Resumo Existem muitas bactrias degradadoras de PAH em sedimentos de mangue e, a fim de explorar o seu potencial de degradao, as amostras de sedimentos

superficiais foram coletados a partir de uma rea de mangue em Fugong, Longhai, Provncia de Fujian de China. Um total de 53 estirpes de bactrias degradadoras de PAH foram isoladas a partir do sedimentos de mangue, constitudos de 14 linhagens de fenantreno (PHE), 13 linhagens de pireno (Pyr), 13 linhagens de benzo [a] pireno (BAP) e 13 amostras de PAH mista (Phe+Pyr+Bap) bactrias degradadoras. Todas as colnias foram identificadas por seqenciamento do 16S rDNA. Com base na informao dos perfis bacterianos obtidos de PCR-DGGE durante a cultura de enriquecimento por batelada, Phe, Pyr, Bap e consrcios HAP-degradante mista consistiu de F1, F2, F3, F4 e F15 estirpes, B1, B3, B6 e B7 e estirpes B13, P1, P2, P3, P5 e estirpes P7, M1, M2, M4, M12 e M13 cepas, respectivamente. Alm disso, a capacidade de degradao destes consrcios foi tambm determinada. Os resultados mostraram que tanto Phe e consrcios HAP-degradante mista tiveram o maior capacidade para degradar a Phe num meio lquido, com mais de 91% sendo degradados em 3 dias. Mas os percentuais de biodegradao de Pyr por Pyr degradante de consrcio e por Bap Bap-degradante consrcio eram relativamente menor do que o consrcio Phe-degradantes. Estes resultados sugerem que uma maior degradao de HAP dependia ambos presentes o consrcio bacteriana e do tipo de composto HAP. Alm disso, utilizando o mtodo de anlise bacteriana comunidade estrutura, onde o consrcio consistem diferentes HAPdegradantes bactrias, a informao a partir dos perfis de PCR-DGGE poderia ser usado no biorremediao de HAPs no futuro.

Introduo. Mangues so regies pantanosa entre-mars ao longo das costas de regies tropicais e subtropicais. Eles tambm so particularmente suscetveis poluio por leo, uma vez que so geralmente em regies ativa na produo de petrleo, transporte e outras atividades antrpicas. Hidrocarbonetos aromticos policclicos (HPAs) so ubquos no ambiente e causam grandes preocupaes ambientais por causa de sua persistncia, toxicidade, mutagenicidade e carcinogenicidade. Entradas antropognicas de HPAs de deposio atmosfrica, emisso de pilha industrial, derramamentos de petrleo, o trfego de navios, escoamento urbano e descarga ilegal de efluentes industriais tm causado significativo acmulo de HPAs em ambientes marinhos. Concentraes extremamente elevadas de PAHs (superior a 100.000 ng/g) foram registrados em sedimentos

costeiros perto de centros urbanos e industriais. Ecossistemas de mangue esto sujeitos contaminao por esses altos nveis de HAP. O processo principal para a remoo bem sucedida e eliminao de PAHs do ambiente , no entanto, a transformao microbiana e degradao, e degradao microbiana acredita-se ser um dos principais processos pelos quais HAP podem ser removidos a partir de sedimentos contaminados. Objetivo. (1) isolar as diferentes bactrias degradadoras de PAH, incluindo Phe, Pyr, Bap e PAHs misto de sedimentos superficiais do mangue de Fugong; (2) Fazer um screening das bactrias dominantes durante a cultura de enriquecimento em batelada em sistema de co-cultura de acordo com informaes de perfis de DGGE; (3) combinar essas cepas dominantes como um consrcio e determinar a sua capacidade para degradar HAPs diferentes; (4) encontrar as caractersticas de degradao de consrcios diferentes para diversos HAPs Materiais e metodos. Area de estudo e amostra Isolamento e enriquecimento das culturas de bactrias de sendimento de manguezais Meio mineral adicionado de Phe, Pyr e Bap. Identificao das linhagens isoladas Cada purificado foi identificado utilizando 16S rDNA sequenciao aps a amplificao do gene por PCR, utilizando o conjunto de iniciadores 27F (Escherichia coli posio 8e27, 50-AGA GTT TGA GCT TGG CTC AG-30) e 1492R (E. coli posio 1510e1492 , 50-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-30). Quase um comprimento total da sequncia bacteriana rDNA 16S foi amplificado por este conjunto de iniciadores. Os produtos de PCR (cerca de 1,5 kb) foram purificados em gel e subsequentemente clonado no vector pMD18-T (Takara) para sequenciao de ADN automatizado. Banco de dados pesquisas com as determinadas seqncias de DNAr 16S foram conduzidas usando o programa BLASTN mantido pelo Centro Nacional de Informaes sobre Biotecnologia (NCBI).

Amplificao do 16S rDNA V3 e analise de PCR-DGGE. Os consrcios oitava enriquecido em diferentes HPAs sistema de co-cultura Foram extrados DNA. Todas as colnias em 2216E slidos, 2216E/2 e MM2 foram apanhados e tambm extrado DNA. Iniciadores universais 341F (50-TAC AGG GGG CAG CAG-30) e 517R (50-ATT ACC GCG GCT GCT GG-30) foram utilizados para amplificar a regio V3 do rDNA 16S bacteriano(correspondente posio 341-517 em E. coli rRNA) ligado a uma ncora GC (50-CGC CCG CCC CCG CGC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC C-30) ligado ao iniciador forward. DGGE foi realizada com gel de poliacrilamida 8% (peso / vol) em Tampo TAE (20 mM Tris pH 7,5 acetato, acetato de sdio 10 mM, 0,5 mM EDTA Na2-) com um gradiente linear variando de qumica 40% a 60%. Solues desnaturantes foram preparadas por mistura dos volumes adequados de duas solues estoque 0 e 100% desnaturantes (42% g / mL, ureia e 40% vol / vol formamida. Gis foram executados em uma tenso constante de 110 V para 12 horas a 60 C. Aps a eletroforese, eles foram corados em um mximo de 0,5 mg/L soluo de brometo de etdio durante 30 min. Biodegradao de HAPs por consrcio de bactrias degradadoras de HAPs. A biodegradao de HAP em cultura lquida foi realizada em frascos cnicos. Uma alquota das culturas frescas no final da fase exponencial foi adicionado assepticamente a 20 mL meio lquido contendo MM2 Phe, Pyr, BAP e da mistura dos HAP trs (Phe, Pyr e BAP, cada uma a uma concentrao final de 50 mg/L) a uma densidade inicial de bactrias de 0,2 DO 600nm. O meio lquido MM2 contendo a mesma quantidade de HAP diferente, mas sem a inoculao bacteriana foi utilizado como control para determinar qualquer perda abitica de HAP. Os frascos foram agitados num agitador orbital a uma velocidade de 150 rpm a 30 C no escuro. Frascos em triplicata de cada tratamento foram coletados nos dias 3, 6, 10, 15 e 20 para a anlise de PAHs residual usando HPLC. Resultados. Isolamento e identificao. A identificao dos isolados foi feita atravs do sequenciamento da regio 16S do rDNA. Os resultados mostraram que todas as linhagens esto agrupadas em 4 filos, incluindo 38 linhagens de proteobacteria (a-proteobacteria, 19 linhagens; bproteobacteria, 3 linhagens; g-proteobacteria, 16 linhagens), 4 linhagens de Bacteroidetes (Sphingobacteria, 2 linhagens; Flavobacteria 2 linhagens), 6 linhagens de Actinobacteria e 6 linhagens de Firmicutes (Bacilli, 6 linhagens).

Analise da estrutura da comunidade e do conscio usando PCR-DGGE O mtodo DGGE foi utilizado para investigar as alteraes das composies bacterianas e a dinmica da comunidade no decurso de enriquecimento e o seu perfil demonstra as alteraes da estrutura da comunidade bacteriana para original, primeiro co-cultivadas, finais co-cultivadas amostras e HAP-degradadoras individuais de sedimentos mangue. Fig. 2 ilustra como a composio das comunidades bacterianas em culturas enriquecidas deslocado notavelmente a partir das amostras originais para final de co-cultura. Alm disso, as bandas de estirpes isoladas foram bem correlacionados com as do final de co-cultura no perfil DGGE. Houve uma intensidade diferente para cada banda no final de co-cultura e as bandas de forte intensidade representam bactrias dominantes nos consrcios. Esta informao sugere como selecionar as cepas HAP-degradadoras das culturas mistas mais eficientes. Estirpes, designadas como F1, F2, F3, F4 e F15 como degradadores de Phe; B1, B3, B6 e B7 e B13 como degradadores de Pyr; P1, P2, P3 e P5 como degradadores de BAP; e M1, M2, M4, M12 e M13 no misto HAP degradadores, foram seleccionados a partir de cultura de enriquecimento. Based on the individual bacterial bands of the well batch and their stronger intensity, and the bands in co-culture, these selected isolates suggested that they were dominant while competing with the other strains in this culture system. (Essa parte no consegui entender) Biodegradao de HAP em meio liquido por consrcio bacteriano A habilidade de degradadao dos HAPs pelas bactrias foi determinada em meio liquido de MM2 adicionado de HAP isoladamente e em misturas de Phe, Pyr e Bap. Phe teve a melhor biodegradao atingindo 90% de degradao em 3 dias e quase 100% em 20 dias, tanto para cultura simples ou misturadas. Pyr e Bap tiveram as piores degradaes. Pyr quase no foi degradado em 3 dias e depois de 20 teve uma degradao <15%. O mesmo aconteceu com Bap. Tanto para Pyr como para Bap, entre o 15 e o 20 dia ouve um aumento na degradao indicando que as MAPs (Molculas de Alto Peso) precisam de mais tempo para degradarem. Discusso. Um total de 53 bactrias degradadores, 14 linhagens para o composto Phe, 13 linhagens para o composto Pyr, 13 linhagens para o composto Bap e 13 linhagens para a mistura de compostos PAH que foram isolados a partir de sedimentos de mangue. Essas linhagens proteobactrias, foram agrupados em sete classes, incluindo ag-proteobactrias, Sphingobacteria, b-proteobactrias,

Flavobactrias, Actinobacteria e Bacilli.Meanwhile, os gneros Sphingomonas e Rhodobacteraceae ligado ao grupo a-proteobactrias, Pseudomonas, Marinobacter e Vibrio ligado ao grupo de gproteobacteria e Rhodococcus, e Bacillus associada Actinobacteria e Bacilli, tm sido descritos como linhagens hidrocarbonoclsticas. O mtodo de PCR-DGGE foi introduzido para estudar a relao entre as alteraes das comunidades bacterianas degradadoras. Concluso A interao entre diferentes espcies de bactrias na biodegradao de HPAs uma considerao importante no desenvolvimento de estratgias de biorremediao para a remoo de HPAs. Alm disso, claro que uma maior capacidade de degradao de HAP dependia dos consrcios bacterianos e do tipo de compostos de HAP envolvido. Utilizando mtodos de analises da estrutura da comunidade bacteriana, em que os consrcios consistem em diferentes bactrias HAP-degradantes, a informao a partir dos perfis de PCR-DGGE poderia ser usado na biorremediao de HPAs no futuro.