UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CINCIAS DA SADE - CCS DEPARTAMENTO DE CINCIAS FARMACUTICAS

TCNICAS DE CARACTERIZAO DE PROTEOMAS

ARTUR FELIPE COSTA AMORIM FARMCIA 6 PERODO BIOQUMICA 4

RECIFE, MARO 2012.

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Contedo
Introduo Aplicao do estudo do proteoma na indstria farmacutica Tcnicas aplicadas ao estudo Protemica Purificao Eletroforese Cromatografia por excluso molecular Focalizao isoeltrica Eletroforese bidimensional Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE ou HPLC) Identificao Espectrometria de massa Concluso Referncias 3 4 4 4 4 5 6 7 8 9 9 11 11

Introduo
Proteoma so todas as protenas expressas por um genoma em um organismo. Agora, que a anlise do genoma est quase concluda, a protemica o prximo passo para compreender como as enzimas interagem no organismo. Enquanto que o DNA esttico, as protenas podem sofrer mudanas com o desenvolvimento de um organismo ou com a mudana de seu ambiente. Devido a isto, o proteoma mais complexo que o genoma, tanto relacionado ao nmero de combinaes, pois o DNA possui apenas quatro variveis e as protenas podem ser formadas por at vinte tipos de aminocidos, como tambm h o fator de desenvolvimento do organismo e as interaes entre as mesmas. Logo o estudo da proteoma, a protemica, pode revelar e ser mais precisa que a genmica, pois as riquezas de informaes obtidas com elas alm de maiores so mais precisas. Com a protemica podemos desvendar o mecanismo de algumas doenas, desenvolver novos frmacos mais precisos, marcadores biolgicos para a identificao de patologias e tambm utilizar seus conhecimentos na rea agrcola com a criao de agrotxicos especficos. uma metodologia que procura documentar a distribuio geral das protenas nas clulas, identificar e caracterizar protenas individuais de interesse e principalmente elucidar as suas funes associadas. A protemica baseia-se em fundamentos bioqumicos, biofsicos e de biotecnologia para identificar e quantificar-las. A principal tcnica aplicada pelos pesquisadores a separao das protenas atravs da eletroforese bidimensional, onde as protenas so, primeiramente, fracionadas pelo seu ponto isoeltrico e posteriormente pelo seu peso molecular. Esta tcnica ajuda a isolar as protenas. J a utilizada para a identificao das protenas comumente utilizada a espectrometria, que se baseia na interao da molcula com um campo eltrico e a velocidade de seu deslocamento. Assim possvel identificar a seqncia de aminocidos e a estrutura tridimensional desta protena.

Aplicao do estudo do proteoma na indstria farmacutica

A principal aplicao da protemica na farmacologia o desenvolvimento de compostos menos nocivos e mais especficos nas patologias. Mesmo com o projeto proteoma no finalizado, quando um pesquisador possui ao conhecimento sobre uma protena, como sua funo e interao com o organismo, possvel iniciar a elaborao de um possvel uso desta protena como medicamento. Uma das tcnicas aplicadas pode ser a comparao de protenas presentes no plasma de uma pessoa saudvel e de um enfermo. Um exemplo prtico a utilizao desta tcnica para a descoberta de um possvel cncer. Onde com a alterao estrutural de alguma protena poder indicar que algum tecido est sofrendo uma mutao e se transformando num carcinoma.

Tcnicas aplicadas ao estudo Protemica

Purificao
As clulas produzem varias protenas e quando estas so extradas nunca se encontra separadas. Para isto foi desenvolvido mtodos que permitem a separao delas, identificando-as. Eletroforese Baseia-se na separao de protenas de acordo com suas cargas. As protenas so dissolvidas em uma soluo tampo com um pH determinado e ento so postas para migrar de acordo com suas diferenas de cargas no campo eltrico induzido. Cargas positivas migraram para o plo negativo (ctodo) e as negativas para o plo positivo (nodo). Caso o pH da soluo, no qual a protena esteja dissolvida, seja igual ao ponto isoeltrico da mesma, a protena no migrar. A tcnica assemelha-se muito com a cromatografia comum. So utilizadas fases estacionrias como gis polimricos, amido ou papel, os quais sempre estaro saturados pela soluo tampo. Esta tcnica apresenta como dificuldade separa protenas que possam possuir 4

cargas eltricas semelhantes. Isto pode ser solucionado com a utilizao da eletroforese bidimensional que ser comentada adiante.

Fig. 1 - Eletroforese

Para facilitar a identificao das protenas na placa cromatografia so adicionados corantes especiais. As coloraes utilizadas so o azul de Comassie e o nitrato de prata. Sendo a impregnao por prata duas mil vezes mais sensvel que a de Comassie.

Fig. 2 - Tcnicas de colorao para eletroforese.

Cromatografia por excluso molecular Tcnica baseada na diferena de tamanho das protenas. Usa-se um gel poroso na forma de pequenas esferas insolveis numa coluna cromatogrfica. As protenas menores tendem a penetrar no poro do gel, devido a este estar preenchido pelo solvente, e ali ficam solubilizadas e retidas. J as maiores migram com o eluente e so separadas primariamente.

Fig. 3 - Exemplo do mecanismo da cromatografia de excluso

Focalizao isoeltrica Consiste na separao das fraes proticas atravs dos seus pontos isoeltricos. Esta tcnica baseada na formao de um gradiente de pH, obtido pelo uso de substncias conhecidas como anflitos, que so geralmente cidos polimricos sintticos (e.g., poliaminocidos, cidos policarboxlicos ou cidos polissulfnicos). A aplicao de um campo eltrico na mistura de anflitos gera a formao de um gradiente de pH. Os anflitos so mantidos em um meio onde se usa um catodo com pH alto, tipicamente hidrxido de sdio e um nodo com pH baixo, tipicamente cido fosfrico. As protenas, que so anfteras, iro se comportar de maneira idntica sero focalizadas em uma dada posio ditada pelo seu ponto isoeltrico (PI).

Fig. 4 - Focalizao isoeltrica

Eletroforese bidimensional As protenas so submetidas a dois processos (duas dimenses) consecutivos de separao baseados em propriedades diferentes das protenas. Assim, durante a primeira dimenso, denominada focalizao isoeltrica (IEF), as protenas so separadas em um gel de poliacrilamida que forma um gradiente de pH e migram at atingirem uma posio estacionria onde possuam carga lquida zero (ponto isoeltrico). Na segunda dimenso, as protenas separadas pela IEF so submetidas a uma eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida que separa as protenas de acordo com suas massas moleculares. Como os parmetros usados na primeira dimenso (ponto isoeltrico) e na segunda dimenso (massa molecular) so independentes, a separao das protenas mais eficiente.

Fig. 5 - Modelo de eletroforese bidimensional.

Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE ou HPLC) A HPLC (high performance liquid chromatography) assemelha-se com a tcnica de cromatografia por gravidade, porm nesta o fator mais importante a fora aplicada sobre o solvente que ir percorrer a coluna cromatogrfica. O solvente lquido contendo a mistura de protenas a serem analisadas posta a correr pela fase estacionria com a utilizao de uma bomba precisa de alta presso. A fase estacionria deve estar densamente empacotada para promover uma melhor resoluo durante a separao. Quanto menores as molculas e mais empacotadas da fase estacionria, maior ser a separao das molculas.

Fig. 6 - Modelo de CLAE

Identificao
Aps o isolamento de cada protena realizada outra etapa fundamental ao estudo do proteoma, a identificao. So utilizadas tcnicas capazes de reconhecer a seqncia e quais aminocidos esto presentes naquela protena. Espectrometria de massa A espectrometria de massa um mtodo para identificar os diferentes tomos que compe uma substncia. Um espectrmetro de massa bombardeia uma substncia com eltrons para produzir ons, ou tomos eletricamente carregados. Os ons atravessam um campo magntico que curva suas trajetrias de modos diferentes, dependendo de suas massas. O campo separa os ons em um padro chamado espectro de massa. A massa e a carga dos ons podem ser medidas por sua posio no espectro. Os cientistas identificam assim os elementos e istopos presentes na amostra.

Fig. 7 - Esquema de espectrometria de massa

Para analise de proteoma, em especial, utilizado o espectrmetro de massa MALDI-TOF. Antes de serem levadas ao analisador de massas, as protenas so submetidas a digesto com uma endoproteinase. Os peptdeos resultantes da digesto so pipetados junto de uma matriz para co-precipitarem na placa a ser inserida no aparelho. Quando o laser do espectrmetro de 9

massas incide sobre a mistura co-precipita da matriz e amostra, a matriz, que possui a propriedade de ionizar facilmente, protona os peptdeos da amostra e faz com que as espcies ionizadas passem do estado slido para o gasoso. A seguir, os peptdeos so submetidos a um campo eltrico e somente aqueles que foram protonados por interao com a matriz sero acelerados. Sabendo-se que o tempo de vo (Time of Flight ToF) de um on em um tubo livre de foras proporcional relao massa/carga da molcula, os ons carregados so liberados num tubo sob vcuo no qual programado, para uma dada voltagem e acelerao, o tempo de vo que o peptdeo leva para alcanar o detector. A intensidade do sinal eltrico em funo da razo massa/carga detectada por um processador de dados o qual gera o espectro correspondente e esta medida representada um pico de massa/carga de MS (Mass Spectrometry) que se comunica com um banco de dados para a identificao da composio elementar da molcula ionizada (no caso da sequncia do peptdeo analisado). A ferramenta de bioinformtica infere ainda um intervalo de confiana para o resultado fornecido. Neste contexto, a possibilidade de identificao da protena de interesse influenciada pelo processamento, pela qualidade e quantidade de protena presente na amostra, pelo nvel e tipo de possveis modificaes ps-traducionais, pela estringncia da busca e, de maneira especial, se a sequncia do peptdeo procurado j se encontra depositada no banco de dados da busca.

Fig. 8 - Esquema de Espectrmetro MALDI-TOF

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Concluso
A protemica ser de grande importncia para a medicina. O estudo delas promover um maior conhecimento sobre os mecanismos que o organismo adota diante uma patologia ou at mesmo ser possvel esclarecer como determinados processos biolgicos acontecem. A bioinformtica a principal aliada do estudo do proteoma. Com ela possvel separa, identificar e at mesmo elucidar as funes especificas das protenas. O desenvolvimento e as pesquisas ajudaro cada vez mais no processo desse estudo e a tornaram mais precisas.

Referncias
CARACTERIZAO DE PROTENAS http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula07BioqICaractProteinas20110314.pdf ACESSO EM 17/03/2012 PURIFICAO DE PROTENAS - http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula09BioqIPurProteinas.pdf ACESSO EM 17/03/2012 A PROTEOMICA E OS NOVOS PARADIGMAS http://www.unicamp.br/unicamp/unicamp_hoje/jornalPDF/ju309pg03.pdf ACESSO EM 17/03/2012 PROTEOMA http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio29/proteoma.pdf ACESSO EM 17/03/2012 ANALISE DE PROTEOMAS http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio07/analise.pdf ACESSO EM 17/03/2012 A QUIMICA ANALITICA DO PROTEOMA http://www.revistaanalytica.com.br/ed_anteriores/06/6%20Art%20Proteoma.pdf ACESSO EM 17/03/2012 TCNICA DE FOCALIZAO ISOELTRICA NA DETERMINAO DE VARIEDADES DE Helianthus tuberosus L http://www.ufpel.edu.br/tede/tde_arquivos/2/TDE-2006-03-06T05:45:03Z59/Publico/tese_marcelo_muller.pdf ACESSO EM 25/03/2012 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA http://www.cg.iqm.unicamp.br/material/qa582/hplc-Fracassi.pdf ACESSO EM 25/03/12 11