proliferan lo que induce un alargamiento y curveado de los pelos radicales y posterior formacin de una estructura tubular
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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO llamada cordn de infeccin (Long, 1989). Este se desarrolla en el interior del punto de adhesin a la bacteria y forma un canal en en interior del pelo. Rhizobium es conducido a travs del cordn hasta la base del pelo (Burity et al., 1989). El cordn de infeccin atraviesa la pared de la clula cortical adyacente, ah al perder la pared celular, se establece Rhizobium; despus se engloba por la membrana plasmtica del hospedero, lo que resulta en la formacin del ndulo. Las bacterias y las clulas de la corteza radical se diferencian y comienza la fijacin simbitica del N2 y el intercambio metablico fijado el N2, se transporta rpidamente del ndulo al resto de la planta. La reduccin de N2 molecular a amonio, se lleva a cabo por la nitrogenas, que requiere ATP y de la leghemoglobina, una protena globular cuya funcin es atrapar el oxgeno para facilitar el trabajo de la nitrogenasa, adems de transferir 02 y estimular la oxidacin de la reserva del carbono, cubrir el alto gasto de energa que Rhizobium requiere para incorporar el N2. La leghemoglobina es codificada por un gen de la leguminosa, esta protena se localiza en el ndulo fuera de la bacteria y es distinta para cada tipo de Rhizobium como se ilustra en la figura 1.

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO PROTECCIN FRENTE AL OXGENO Los dos componentes de la nitrogenasa son inactivados por el oxgeno del aire, y adems su sntesis es reprimida. Para protegerse del oxgeno, los sistemas fijadores de nitrgeno han desarrollado, a lo largo de su evolucin, una serie de estratagemas fisiolgicas, para excluir total o parcialmente dicho gas de los lugares de fijacin, entre los cuales cabe citar: a) Una mayor actividad respiratoria en el caso de fijadores libres cuando la oxigenacin del entorno aumenta, con lo cual se consiguen niveles de oxgeno lo suficientemente bajos para que no sea nocivo. b) En cianofceas, aunque con excepciones, se desarrollan unas clulas especializadas, los heterocistos, en los cuales se localiza exclusivamente la nitrogenasa, y donde no hay liberacin de oxgeno, existiendo, pues, una separacin espacial entre fijacin de nitrgeno y fotosntesis.

c) Los ndulos radicales, donde el microbio encuentra las condiciones idneas para expresar su actividad fijadora y donde existe un pigmento semejante a la hemoglobina de la sangre, que regula el suministro de oxgeno al microbio para su respiracin, y a niveles que no afecten su actividad fijadora. Esta sustancia refleja la ntima asociacin entre los dos organismos simbiticos, puesto que el grupo hemo- es sintetizado por la bacteria, y la globina es de origen vegetal. El amonaco formado en la fijacin de nitrgeno es asimilado rpidamente a travs de una ruta metablica en la que intervienen dos enzimas, la glutamina- sintetasa (GS) y la glutamatosintasa (GOGAT), con el resultado final de la incorporacin de la incorporacin del nitrgeno a la molcula de glutamato, que servir de precursor para otros compuestos. La asimilacin de NH3 en la simbiosis es realizada `por la planta, a la cual llega desde el microsimbionte por difusin, ya que ste contiene cuantitativamente pocas enzimas asimiladoras. Una vez en la clula vegetal del ndulo, el NH3 pasa a formar parte de la glutamina y el glutamato, que son los primeros productos orgnicos en las asociaciones simbiticas. Alternativamente, los productos transportados hacia el xilema de las plantas pueden ser otros. En efecto, la glutamina puede salir como tal del ndulo, o bien sufrir transformaciones a asparraguina, o a ureidos como alantoina y cido alantoico. En las leguminosas de zonas templadas el nitrgeno se exporta a la planta en las amidas glutamina y asparraguina, mientras que en leguminosas tropicales se exporta en los ureidos alantoina y cido alantoico, que son ligeramente menos solubles que las amidas citadas, y por tanto de ms difcil transporte por el xilema de plantas adaptadas a temperaturas moderadas. Sin embargo, las leguminosas, en general, poseen el mecanismo necesario para producir ureidos, y el hecho de que se formen preferentemente en unas especies
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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO determinadas, las tropicales, parece venir determinado por la interaccin especfica entre planta y estirpe microbiana. Esta hiptesis puede proporcionar nuevas ideas sobre cmo aumentar la eficiencia gentica por ejemplo, por cuanto incide directamente en la asimilacin y metabolismo nitrogenado de la planta sometida a una nutricin diaztrofa. En efecto, el hecho de que sean ureidos o que sean amidas los productos exportados por el ndulo, la menor solubilidad de los primeros respecto de los segundos puede afectar notablemente el desarrollo de una misma planta, y en especial en situaciones de estrs hdrico y trmico, a los que sta se ve sometida con frecuencia en una climatologa adversa como es la nuestra. LIMITACIONES DE SU EMPLEO En general se hace la recomendacin de aumentar el cultivo de leguminosas con el fin de disponer de un adecuado suministro de alimentos. Sin embargo, existen diversos obstculos para seguir tales recomendaciones, el primero de los cuales es la costumbre, que hace que muchas sociedades que no tienen hbito de cultivar y de consumir leguminosas se resistan a adoptarlas como alimento bsico; de hecho, slo unas pocas leguminosas han tenido una aceptacin general a lo largo de los siglos, siendo adems un cultivo subsidiario de los cereales, que proporcionan el mayor aporte calrico y que por lo general han sido ms rentables, debido principalmente a los menores problemas de adaptacin de stos y a la gran cantidad de estudios realizados sobre los mismos, especialmente de tipo gentico. La consideracin de las leguminosas como alimento de pobres ha determinado en parte una preferencia por la carne o el pescado como suplemento proteico a la dieta de cereales. Aparte de tales prejuicios naturales, existen algunas limitaciones al empleo de las leguminosas como alimento humano, que podemos dividir en tres tipos. El primero de ellos lo constituye la presencia de algunas substancias txicas en ciertas leguminosas, como hemaglutininas, bocigenos, ciangenos o antagonistas de vitaminas. Adems, algunos trastornos se asocian con el consumo de legumbres tales como el neurolatirismo, parlisis debilitante y generalmente irreversible resultante del consumo de almortas (Lathyrus sativus) como dieta principal en tiempos de hambre; o el fabismo, anemia hemoltica causada por la ingestin de habas por individuos susceptibles. La segunda limitacin la constituye la digestibilidad, que hace que muchas leguminosas sean digeridas ms lentamente por le hombre que otros alimentos proteicos debido a la presencia de protenas intrnsecamente resistentes a la digestin y de factores antitripsnicos .
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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO El tercer tipo de limitacin es la composicin de aminocidos, puesto que la mayora tienden a contener poca cantidad de algunos aminocidos importantes, como los azufrados metionina y cistina. La solucin de estos problemas constituye una de las tareas prioritarias en la actualidad si se quiere potenciar el uso de las leguminosas como base de la dieta proteica en la alimentacin humana. No obstante existe alguna leguminosa, como la soja, que no solamente posee un contenido de protenas superior a la mayora, sino que tambin aporta una mejor composicin de amincidos y una mayor digestibilidad; pero la dificultad que presenta su cultivo y nodulacin en muchos ambientes ha impedido, hasta el momento, un uso extensivo de la misma, apareciendo interesante en zonas de regado del Sur y del Valle del Ebro. Alternativas a la soja, de la que se importan unos 2 millones de toneladas anuales en nuestro pas con la consiguiente prdida de divisas, apuntan al altramuz y al haba como cultivos interesantes, especialmente el primero, en base a su buena adaptacin a nuestros suelos y clima y al alto contenido de protena y grasa de su semilla. Para el agricultor, las leguminosas pueden originar un problema ms inmediato: el aumento de las producciones conduce a un incremento en el consumo de otros elementos esenciales, principalmente de potasio, fsforo, calcio y azufre, que hay que proporcionar al suelo si ste no los contiene en cantidades suficientes para obtener un beneficio mximo del cultivo. Otros elementos que inciden en una mayor actividad fijadora son el molibdeno, como parte constitutiva de la ditriogenasa, y el cobalto, como constituyente que es de la leghemoglobina de los ndulos, por lo que en ciertos suelos deber contemplarse la necesidad de su adiccin. La incorporacin de fertilizante nitrogenado al suelo ha de hacerse en cantidades moderadas, dado su efecto inhibidos sobre la nodulacin y fijacin de nitrgeno. INOCULACION CON RHIZOBIUM Si bien las leguminosas pueden estar bien noduladas y micorrizadas cuando crecen en condiciones naturales, las modificaciones introducidas por el hombre, como es el caso de monocultivos, aplicacin incontrolada de fertilizantes qumicos, tratamientos con pesticidas y herbicidas, etc., han causado una prdida en la infectividad de los suelos. Por ello, la inoculacin de leguminosas (Figs. 11) con microbios adecuados es de gran importancia para el desarrollo de aqullas. Un criterio de seleccin es que el rizobio forme ndulos en las races de la planta hospedadora bajo un amplio espectro de condiciones ambientales, muestre capacidad de competir con ventaja sobre otros rizobios no deseados, sobreviva y se multiplique en el suelo, tenga resistencia a pesticidas, desecacin, etc.

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO Ms recientemente, se han obtenido resultados muy satisfactorios cuando se inocula el suelo directamente y a continuacin se siembra la semilla.

Otra posibilidad para obtener simbiosis efectivas Rhizobium -leguminosa consiste en seleccionar las plantas a fin de reducir su especificidad simbitica, lo que les permitir asociarse con cepas nativas del suelo.

FIG. 15. Buen crecimiento de alfalfa nodulada en un suelo arenoso y cido, en primer trmino. Mal crecimiento en las dos parcelas de atrs no inoculadas.

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FIG. 13. Preparacin de inoculante bacteriano para semilla de leguminosas.

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO OBJETIVOS DE LA PRCTICA Aislar Rhizobium, a partir de ndulos de leguminosas, aplicando correctamente las tcnicas de esterilizacin y tratamiento de ndulos . Identificar Rhizobium por sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y de relacin simbitica. MATERIALES 1. Aislamiento - Muestra : ndulos de races de leguminosas - Solucin de o.1% de bicloruro de mercurio acidificado(HgCl2=1g; HCL= 5cc) - Agua estril - Etanol 95% - Asa bacteriolgica - Tubo con agar extracto de levadura manitol 2. Identificacin - Batera Gram - 1 placa con agar nutritivo - 1 tubo con caldo glucosa
PROCEDIMIENTO

1. Obtencin de ndulos - Escoger plantas de leguminosas de mayor desarrollo, de color verde intenso, que en lo posible sobresalgan del resto, extraerlas con cuidado, observando si los ndulos presentes tienen caractersticas de efectividades (grandes, rojizas). - En el laboratorio, escoger los mejores ndulos de las races y cortarlos de manera tal que quede adherida una parte de la raz, con el objetivo de facilitar su manipulacin. 2. Tratamiento de los ndulos - Los ndulos seleccionados, deben colocarse dentro de tubos con tapa de rosca, para ser lavados enrgicamente, primero con agua corriente y luego con agua destilada, con la finalidad de eliminar toda la tierra. - Los ndulos deben ser, luego, desinfectados en placas estriles. Sumergimos en alcohol de 95% por algunos segundos

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO Sumergimos en una solucin al 0.1% de bicloruro de mercurio acidificado durante 1-30 minutos, segn el tamao del ndulo y la intensidad de la esterilizacin que haga falta, por lo comn 3-4 minutos. Lavar con fuerza, no menos de seis veces, utilizando agua estril. 3. Aislamiento
El ndulo desinfectado, se aplasta o diseca aspticamente con una pinza desinfectada, y se extiende el jugo lechoso del interior sobre la superficie de una o dos placas de agar extracto de levadura manitol. Incubar la placa a 30C por tiempo variable, generalmente 3-5 das, dependiendo de la velocidad de crecimiento de las bacterias. Observar las colonias caractersticas, relativamente grandes y gomosas al cabo de 4-5 das, otras sern mucho ms pequeas aun despus de 10 das, aunque la mayora de colonias son acuosas, translucidas u pacas y blanquecinas, tambin se han registrado colonias rosadas. De la colonia caracterstica, hacer un frotis y teir por la tcnica de Gram, observar bacilos Gram negativos, delgados y tamaos diferentes.

4. Cultivo puro - De una colonia aislada y analizada, repicar a un tubo inclinado con agar extracto de levadura manitol, registrando nmero de cepa, husped y fecha de aislamiento, para su conservacin por uno o dos aos a baja temperatura o en ambiente. 5. Identificacin - Prueba de crecimiento en caldo nutritivo - Prueba de acidez de glucosa, arabinosa y galactosa - Prueba de catalasa - Prueba de crecimiento en 2% de NaCl - Prueba de resistencia trmica a temperatura 39-49C

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO BIBLIOGRAFIA ALLEN, 0. N. and ALLEN, E. K. (1981): The leguminosae. MacMillan Publishers Ltd. London. 812 pp. BOND, G. (1977): Some reflections on Ainus-type root nodules. In: Recent developments in Nitrogen-Fixation. Ed. W. E. Newton, J. R. Postgate and C. Rodrguez-Barrueco. Academic Press. London. 622 pp. DOMMERGUES, Y. R.; DREYFUS, B.; HOANG GIA DIEM y DULHOUX, E. (1985): Fijaci6n del nitrgeno y agricultura tropical. Mundo Cientfico, 5, 276-285. FRITSCH, P. y SAINT B LANQUAT, G. de (1985): La contaminacin por los nitratos. Mundo Cientfico, 5, 1.172-1.181. HAYNES, A. G.; HAYNES, E. and WHITE, G. (1979): Nitrogen-fxing plants in Southeastern United States Fores Forestry. In: Symbiotic nitrogen fixation in the management Of temperate forests. Oregon State University Press. Corvallis. Ed. J. C. Gordon et al.,429-443. POSTGATE, J. R. (1982): The fundamentals of nitrogen fixation. Cambridge University Press. London. 252 pp.

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