Acta Farm.

Bonaerense 21 (4): 255-8 (2002)

Recibido el 7 de diciembre de 2001 Aceptado el 7 de septiembre de 2002

Trabajos originales

Atividade Antimicrobiana in vitro de Extratos Hidroalcolicos de Psidium guajava L. sobre Bactrias Gram-Negativas
Alessandra de Albuquerque Tavares CARVALHO*1, Maria Carmeli Correia SAMPAIO 2, Fabio Correia SAMPAIO 2, Arquimedes Fernandes Monteiro de MELO 3, Ksia Xisto da Fonseca Ribeiro de SENA 4, Alda de Andrade CHIAPPETA 4 & Jane Sheila HIGINO 3
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Aluna do Doutorado em Odontologia, Universidade Federal da Paraba, R. Dom Joo de Souza, 122/901, Madalena, 50610-070, Recife-PE, Brasil. 2 Programa Integrado de Ps-Graduao em Odontologia, Universidade Federal da Paraba, 58051-900, Joo Pessoa-PB, Brasil; 3 Departamento de Farmcia, Universidade Federal de Pernambuco, 50670-901, Recife-PE, Brasil; 4 Departamento de Antibiticos, Universidade Federal de Pernambuco, 50670-901, Recife-PE, Brasil.

RESUMO. Este estudo teve como objetivos testar in vitro pelo mtodo de difuso em disco de papel a susceptibilidade de bactrias Gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp, Proteus spp, Klebsiella spp, Salmonella spp) aos extratos hidroalcolicos da folha e do caule da Psidium guajava (goiabeira vermelha) e determinar sua CMI em meio slido. Verificou-se que excetuando Klebsiella spp, todas as bactrias testadas foram inibidas pelos dois extratos utilizados, sendo que o extrato da folha apresentou melhor atividade para Salmonella spp (17,3mm) e o extrato do caule foi mais ativo para Proteus spp (18,3mm). A CMI variou de 1,8 a 2,4 mg/mL no extrato da folha e de 1,2 a 2,4 mg/mL no extrato do caule. Para Shigella spp e Pseudomonas aeruginosa, a CMI foi 1,2mg/mL no extrato do caule. No houve diferenas estatisticamente significantes entre os dois tipos de extratos tanto nos testes antimicrobianos como nos valores da CMI. SUMMARY. In vitro antimicrobial activity of hydro-alcoholic extracts of Psidium guajava L. against gram-negative bacteria. The aim of this study was to test in vitro by a standardized single disk method the susceptibility of gram-negative bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp, Proteus spp, Klebsiella spp, Salmonella spp) in relation to hydro-alcoholic extracts of leaf and branch of Psidium guajava L. (known as goiabeira vermelha). A second aim was to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) in a solid medium. Except for Klebsiella spp, all tested bacteria were inhibited by both extracts. Leaf extract proved to be more active against Salmonella spp (17.3 mm) while branch extract showed better results against Proteus spp (18.3 mm). Minimum Inhibitory Concentration varied from 1.8 up to 2.4 mg/mL of leaf extract whereas for branch extract it varied from 1.2 up to 2.4 mg/mL. For Shigella spp and Pseudomonas aeruginosa MIC values were 1.2 mg/mL of branch extract. In general, no statistically significant differences were observed between both extracts when testing antimicrobial activity and MIC.

INTRODUO As primeiras evidncias do uso de plantas com fins teraputicos datam de 460 a.C 1,2. No entanto, as primeiras informaes sobre o uso sistemtico de plantas como medicamentos datam da ndia Antiga, atravs do sistema de medicina vigente naquela poca, possivelmente do Ayurveda (Cincia da Vida) 3. No Brasil, bem como em outros pases da America Latina, a fitoterapia constitui-se em uma alternativa teraputica econmica em relao aos medicamentos alopticos uma vez que caracteriza-se pela utilizao direta de plantas no

tratamento das doenas 2,4. Neste contexto, inmeras pesquisas vm comprovando cientificamente a eficcia de algumas plantas, a exemplo da goiabeira vermelha (Psidium guajava L.), como alternativa teraputica de certas patologias 5. Psidium guajava L. uma rvore de pequeno porte, pertencente famlia Myrtaceae, que apresenta caule tortuoso e esgalhado, recoberto por casca fina muito aderente, e fruto globoso ou piriforme, amarelado, de 3 a 6 cm de dimetro. Suas folhas apresentam taninos, leos essenciais (cariofileno, nerolidiol, -bisaboleno, aromadendreno, p-selineno, -pineno e 1,8-ci-

PALAVRAS-CHAVE: Psidium guajava, Atividade antimicrobiana, Bactrias gram-negativas. KEY WORDS: Psidium guajava, Antimicrobial activity, Gram-negative bacteria.
* Autora a quem deve ser endereada a correspondncia. E-mail: aatcarvalho@ig.com.br

ISSN 0326-2383

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neol), triterpenides (cido olenico, cido urslico, cido cateclico, cido guayavlico, cido maslnico, cido elgico) e -sitosterol. Seu caule apresente principalmente taninos 6, 7. Esta espcie reconhecida popularmente como medicinal, sendo utilizada contra clicas e diarrias, tendo tambm ao diurtica 8-10. Adicionalmente apresenta ainda atividade antimicrobiana 11 e hipoglicemiante 12. Seus extratos tm mostrado, in vitro, atividade inibitria para diferentes microrganismos 13-15 .Vrios autores demonstram a atividade do extrato aquoso da folha contra Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Sarcina lutea, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Staphylococcus albus e Staphylococcus aureus 15-19 . A literatura refere-se ainda a uma atividade antifngica, atravs do macerado hidroalcolico de suas folhas, contra Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis e Candida stellatoidea 20 e Aspergillus fumigatus, Arthrinium sacchari e Chaetomium funicola 21 . O propsito do presente estudo foi testar in vitro a susceptibilidade de espcies de bactrias Gram-negativas, em particular Enterobactrias, aos extratos hidroalcolicos da folha e do caule da Psidium guajava e determinar sua CMI (Concentrao Mnima Inibitria). MATERIAIS E MTODOS Material botnico e obteno dos extratos Foi estudada a forma vermelha de Psidium guajava L. (Goiabeira vermelha). O material botnico foi obtido no canteiro de plantas do Biotrio do Departamento de Antibiticos do Campus da UFPE, Recife (Pernambuco) e identificado pelo botnico por comparao com material herborizado no Herbarium UFP. Aps a coleta, folhas e caule foram separados e secos em estufa a 35 C durante uma semana, para eliminao da umidade e estabilizao do contedo enzimtico; o material foi reduzido a p, em moinho eltrico e pesado. Os extratos foram obtidos em etanol/gua a 70%, na proporo de 800 mL/150 g do material botnico, por macerao durante 15 dias temperatura ambiente e evaporados secura em rota evaporador, aps pesagem, o material obtido foi mantido em dessecador . Para realizao dos testes os extratos foram dissolvidos em etanol e em DMSO (Dimetilsufxido). Microrganismos-teste e preparao dos inculos Os testes foram realizados frente a bactrias

Gram-negativas, fornecidas pelo Banco de Cultura do Departamento de Antibiticos da UFPE e pelo Setor de Bacteriologia do Laboratrio de Patologia Clnica da UFPE, tendo sido utilizados os microrganismos: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp, Proteus spp, Klebsiella spp, e Salmonella spp. Os inculos foram obtidos a partir de culturas recentes dos microrganismos-teste, preparando-se suspenses padronizados pela turvao equivalente ao tubo 0,5 da escala de MacFarland, em soluo fisiolgica 22. Testes de atividade antimicrobiana A atividade antimicrobiana foi verificada pelo mtodo de difuso em disco de papel (tipo 3 com 6 mm de dimetro) no meio gelosado Mller Hinton (Oxoid). As suspenses dos microrganismos-teste foram semeadas na superfcie do meio, em placas de Petri, com auxlio de ala de Drigalsky (100 L /placa). Foram utilizados discos de 6mm de dimetro, embebidos com 20 L de uma soluo a 100mg/mL dos extratos em estudo. As placas foram incubadas a 35 C durante 24 h. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos em mm pela mdia aritmtica do dimetro dos halos de inibio formado ao redor dos discos nas 3 repeties 23. O teste controle foi realizado com discos embebidos em DMSO. Determinao da Concentrao Mnima Inibitria (CMI) Quantidades variadas da soluo a 30 mg/mL do extrato (1,0, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,1mL) foram pipetadas em placas de Petri esterilizadas. Em seguida foi adicionado o meio Muller Hinton agar, completando-se o volume para 10 mL e homogeneizando-se o conjunto. Os microrganismos-teste foram semeados em forma de estrias sobre a superfcie do meio. As culturas foram incubadas durante 24 h a 35 C, considerando-se o intervalo entre a ltima placa onde houve crescimento bacteriano e a primeira onde houve inibio 24. Anlise Estatstica Na anlise estatstica dos dados foram utilizados o teste de Kruskal-Wallis, de Mann-Whitney U e o teste de comparaes mltiplas de Dunn. Os testes foram considerados significantes quando o valor P foi menor que 0,05. No teste de comparaes mltiplas de Dunn foi adotado o nvel global de significncia de 0,05.

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RESULTADOS E DISCUSSO Das 150 g de material utilizado, foram obtidas 14,76 de extrato seco do caule e 9,95 de extrato seco de folha. No teste de difuso em disco, com exceo de Klebsiella spp, todas as bactrias testadas foram inibidas pelos dois extratos, sendo que o extrato da folha apresentou melhor atividade para Salmonella spp, com um dimetro mdio dos halos igual a 17,3 mm; o extrato do caule foi mais ativo para Proteus spp com mdia dos

halos igual a 18,3 mm (Tabela 1). O resultado do teste de Kruskal-Wallis demonstrou que houve diferenas significativas entre os trs tratamentos com respeito a sensibilidade de bactrias Gram-negativas (p = 0,009, Tabela 1). O teste de comparaes mltiplas de Dunn indicou que o tratamento DMSO (controle) foi estatisticamente diferente do tratamento extrato da folha e extrato do caule. Entretanto, o tratamento extrato da folha foi equivalente ao extrato do caule (Tabela 1).

Microrganismo

Extrato da folha (A) (Dimetro do halo em mm)

Extrato do caule(B) (Dimetro do halo em mm)

DMSO (C) (Controle)

Escherichia coli Salmonella spp Shigella spp Proteus spp Pseudomonas aeruginosa Klebsiella spp

15,0 17,3 13,0 17,0 12,6 0

16,0 14,6 14,0 18,3 14,0 0

0 0 0 0 0 0

Tabela 1. Sensibilidade de bactrias Gram-negativas aos extratos hidroalcolicos de folha e caule de Psidium guajava L. pelo teste de difuso em disco (2mg/disco). *Teste de Kruskal Wallis (Ax BxC); Z = 8,683; p=0,009. ** Teste de Mann-Whitney U (AxB) ; Z = 0,241; p =0,809

Os resultados obtidos so semelhantes aos encontrados na literatura, que apontam uma atividade para Escherichia coli no extrato metanlico da folha e ausncia de atividade para Klebsiella pneumoniae 25. Halos de inibio ligeiramente menores como os encontrados por Vieira et al. 26 refletem diferenas metodolgicas incluindo a formulao do extrato. Embora no exista um padro de concentrao para comparao dos resultados da atividade dos extratos brutos da goiabeira, uma vez que seu princpio ativo no ainda conhecido, algumas das bactrias testadas (E. coli e Pseudomonas aeruginosa) so consideradas sensveis a antibiticos de ltima gerao como o Norfloxacin, com halos de tamanho maior que 17 mm 27. Os resultados obtidos no presente trabalho, mostram halos de 16 mm para E. coli, e 14 mm para P. aeruginosa. Tratando-se de princpios ativos de fitoterpicos, esses microrganismos so considerados sensveis na concentrao testada. Gnan & Demello 19 referem uma atividade frente Staphylococcus aureus no extrato aquoso da folha da goiabeira (Psidium guajava) na concentrao de 6,5 mg/mL. Por outro lado, a

atividade antibitica do extrato aquoso da folha desta espcie (numa concentrao acima de 5 g/mL) foi observada tanto nos Staphylococcus aureus quanto nos Streptococus -hemolticos do grupo A 11. Os extratos hidroalcolicos do caule e da folha apresentaram uma CMI de 1,2 mg/mL e 1,8 mg/mL, respectivamente para Shigella spp e Pseudomonas aeruginosa (Tabela 2). Estes resultados corroboram os referidos na literatura no que diz respeito Pseudomonas aeruginosa 16.
Microrganismos Extrato da folha Extrato do caule (A) (B)

Escherichia coli Salmonella spp Shigella spp Proteus spp Pseudomonas aeruginosa

2,4 2,4 1,8 1,8 1,8

1,8 2,4 1,2 1,8 1,2

Tabela 2. Determinao da CMI de extratos hidroalcolicos de folha e caule de Psidium guajava L. (mg/mL). * Mann-Whitney U (AxB); Z=1,556; p=0,397. **Mann-Whitney U (AxB); Z= -1,247; p=0,212

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O teste de Mann-Whitney U mostra que estatisticamente no houve diferena significativa (p = 0,397 ou p = 0,212) entre os tratamentos extrato da folha e extrato do caule no que diz respeito determinao da CMI (Tabela 2). CONCLUSO Conclui-se que os extratos hidroalcolicos da folha e do caule da Psidium guajava tm atividade antimicrobiana para bactrias Gram-negativas: Escherichia coli, Salmonela spp, Shigella spp, Proteus spp e Pseudomonas aeruginosa. Ambos extratos apresentaram resultados estatisticamente semelhantes contra os microrganismos testados.

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