MARCADORES GENTICOS E MAPEAMENTO GENTICO

Andr Thaler Neto, Christine Maziero, Naych Tortato, Vagner M. Portes Introduo Para determinar a localizao dos genes, podemos nos auxiliar de estudos de ligao gnica inserindo marcas em determinadas posies dos cromossomos. Como marcas denominadas MARCADORES GENTICOS, sendo utilizados para isto loci que podem ser facilmente genotipados, isto , os alelos de cada indivduo podem ser determinados (Fig. 1).

Fig.1. Representao esquemtica de um gene flanqueado por dois marcadores moleculares. Os marcadores genticos podem ser empregados nas pesquisas de mapeamento gentico, visando a identificao de regies de cromossomos relacionados com caractersticas de importncia econmica, normalmente denominados Economic Trait Loci (ETL) ou Quantitative Trait Loci (QTL). Tambm so utilizados na identificao, rastreamento e determinao da paternidade de indivduos, tambm conhecido como DNA fingerprinting. A utilizao prtica dos marcadores genticos no melhoramento gentico animal est relacionado especialmente seleo assisitida por marcador e testes genticos para caractersticas ou malformaes genticas cujo gene causal j conhecido (van der Werf, 2000; Nicholas, 1999; Ferreira e Grattapaglia, 1996).

Professor do Centro de Cincias Agroveterinrias Universidade do Estado de Santa Catarina (CAV/UDESC) thaler@cav.udesc.br 2 Acadmico do curso de Medicina Veterinria - CAV/UDESC

As propriedades dos marcadores genticos so de fundamental importncia para a escolha do delineamento mais adequado para um determinado estudo de mapeamento gentico, assim como para possibilitar a obteno de melhores resultados nestes estudos. Dentre estas propriedade destaca-se o polimorfismo do marcador, o qual influenciado pelo nmero de alelos deste e pela frequncia de cada alelo na populao. Este polimorfismo vai indicar a probabilidade de um indivduo ser heterozigoto, sendo que somente indivduos heterozigotos para uma determinado locus fornecem informao para o estudo do mapeamento gentico (Thaler Neto et al. 2000; Thaler Neto e Thaller, 2002) PCR Polimerase Chain Reaction Conhecida como reao de polimerase em cadeia uma das ferramentas mais poderosas em gentica molecular. Desenvolvida em 1985 por Kaary Mullis e seus colaboradores. Atualmente muito usada em pesquisas, diagnstico e deteco de genes tanto favorveis quanto danosos em animais domsticos. O DNA em que a PCR realizada (DNA molde) pode ser genmico ou seja, extrado diretamente de clulas brancas do sangue ou de uma simples amostra de sangue, bao ou outro tecido ou um fragmento de DNA de qualquer origem. A PCR cria aproximadamente 1 milho de cpias de um curto fragmento de DNA, o suficiente para permitir que o mesmo seja clonado, sequenciado ou analisado. Um requisito bsico conhecer o segmento que se deseja amplificar, ou pelo menos a seqncia de cada uma de suas extremidades. Com base nesta seqncia so sintetizadas 2 pequenas cadeias de nucleotdeos, chamadas de oligonucleotdeos, cada uma com cerca de 20 bases de comprimento cujo papel de preparar a sntese dos novos filamentos de DNA (por isso, eles so chamados de primers ou indicadores) (Nicholas, 1999). Estes primers so sintetizados artificialmente de maneira que suas seqncias de nucleotdeos sejam complementares a seqncia especfica que flanqueiam a regio alvo (Ferreira e Grattapaglia, 1996). Um ciclo de PCR envolve 3 etapas que so: desnaturao, anelamento e extenso. O processo se d da sequinte maneira:

1. A fita dupla do DNA alvo desnaturada atravs da elevao da temperatura para 92 95 C; 2. Ento inicia-se a etapa de anelamento, onde a temperatura rapidamente reduzida para 35-60 C, temperatura esta que depende exclusivamente do tamnho e da seqncia do primer utilizado, permitindo assim a hiibridizao DNA-DNA de cada primer com as seqncias complementares que flanqueiam a regio alvo; 3. A seguir, a temperatura elevada a 72C para que a enzima DNA polimeraze realize a extenso a partir de cada terminal 3 dos primers. Esta extenso envolve a adio de nucleotdeos utilizando como molde a seqncia alvo, de maneira que uma cpia desta seqncia feita no processo. Este ciclo repetido por algumas dezenas de vezes. Uma vez que a quantidade de DNA da seqncia alvo dobra a cada ciclo, a amplificao segue uma progresso geomtrica de maneira que depois de apenas 20 ciclos, produzida mais de um milho de vezes a quantidade inicial de seqncia alvo. Esta escala de amplificao permite, portanto, iniciar com quantidades mnimas de DNA (na ordem de alguns microgramas ou nanogramas) e terminam a reao com grandes quantidade de DNA de uma seqncia especfica de interesse (Ferreira e Grattapaglia, 1996). Nos experimentos iniciais de PCR, utilizou-se enzima de DNA polimerase da. E. coli, cuja temperatura tima de polimerizao de 37 C. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo de amplificao, uma vez que sendo trmicamente lbil, era destruda toda vez que a temperatura era elevada para 95 C para promover a desnaturao. O passo decisivo para a expanso da tcnica do PCR ocorreu quando Daiki et al. (1998) citado por (Ferreira e Grattapaglia,1996) isolaram uma DNA polimerase (Taq polimerase) de uma bactria (Thermus aquaticus) que vive em fontes trmicas, polimeriza a 72 C, mantendo assim a atividade por algumas horas a 95 C. Isto possibilitou a completa automatizao do processo de PCR (Ferreira e Crattapaglia, 1996). MARCADORES MOLECULARES Os marcadores genticos recebem uma srie de classificaes. Quanto ao tipo de locus explorado, os marcadores so divididos em marcadores annimos (Tipo II): os quais marcam uma determinada posio em um cromossomo sem serem genes funcionais e marcadores tipo I, quando o prprio gene funcional serve como marcador (Thaler Neto, 2000)

Quanto ao material gentico analisado nos animais os marcadores dividem-se em bioqumicos e moleculares. Os principais marcadores bioqumicos so os grupos sangneos, alm de enzimas produzidas por determinados genes. Estes foram os 1os marcadores genticos utilizados, tendo como principal facilidade a determinao do gentipo dos animais baseados em anlises bioqumicas relativamente simples. Apesar do nmero de grupos sangneos encontrados nas principais espcies animais de interesse econmico serem bastante superiores ao do humano, como por exemplo 11 grupos sangneos do bovino, permitindo um vasto nmero de combinaes. Sua utilizao no mapeamento gentico limitada em funo dos mesmos serem aleatoriamente distribudos ao longo dos cromossomos geralmente com distncias gnicas muito grandes. Atualmente so ainda utilizados para o estudo de filogenticos, onde se determina a distncia entre espcies, raas ou populaes, ou seja, quanto mais alelos semelhantes entre as populaes menos tempo as mesmas foram separadas. Tambm continuam sendo utilizadas para a determinao da paternidade em animais (Hines, 1999) Entende-se como marcadores moleculares aqueles relacionados a sequncia de mucleotideos em um cromossomo. A evoluo marcante ocorrida na descoberta e utilizao de marcadores moleculares num passado recente deve-se primordialmente ao desenvolvimento da tcnica de PCR. Diversas tcnicas de biologia molecular esto hoje disponveis para a deteco de variabilidade gentica ao nvel de seqncia de DNA, ou seja, para a deteco de polimorfismo gentico. Estas tcnicas permitem a obteno de uma alta densidade de marcadores moleculares, cobrindo todo o genoma do organismo. A tecnologia de DNA recombinante e o desenvolvimento da amplificao de segmentos de DNA via PCR abriram o caminho para uma mudana no paradigma gentico bsico: da interferncia do gentipo a partir do fentipo. PRINCIPAIS MARCADORES MOLECULARES Existe uma srie de marcadores moleculares, entretanto 3 merecem destaqueno melhoramento gentico animal, os quais passam a ser descritos a seguir: A) Polimorfismo no Comprimento Fragmento de Restrio ou Restriction Lenght Polymorfim (RFPL)

Este marcador o resultado do polimorfismo nos fragmentos obtidos por corte de fita dupla de DNA, tal polimorfismo evidenciado pela fragmentao de DNA atravs da fragmentao atravs do uso de enzimas de restrio. Para que o polimorfismo seja detectado necessrio para que as seqncias de nucleotdeos na seqncia de DNA de dois ou mais indivduos comparados sejam disstintas (Ferreira e Grattapaglia, 1996) (Fig. 2). A fragmentao desta seqncia realizada por enzimas de restrio. Estas enzimas bacterianas so responsveis por proteger as mesmas de vrus, cortando o DNA viral em segmentos (Nicholas, 1999). Na maioria dos casos, estas enzimas cortam segmentos de DNA que tem certamente a mesma seqncia qualquer que seja a ordem que so lidas, conforme pode ser visualizado na tabela 1. Tabela 1- Algumas enzimas de restrio comuns.

A clivagem dos fragmentos de RFLP pelas enzimas de restrio (figura 3) vai determinar que quando um produto de PCR tratadas com enzima de restrio submetido a um gel de eletroforese vais originar bandas com diferentes posies no gel, em funo do tamanho dos diferentes fragmentos. Apesar da tcnica de RFLP no exigir equipamentos muito sofisticado, a utilizao destes marcadores vem diminuindo em funo da tcnica ser

bastante trabalhosa e do fato dos marcadores possurem normalmente somente dois alelos, o que determina baixo polimorfismo. Fig. 2. Representao esquemtica da clivagem na fita de DNA em marcadores RFLP

B) Microsatlites: Entende-se como o polimorfismo de nmero de cpias repetidas de um curto segmento de DNA (Thaler Neto, 2000).A densidade de marcadores corresponde a um intervalo mdio entre eles de 1-2 cM, ou 1-2 megabases (106 pares de bases ao nvel do DNA (Haley, 1999) Microssatlites promovem bons marcadores genticos porque cada um deles tem alelos muito diferentes, isto , podem haver diferentes comprimentos nas regies repetidas Fig. 3). Eles tem sido observados em diversos organismos, sendo que em mamferos, os elementos repetidos mais freqentemente so extenses de nucleotdeos CA e TG (Ferreira e Grattapaglia, 1996).

Fig. 3. Representao de um marcador molecular tipo microstatlite Os microsatlites so detectados atravs de PCR com prmers correspondentes a DNA de seqncia nica que flanqueia as repeties tandem. Igualmente, a eletroforese tem

que ser realizada em condies tais que permitam distinguir bandas que diferem em apenas uma base. Como as condies de eletroforese usadas para seqenciamento de DNA preenchem estes requisitos, os microsatlites produtos de PCR so analisados em gel de seqenciamento (Nicholas, 1999). O DNA de seqncia nica a que correspondem os prmers ocorrem apenas uma vez no genoma inteiro, ou seja, mesmo que determinado microsatlite ocorra em muitos stios diferentes do genoma, a PCR s amplificar um stio, aquele cuja seqncia flanqueadora corresponde seqncia do par de prmers. Tais stios so chamados stios etiquetados por seqncia (STS) (Nicholas, 1999) Como em qualquer produto de PCR amplificado a partir de prmers de seqncia nica, apenas uma ou duas bandas so produzidas por animal: uma banda se o animal homozigoto e duas se ele heterozigoto. Os produtos de PCR de microsatlites so extremamente teis para o mapeamento gnico porque cada par de prmers corresponde a um stio especfico de um cromossomo e porque h muitos alelos diferentes em cada stio, isto , eles so extremamente polimrficos (Nicholas, 1999) C) Polimorfismo Simples em Base nica ou Single Nucleotide Polimorphism (SNP): Atualmente, o desenvolvimento de marcadores baseados em polimorfismo em um nico par de bases (single nucleotd polymorphism SNP) oferecem novas perspectivas para a identifcaco de QTLs, sendo que no homem aproximadamente um SNP para cada kilobase tem sido identificado (Chakrevarti, 1999) Os SNPs tem como desvantagens em relao a microsatlites a existncia s em 2 alelos, determinando baixo polimorfismo (a chance de uma nova mutao rara) e os custos so mais elevados . A vantagem, em relaco a microssatlites a frquencia com que os SNP aparecem, ou seja, determinando um mapa gnico mito mais denso.

UTILIZAO DE MARCADORES NO MAPEAMENTO GENTICO Provavelmente existem entre 50.000 a 60.000 genes em cada espcie de mamferos e aves. Gostaramos de poder identificar cada um destes genes, determinar sua funo e

documentar a extenso de sua variao allica. O principal passo inicial nesta via de descobertas a criao de um mapa gentico de cada espcie. A principal funo dos marcadores no mapeamento gentico a descoberta de novos QTLs, ou seja genes hipotticos, relacionados com caractersticas quantitativas, isto , sabe-se que existem mas no sabe-se sua localizao exata, somente o fato de que eles esto entre dois marcadores. Exemplo: M1 (Nicholas, 1999). Os procedimentos para identificao de genes relacionados as caractersticas de interesse econmico podem substancialmente ser divididas em anlises de ligao gnica com marcadores annimos (gentica posicional) e estudos de associao com genes candidatos (Thaler Neto, 2000) Genes candidatos so eleitos baseados em evidncias de que determinado peptdeo codificado pelo gene influencia a(s) caracterstica(s) de interesse. O processo mais difcil justamente a escolha de genes candidatos adequados (marcadores tipo I), visto que a maioria das caractersticas de natureza quantitativa, influenciadas por vrios genes e no h garantia de que no locus que codifica o peptdeo venha a ser encontrado polimorfismo possvel de ser explorado (Thaler Neto, 2000). Por exemplo: a leptina o gene regulador de gordura corporal nos ratos. Entretanto, no humano no teve grandes influncias. Simplificadamente, genes candidatos so genes que se supe ter influncia em virtude da ao biolgica do peptdeo codificado por este gene ou devido ao fato destes terem efeito j conhecido em outras espcies e existirem regies homlogas ou semelhantes entre estas espcies. Neste caso, lana-se mo de estudos de associao em que se comparam populaes que apresentam caractersticas contrastantes, verificando-se o gentipo para o referido gene e diferente nas populaes negativas e positivas. Existem exemplos de genes identificados atravs desta metodologia em diferentes espcies. Em bovinos de leite foram identificados os genes para a deficincia de adeso de leuccitos (BLAD) e deficincia de uridina monofosfato sintetase (DUMPS) (Barendse e Fires, 1999). Entretanto, as frustraes com genes candidatos tem sido maiores do que os xitos.
3cM

QTL

2cM

M2. O QTL pode ser positivo (aumento a

produo de uma caracterstica, por exemplo leite) ou QTL negativo (diminui o desempenho)

No Genome Scan, conhecido tambm como varredura do genoma, posiciona-se marcadores genticos por todo o genoma. Esta anlise de ligao gnica com marcadores distribudos uniformemente por todo o genoma tem se mostrado eficiente na identificao de QTLs (Thaler Neto, 2000) A princpio, tem-se uma caracterstica mas no sabe-se em que local (locus) do cromossomo existem genes que influncia esta. Em funo disso utiliza-se marcadores distribudos em todo o genoma, e escaneia-se a populao. Por anlise estatstica da populao verifca-se uma provvel regio onde se encontra o(s) gene(s) para a caracterstica testada. Nesta regio suspeita ser feita um teste mais minucioso denominado Fine Mapping (Mapeamento Refinado), ou seja, aumento dos marcadores na regio suspeita. A partir disto tornam-se importante os genes candidatos, para a comparao com outras espcies mais conhecidas. A comparao entre regies homlogas de diferentes espcies pode ser feita atravs de hibridizao in sito com fluorescncia (FISH), tcnica laboratorial avanada utilizada por localizar uma regio responsvel por uma determinada caracterstica em diferentes espcies (Nicholas, 1999). Esta tcnica denominada de genes candidatos posicionais. O primeiro gene isolado para uma caracterstica descrita em bovinos, usando o mapa gentico como base foi o da hipertrofia muscular ou duplo msculo, localizado no cromossomo 2 (Charlier et al.,1995). Subseqentemente, a localizao foi delimitada a uma pequena regio e a partir de descobertas sobre o efeito do gene da miostatina, no crescimento de camundongos foi identificado o efeito de mutaes neste gene sobre o duplo msculo em bovinos (Barendse e Fries, 1999). UTILIZAO DOS MARCADORES NA SELEO ASSISTIDA POR MARCADOR Assim que tenham sido identificados marcadores ligados a QTLs eles podem ser usados em programas de seleo que chamado ento de seleo assistida por marcadores ou marker assisted selection (MAS). A partir de mapas genticos faz-se a identificao de marcadores de DNA ligados a locus relacionados com caractersticas quantitativos (QTLs). Sendo assim procede-se a seleo fenotpica dos animais quanto a determinada caracterstica e conjuntamente aplica-se marcadores genticos a fim de encontrar regies ou genes que manifestam somente na vida adulta e com isso pode-se descobrir se o indivduo possui alelos desejveis ou no, j quando nasce.

Assim inclui-se esta informao no processo de seleo do candidato, servindo como uma informao adicional na determinao do valor do animal quanto a expresso de determinada caracterstica gentica, aumentando-se a previso de seleo.(van der Werf,1999 e Nicholas,1999) Bibliografia: Chakravarti, A. Population genetics: making sense out of a sequence. Nature genetics, v. 21, p. 56-60, 1999 Charlier, C.; Coppieters, W. Farmir, F. et al. The mh gene causing double muscling in cattle maps to bovine chromosome 2. Mammalian Genome, v. 6, p. 788-792, 1995. Barendse, W.; Fries, R. Genetic linkage mapping, the gene maps of cattle and lists of loci. In: Fries, R.; Ruvinsky, A. The genetics of cattle. Oxon: CABI, 1999. p. 329-364. Ferreira, M.E.; Grattapaglia, D. Introduo ao Uso de Marcadores em Anlise Gentica. 2ed. Braslia. EMBRAPA CENARGEM, 1996, 220 p. Haley, C. Advances in quantitative trait loci. In: From Jay Lush to genomics: visions from animal breeding and genetics. Iowa: Iowa State University,, 1999. p. 47-59. Hines, H.C. Blod groups and bichemical polymorphisms. In: Fries, R.; Ruvinsky, A. The genetics of cattle. Oxon: CABI, 1999. p. 77-121. Nicholas, F. W. Introduo Gentica Veterinria. Porto Alegre, 1999. 326 p. Thaler Neto, A., Fries, R., Thaller, G.Risk Ratio as parameter for the genetic characterization of complex binary traits in cattle. A simulation study under various genetic models using halfsib families. Journal of Animal Breeding and Genetics. v.117, n.3, p.153 - 168, 2000. Thaler Neto, A. Situao atual e perspectivas de utilizao da gentica molecular no

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