CAPTULO 2.4.5.

CAMPILOBACTERIOSIS GENITAL BOVINA

RESUMEN
Definicin de la enfermedad: La campilobacteriosis genital bovina (CGB) es una enfermedad venrea. El agente causal de esta enfermedad de transmisin sexual es Campylobacter fetus subespecie venerealis. La especie se subdivide en dos subespecies estrechamente relacionadas: C. fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. Por definicin, C. fetus subesp. venerealis se asocia con la CGB, y causa problemas de fertilidad con prdidas econmicas considerables, sobre todo en las regiones endmicas. Las infecciones bovinas por C. fetus subesp. fetus se asocian con el aborto y ocurren de forma ms espordica. Descripcin de la enfermedad: La CGB es una enfermedad venrea que se caracteriza por infertilidad, muerte temprana del embrin, y aborto. La enfermedad est causada por C. fetus subesp. venerealis, una bacteria con un tropismo acentuado en el sistema genital del ganado. La transmisin del agente causal se produce sobre todo durante la monta natural, y la presencia de C. fetus subesp. venerealis en el semen de los toros provoca un riesgo de difusin de la enfermedad mediante la inseminacin artificial. Identificacin del agente: Se pueden analizar las muestras tomadas de toros, vacas o fetos abortados para averiguar si est presente el agente causal. El organismo tiene forma de bacilo delgado, curvado y Gram negativo que puede tener una configuracin en forma de S, formas de gaviota y espirales, y puede cultivarse a 37C durante al menos 3 das en microaerobiosis. La confirmacin del aislamiento y la distincin entre las subespecies de C. fetus se puede llevar a cabo mediante procedimientos bioqumicos o moleculares. Tambin se puede utilizar la inmunofluorescencia, pero esa prueba no sirve para diferrenciar subespecies. Pruebas serolgicas: El enzimoinmunoensayo (ELISA) puede utilizarse para comprobar la inmunidad del rebao, pero no es adecuado para el diagnstico de la infeccin en los animales individuales. Mediante esta prueba no se puede diferenciar entre las infecciones causadas por las dos subespecies. Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Una vacuna puede prepararse con C. fetus subesp. venerealis y/o con C. fetus subesp. fetus, que comparte antgenos con C. fetus subesp. venerealis. Esta vacuna se inactiva con formalina y se puede administrar con una emulsin de aceite como adyuvante.

A. INTRODUCCIN
1. La enfermedad

La campilobacteriosis genital bovina (CGB), tambin conocida como campilobacteriosis venrea bovina [CVB]), es una enfermedad caracterizada por infertilidad, muerte precoz del embrin, y abortos en el ganado. El agente causal de esta enfermedad de transmisin sexual es el Campylobacter fetus subsp. venerealis. Puede aislarse del tracto genital del ganado (ej. esmegma prepucial, mucosidad vaginal) o de los rganos internos de los fetos abortados. Campylobacter fetus se divide en dos especies estrechamente relacionadas entre s: C. fetus subsp. venerealis y C. fetus subesp. fetus (28). Se ha descrito un biotipo intermedio de C. fetus subesp. venerealis. No est claro que esta variante tenga rasgos clnicos especficos. Por definicin, C. fetus subesp. venerealis se asocia con la CGB, que causa problemas de fertilidad acompaados de considerables prdidas econmicas, sobre todo en las

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regiones endmicas. Campylobacter fetus subesp. fetus puede recuperarse en el tracto intestinal del ganado y otras especies de animales (6). Campylobacter fetus subesp. fetus puede aislarse a partir de los fetos bovinos abortados para mostrar su importancia clnica en el ganado. C. fetus subesp. fetus se asocia con casos espordicos de aborto en los bovinos mientras que C. fetus subesp. venerealis se asocia con el aborto endmico y los problemas de fertilidad de ciertas reas geogrficas. Aunque a C. fetus se le reconoce sobre todo como un patgeno en el mbito veterinario, a veces se le diagnostica de forma ocasional como un patgeno emergente y oportunista en el hombre. Las infecciones ocurren normalmente en las hembras preadas o los individuos inmunodeprimidos, y a menudo son sistmicas y acompaadas de complicaciones de tipo neurolgico y vascular (21).

2.

Taxonoma

En 1991 se propuso una revisin de la taxonoma y la nomenclatura del gnero Campylobacter. Segn el Manual de Bergey, el gnero Campylobacter comprende diecisis especies y seis subspecies. Ms recientemente, se han propuesto dos especies ms. Se han reconocido dos subspecies de C. fetus. Aunque los signos clnicos de las dos subspecies se solapan, fueron definidos originalmente segn las diferencias en su manifestacin clnica (19, 28). Las dos subespecies pueden diferenciarse en el laboratorio por un rasgo bioqumico: la tolerancia a la glicina. A la subespecie venerealis se la considera como sensible a la glicina, y a la subespecie fetus como tolerante de la glicina. Se han descrito cepas de Campylobacter fetus subesp. venerealis biotipo intermedius (18); no obstante debe de aclararse su posicin taxonmica. Sobre la base de los patrones de bandas de las protenas, utilizando electroforesis de las protenas de clulas completas en gel de poliacrilamida (PAGE), no se pueden diferenciar las dos subespecies de C. fetus (27). Los estudios de hibridacin de ADNADN no han sido capaces de establecer ninguna diferencia relevante entre las subespecies venerealis y fetus (10). No obstante, se ha demostrado que mediante varios mtodos moleculares se pueden establecer diferencias entre las dos especies, entre ellos, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (12, 22, 25, 30), la electroforesis en gel de campo pulsado PFGE (17), la tipificacin de secuencias multilocales (MLST) (23) y el polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) (29) (vase tambin la seccin B.1.h).

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.
a)

Aislamiento e identificacin del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)

Toma de muestras
i) En el macho: el esmegma prepucial o secrecciones, y el semen En los toros, el esmegma puede obtenerse por diferentes mtodos: raspado (20), aspiracin (2) y lavado (4). Normalmente el esmegma se obtiene mediante raspado y puede utilizarse para el aislamiento de las bacterias o puede aclarase en un tubo con unos 5 ml de tampn fosfato salino (PBS) que contenga 1% de formalina para el diagnstico mediante la prueba de la inmunofluorescencia indirecta (IFI). El esmegma tambin puede tomarse en una vagina artificial despus de la toma del semen, lavando la vagina artificial con 2030 ml de solucin salina tamponada con fosfato (PBS). Para los lavados prepuciales, se introducen en el saco prepucial 2030 ml de PBS. Despus de un masaje vigoroso de 1520 segundos, se recoge el lquido. El semen se recoge en condiciones tan aspticas como sea posible. Las muestras de semen, deben diluirse con PBS e inocularse directamente en medio de cultivo, de transporte o de enriquecimiento. ii) En la hembra: el mucus (crvico-) vaginal (MCV) Las muestras pueden obtenerse por aspiracin o por lavado de la cavidad vaginal. Es importante el uso de un espculo estril, preferiblemente desechable. Para la aspiracin, se limpia la zona de la vulva con un papel absorbente y se introduce en la cavidad vaginal una pipeta de inseminacin artificial o una pipeta de Cassou (vaina azul), de forma que la parte anterior alcance el cuello uterino (3). Se succiona suavemente mientras se mueve la pipeta hacia delante y hacia atrs. Se retira la pipeta y el mucus recogido se siembra directamente en un medio de cultivo o en un medio de trasporte o de enriquecimiento. El MCV tambin puede recogerse mediante el lavado de la cavidad vaginal: se introducen en la cavidad 2030 ml de PBS con una jeringuilla unida a una pipeta de inseminacin artificial. El lquido se aspira y se reintroduce en la cavidad cuatro o cinco veces antes de recogerlo y extenderlo directamente en medio de cultivo o de aadirlo a un medio de transporte o de enriquecimiento. Tambin se puede recoger lquido a partir del lavado de la cavidad vaginal con un tampn de gasa

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estril mantenido en la vagina durante 510 minutos despus de introducir PBS. Las muestras de MCV obtenidas por succin pueden diluirse con PBS, o sembrarse directamente en un medio de cultivo, de transporte o de enriquecimiento. iii) Fetos abortados, placentas Las mejores muestras para el aislamiento de estas bacterias son la placenta, el contenido estomacal, los pulmones y el hgado del feto. Se inoculan las muestras directamente en un medio de transporte y enriquecimiento, o en PBS con 1% de formalina para la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI).

b)

Transporte de muestras
El uso de medio de transporte es esencial si las muestras no se van a procesar en el laboratorio el mismo da de su recogida. Para su envo al laboratorio, si las muestras no se hallan en medio de transporte, deben colocarse en un recipiente hermtico (a una temperatura de entre 4 y 10C), y deben protegerse de la luz. Se dispone de varios medio de transporte y enriquecimiento, como el de Clark, Lander, SBL, Foley y Clark, Weybridge, y Cary-Blair (7, 11, 15). Algunos de los medios de transporte y de enriquecimiento antes mencionados contienen cicloheximida Debido a la toxicidad potencial de aquella, puede usarse amfotericina B como alternativa.

c)

Tratamiento de muestras
Cuando las muestras lleguen al laboratorio, deben inocularse directamente en un medio de cultivo o procesarse si as se requiere. i) Muestras del tracto genital El lavado prepucial se puede centrifugar (3.500 g) para concentrar la muestra. La muestra final (reducida a 250 l) puede inocularse en medio de cultivo (directamente y/o utilizando el mtodo de filtro). Si el MCV no es muy viscoso puede inocularse directamente o licuarse con un volumen igual de PBS. Cuando el MCV es muy viscoso, puede ser necesario licuarlo aadiendo un volumen igual de solucin de cistena (solucin acuosa de hidrocloruro de cistena a 0,25 g/100 ml, pH 7,2, esterilizada por filtracin). A los 1520 minutos, el mucus diluido y licuado puede inocularse en el medio de aislamiento. ii) Fetos abortados, placentas El contenido del estmago de fetos se inocula directamente en un medio de cultivo adecuado. Los rganos internos, o trozos de rganos, se flamean para esterilizar la superficie, y luego se homogeneizan. El homogeneizado se inocula en medio de cultivo. Despus de lavar las membranas placentarias con PBS estril para eliminar la mayor parte de la contaminacin superficial, se raspan las vellosidades corinicas y el raspado se transfiere a un medio de cultivo.

d)

Aislamiento de Campylobacter fetus

i) Medio de cultivo para aislamiento Actualmente hay muchos medios en uso para el diagnstico bacteriolgico de la CGB. Debera tenerse en cuenta que varios medios utilizados para el aislamiento de Campylobacter spp. no son adecuados para el aislamiento de C. fetus debido a los antimicrobianos (ej.: las cefalosporinas) que pueden inhibir el crecimiento de C. fetus (24). La mayora de los medios de cultivo contienen cicloheximida. Debido a su toxicidad potencial, este antifngico puede sustituirse por anfotericina B. Como medio selectivo de aislamiento de C. fetus se recomienda el de Skirrow. Se trata de un medio basado en sangre con 57% de sangre (lisada) desfibrinada y contiene los siguientes agentes selectivos: sulfato de polimixina B (2,5 UI/ml), trimetoprima (5 g/ml), vancomicina (10 g/ml), y cicloheximida (50 g/ml). De forma alternativa se puede utilizar un medio no selectivo basado en sangre (57%) en combinacin con la filtracin (0,65 m); no obstante, puede ser menos sensible que el medio selectivo. Debera llevarse a cabo un control de calidad de cada lote de medios utilizando cepas de control. ii) Condiciones de incubacin Las placas se incuban a 37C y en una atmsfera microaerobia con un 510% oxgeno, 510% dixido de carbono y preferiblemente 59% de hidrgeno para un crecimiento ptimo (26). Las condiciones microaerobias pueden establecerse mediante varios mtodos. En algunos laboratorios se

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crea una atmsfera adecuada sustituyendo gas en una jarra. Existen kits disponibles comercialmente para la generacin del gas. Tambin se pueden utilizar incubadores atmosfricos. Las condiciones de cultivo e incubacin se verifican de forma sistemtica utilizando cepas control de C. fetus subesp. fetus y C. fetus subesp. venerealis. Deberan utilizarse esos controles cada vez que se lleva a cabo un aislamiento

e)

Identificacin de especies de Campylobacter

i) Morfologa de la colonia Normalmente las colonias de C. fetus aparecen despus de 25 das en los medios de cultivo. Para evitar que el crecimiento de los contaminantes se superponga a las colonias especficas, se recomienda evaluar diariamente los medios y subcultivar las colonias sospechosas. Despus de 3 5 das de incubacin, las colonias miden 13 mm de dimetro. Son ligeramente grisceas-rojizas, redondas, convexas, lisas y brillantes y con un borde regular. II) Morfologa macroscpica Campylobacter es mvil, aunque esta propiedad puede desaparecer despus de los subcultivos. A menudo Campylobacter presenta la forma de un bacilo curvado fino, de 0,30,4 m de ancho y 0,5 8,0 m de largo. En vivo se pueden observar simultneamente formas cortas (en forma de coma), medias (en forma de S) y largas (helicoidales con varias espirales). Los cultivos viejos pueden contener formas cocoides. iii) iv) Pruebas bioqumicas: vase el cuadro 1 Atmsfera: Campylobacter fetus no crece en condiciones aerobias.

f)

Identificacin inmunolgica de Campylobacter fetus

La IFI puede aplicarse para la identificacin del microorganismo de forma directa a partir de muestras o para confirmar la identificacin de una cepa despus del aislamiento. Esa prueba no puede diferenciar entre especies. i) Preparacin de sueros inmunes Se cultivan cepas de Campylobacter, preferiblemente cepas estndar de colecciones de cultivo reconocidas (C. fetus subesp. venerealis o C. fetus subesp. fetus), durante 3 das a 37C en medio que contenga sangre y en condiciones microaerobias. Los microorganismos se recogen en PBS, y se lavan dos veces mediante centrifugacin. Se inoculan intramuscularmente conejos de 3 meses con 2 ml de una suspensin de 1011 microorganismos/ml de una subespecie de C. fetus en PBS y adyuvante incompleto de Freund. Los inculos se administran en cuatro puntos, con 0,5 ml en cada uno. Los animales se sangran antes de la inoculacin y despus a intervalos semanales. Cuando los ttulos del suero son elevados en las pruebas de inmunofluorescencia o de aglutinacin, se inoculan por va intravenosa 0,11,0 ml con 1010 microorganismos viables/ml. Los conejos se sangran 7 das despus y se juntan los sueros heterlogos. En un estudio reciente, se ha descrito un conjugado preparado de IgY de pollo como alternativa a los anticuerpos de conejo. Se han descrito anticuerpos monoclonales que pueden utilizarse para la deteccin inmunodiagnstica de C. fetus (2). ii) Preparacin de conjugados Los conjugados se preparan segn la descripcin de Harlow et al. (9). La solucin de trabajo del conjugado se determina por una titulacin de doble entrada frente a cultivos con frotis de C. fetus utilizando soluciones control positivas y negativas, y seleccionando dos veces la concentracin ms baja que produzca una fluorescencia brillante con las bacterias de C. fetus. iii) Preparacin de la muestra Se lavan las muestras de fluido genital (contenido del abomaso fetal, esmegma prepucial o MCV) en unos 5 ml de PBS con 1% de formalina. Se realizan dos pasos de centrifugacin. En primer lugar, se centrifugan las muestras a 600 g durante 10 minutos a 4C para separar los desechos. A continuacin, se centrifuga el sobrenadante a 8.000 g durante 30 minutos a 4C. Se disuelve el precipitado en 100 l del sobrenadante restante. iv) Prueba de la inmunofluorescencia (14) Se aplica dos veces la muestra (20 l) a los portas del microscopio. El material se seca al aire y se fija con acetona a 20C durante 30 minutos o con etanol a 1825C durante 30 minutos. Se secan al aire los portas de vidrio y se aade, a una dilucin adecuada, el antisuero conjugado con isocianato de fluorescena ismero (FITC). La tincin se realiza en una cmara hmeda a 37C durante 30 minutos y a oscuras. A continuacin, se lavan los portas tres veces con PBS durante tres minutos. Se montan

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los portas en glicerol tamponado (90% de glicerol: 10% de PBS). Se sellan los cubreobjetos para impedir su desecacin, y se examinan los portas con luz ultravioleta en un microscopio de epifluorescencia. Se utilizarn portas de control positivos y negativos cada vez que se realice la prueba. Las cepas de referencia de Campylobacter fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus se usan como controles positivos y otras especie de Campylobacter se usan como control negativo. La muestra que presenta bacterias fluorescentes con la morfologa tpica de C. fetus se considera positiva.

g)

Identificacin bioqumica de la subespecie Campylobacter fetus

Las pruebas descritas en el cuadro 1 deben realizarse sobre cultivos puros

Cuadro 1. Rasgos diferenciales de las especies de Campylobacter potencialmente aisladas a partir del tracto genital bovino y de los fetos abortados (segn el Manual de Bergey, 2 edicin, 2005)
25 C C. fetus subsp. venerealis C. fetus subsp. fetus C. jejuni C. hyointestinalis C. sputorum V + 42C Oxidasa Catalasa NaCl 3.5% + Glicina 1% + V V + H2S(b) V + cido nalidxico V R S(e) R V

V(a) V(c) + +

+ + + + +

V + V(d) + V

(a) = Aunque C. fetus no es una especie termfila de Campylobacter, se ha descrito el crecimiento de esta especie a 42C); (b) = En medio de triple azcar-hierro; (c) C.jejuni subesp. jejuni es positivo, C. jejuni subesp. Doyley es negativo; (d) C. jejuni subesp. jejuni es positivo, C. jejuni subesp. Doyley es variable; (e) segn el Manual de Bergey, las cepas son sensibles, aunque a menudo se han descrito cepas resistentes; (+) = reaccin o crecimiento positivo y () = reaccin negativa o ausencia de crecimiento de la cepa en un medio adecuado bajo condiciones especificadas (vase la seccin B.1.d. di); V = resultados variables; S = sensible; R = resistente.

i)

Crecimiento a 25C y 42C Se inocula una suspensin de clulas (McFarland n. 1) en placas que contengan medio de cultivo con sangre. Se incuba cada placa bajo las condiciones atmosfricas especificadas (vase la seccin B.1.d.ii) a 25C y 42C. Se ensayan en paralelo las cepas control.

ii)

Oxidasa y catalasa Las pruebas se realizan siguiendo el protocolo bacteriolgico estndar. Se ensayan en paralelo las cepas control.

iii)

Crecimiento en presencia de cloruro sdico Se inocula una suspensin de clulas en medio con sangre que contenga 3,5% NaCl (15 ml de medio con sangre + 2,04 ml de 5 M de solucin de cloruro sdico), y luego se aade a un medio que contenga solo sangre. Se realiza la incubacin en las condiciones atmosfricas especificadas (vase la seccin B.1.d.ii). Se ensayan en paralelo las cepas control.

iv)

Crecimiento en presencia de 1% de glicina Se inocula una suspensin de clulas (McFarland n. 1) en medio de cultivo (15 ml de medio con sangre + 1,65 ml de solucin acuosa de glicina al 10% esterilizada con filtro), y luego se inocula en el mismo medio, pero sin glicina. La incubacin se realiza bajo las condiciones atmosfricas especificadas (vase la seccin B.1.d.ii). Se ensayan en paralelo dos cepas control (de las subespecies venerealis y fetus). Como las cepas son difciles de cultivar, pueden ser significativa la aparicin de pequeos cambios en los medios, y la ausencia de crecimiento en presencia de glicina debe considerarse como una prueba preliminar de que se trata de C. fetus subesp. venerealis. La reproducibilidad de la prueba es baja y se han descrito cepas intermedias (18).

v)

Produccin de sulfdrico de hidrgeno (H2S) en medio TSI La prueba del sulfhdrico (H2S) se hace en medio slido de triple azcar-hierro (medio TSI) en las condiciones de crecimiento especificadas (vase la seccin B.1.d.ii). El medio contiene peptona (20 g/litro), extracto de carne (2,5 g/litro), extracto de levadura (3 g/litro), cloruro sdico (5 g/litro),

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citrato frrico (0,5 g/litro), tiosulfato sdico (Na2S2O3) (0,5 g/litro), lactosa (10 g/litro), sacarosa (1 g/litro), glucosa (1 g/litro), rojo fenol (0,0024 g/litro), agar (11 g/litro) y agua destilada (hasta 1 litro). Este medio se esteriliza en autoclave a 115C durante 15 minutos despus de distribuir en tubos. Se inocula una suspensin de clulas (~McFarland n. 1) en los tubos inclinados y en el medio mediante un asa de cultivo. Un cambio de color del rojo al negro indica la produccin de H2S. Se ensayan en paralelo las cepas de control. vi) Produccin de sulfdrico de hidrgeno (H2S) en medio con cisterna (no listada en el cuadro 1) La prueba del sulfdrico se realiza en un medio lquido de Brucella que contenga 0,02% cistena. La produccin de H2S se detecta mediante una tira de acetato de plomo incrustada dentro de la parte superior del tubo. Se inocula una suspensin de clulas en el medio. El ennegrecimiento de la tira de acetato de plomo se considera como reaccin positiva. Se ensayan en paralelo las cepas control. vii) Sensibilidad a la cefalotina y al cido nalidxico La sensibilidad a la cefalotina (CN) y al cido nalidxico (NA) se prueba mediante discos que contengan CN (30 g) o NA (30 g). Para la prueba, se suspenden cultivos de 72 horas en PBS a una concentracin de 109 bacterias/ml. El medio de cultivo se seca antes de depositar el cultivo sobre la superficie. Se extienden porciones de 100 l de esta suspensin sobre el medio base de sangre. Se colocan encima los discos de sensibilidad. Se incuban las placas a 37C en la atmsfera especificada (vase la seccin B.1.d.ii), y se examinan despus de 48 y 72 horas. Una zona de inhibicin alrededor de un disco de al menos mm indica que la cepa es sensible a ese antibitico. Todas las cepas de C. fetus subesp. fetus y la mayora de las de C. fetus subesp. venerealis son resistentes a NA (16). Todas las cepas de C. fetus son sensibles a CN (16).

h)

Identificacin molecular de la subespecie Campylobacter fetus

Se han descrito mtodos moleculares para la identificacin de la subespecie C. fetus, incluidos la secuenciacin del gen 16S (8, 17), PFGE (17), del AFLP (29), y del MLST (23). Sin embargo, la aplicacin de la mayora de estos mtodos requieren demasiado tiempo y/o requieren conocimientos de experto y aparatos caros. Lo mejor es que los laboratorios de diagnstico rutinario utilicen la PCR simple. Se ha afirmado que varios mtodos de PCR son especficos para especie, y entre ellos se encuentran los elaborados por Hum et al. (12), Wang et al. (30) y, ms recientemente, el de Tu et al. (22) y Van Bergen et al. (25). La PCR mltiple, descrita por Hum et al. (12) es la ms citada en la actualidad. Con ella se puede amplificar un fragmento de ADN especfico de C. fetus (aproximadamente 200 pb ms pequeo que el de 960 pb descrito en el estudio original), as como un fragmento especfico de C. fetus subesp. venerealis. As pues, la realizacin de esta PCR mltiple permite la diferenciacin de las dos subespecies (C. fetus = un producto de amplificacin vs. C. fetus subsp. venerealis = dos productos de amplificacin). En el estudio de Hum no se evaluaron cepas de Campylobacter fetus subsp. venerealis biotipo intermedio, pero se identificaron aislamientos como pertenecientes al biotipo intermedio con AFLP, clasificados por la PCR de Hum bien como C. fetus subesp. fetus o C. fetus subsp. venerealis (23). Mediante la comparacin de esta PCR con las pruebas AFLP y MLST (23) y con la prueba de glicina (31) se confirma que la PCR puede dar como resultado reacciones positivas falsas y reacciones negativas. La PCR descrita por Wang et al. (30) solo proporciona un producto especfico de C. fetus subesp. fetus. Estos resultados se obtuvieron tan solo con un nmero muy pequeo de pruebas. Las ltimas evaluaciones de su capacidad para diferenciar subspecies utilizando grupos ms amplios de cepas dieron como resultado reacciones positivas falsas y reacciones negativas falsas (25). Las PCR para la amplificacin aleatoria de ADN polimrfico (RAPD), descritas por Tu et al. (22), se acaban de publicar, y parece que se han evaluado con un nmero muy pequeo de cepas de C. fetus subesp. venerealis. Se deberan evaluar de forma ms amplia y utilizando un mayor nmero de cepas. La PCR recientemente descrita por Van Bergen et al. (25) mostr una consistencia total con C. fetus subsp. venerealis tal como se caracterizan mediante AFLP, por lo que se le considera como el mejor mtodo actualmente disponible de deteccin por PCR de C. fetus subesp. venerealis. Sin embargo, esta PCR no permite la caracterizacin de C. fetus subesp. venerealis biotipo intermedio tal como se lleva a cabo por AFLP.

2.

Pruebas serolgicas de deteccin de anticuerpos

Existe un ELISA disponible para la deteccin de anticuerpos secretores de IgA especfico para antgenos en el mucus vaginal tras el aborto debido s C. fetus subesp. venerealis. Estos anticuerpos tienen una larga duracin y su concentracin permanece constante en el mucus vaginal durante varios meses (13).

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El muestreo inicial se puede llevar a cabo tras el periodo inicial de involucin (normalmente una semana antes del aborto) cuando el mucus se torna ms claro. Se describe a continuacin un ELISA para la deteccin de la respuesta de la IgG humoral del suero despus de la vacunacin.

a)

Preparacin de antgeno y antigenizacin

Se transfieren colonias a 0,5% de formalina durante 1 hora, se centrifuga a 17.000 g, se lava dos veces con PBS, pH 7,5, y se resuspende a continuacin en tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6. La absorbancia final se ajusta a OD610 nm = 0,21. Se dejan durante la noche a 4C placas de poliestireno para microtitulacin de fondo plano antigenizadas con 10 l de antgeno, se dejan toda la noche a 4C y se guardan luego a 20C. Antes de su uso, las placas se lavan dos veces con agua destilada y despus se elimina su humedad con cuidado. i) ii) iii) iv) Procedimiento de la prueba Se aade a cada pocillo el mucus vaginal diluido (100 l) y la placa se incuba durante 2 horas a 37C. Se lavan las placas como antes y se aaden 100 l de IgA anti-bovina de conejo. Despus de una incubacin de 2 horas a 37C, se lavan las placas y se aaden a cada pocillo 100 l de IgG anti-conejo de cabra conjugada a peroxidasa de rbano. Despus de otras 2 horas de incubacin a 37C, se lavan las placas y se aaden 100 l de substrato (0,8 mg/l de cido 5 amino-saliclico, pH 6,0, activado inmediatamente por la adicin de 2% de perxido de hidrgeno. Las placas se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos y se detiene la reaccin aadiendo 50 l de hidrxido sdico 3 M. La absorbancia se mide en un lector ELISA a 450 nm. Cada muestra se prueba en duplicado, y en cada placa se incluye controles positivos y negativos. Las medidas de absorbancia de las muestras problema se corrigen para las medidas de absorbancia de los controles positivos y negativos segn la frmula siguiente: Absorbanciamuestra Absorbanciacontrol negativo Resultado = ________________________________________________ 100 Absorbanciacontrol positivo Absorbanciacontrol negativo La prueba se considera positiva si el resultado es superior a 40. Los animales vacunados no reaccionan al ELISA con IgA ya que su mucus vaginal solo contiene anticuerpos de isotipo IgG.

v) vi)

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

Se reconocen dos grupos de antgenos de C. fetus: los antgenos flagelares H, que son termolbiles y los antgenos somticos O, que son termoestables. Adems, debe estar presente un antgeno capsular K. El antgeno K se destruye fcilmente en condiciones de in vitro. La vacuna debe incorporar estos antgenos diferentes. Tambin se han descrito otras preparaciones de vacunas (5). La vacuna contra C. fetus subesp fetus confiere inmunidad contra C. fetus subesp. venerealis porque las dos cepas tienen los mismos antgenos (1). Sin embargo, la adicin al producto biolgico de una segunda cepa de C. fetus subesp. venerealis es una prctica comn que se sugiere encarecidamente. Es importante la presencia de cuatro o cinco inmungenos proteicos sensibles al calor que son compartidos por muchas cepas de C. fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. Debe confirmarse la presencia de tales inmungenos. La concentracin de la vacuna (peso en seco) debe estar en torno a los 40 mg de protena por dosis a fin de conseguir un buen nivel de proteccin En poblaciones infectadas, todos los animales para reproduccin, incluyendo los toros, las vacas y las terneras, se vacunarn dos veces antes del periodo de cra. En la mayora de los casos, la vacuna reduce la duracin de la infeccin y las vacas portadoras pueden conservar la infeccin de un periodo al siguiente. Los toros necesitan dos dosis vacunales al ao, ya que la vacuna no siempre es eficaz para acabar con las infecciones establecidas. Los toros y novillas del ao siguiente se vacunan, y los toros del tercer ao en adelante se vacunan anualmente. En poblaciones no infectadas solo se vacunan los toros una vez al ao, pero debe hacerse dos veces al ao (dos dosis con un intervalo de 21 das, 2 semanas antes del comienzo de la estacin de cra).

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1.
a)

Control de inculos
Caractersticas del inculo
El inculo consiste en un lote grande y homogneo de un cultivo de C. fetus subesp. fetus o de C. fetus subesp. venerealis que se ha caracterizado cuidadosamente e identificado en cuanto a pureza, conservado en pequeas alcuotas.

b)

Mtodo de cultivo
El crecimiento inicial del inculo tiene lugar en un medio slido. Este consiste en un medio base al que se aade 0,16% de agar. El medio base se compone de 2,8% de caldo de Brucella, 0,5% de extracto de levadura, 1,2% de succinato sdico, y 0,001% de cloruro clcico. El cultivo inicial se mantiene 3 das a 37C en las condiciones especificadas (vase la seccin B.1.d.ii). El cultivo se pasa a tubos adicionales con medio semislido y se incuba durante 48 horas. El material resultante se utiliza para la produccin de vacunas. Este cultivo debe conservarse a 4C.

c)

Validacin como vacuna

El inculo debe estar libre de organismos contaminantes. La pureza del inculo debe comprobarse por un mtodo de cultivo apropiado. No resulta prctico probar la eficacia en condiciones de laboratorio. Se determina en el campo por observaciones epidemiolgicas.

2.

Mtodo de produccin

El material de siembra se cultiva en un medio lquido formado por un medio base al que se aade 0,025% de tioglicolato sdico. Estos cultivos se incuban durante 24 horas a 37C con agitacin a 80 rpm. Se recogen los lquidos y se aade formaldehdo a una concentracin final de 0,2% (0,74 g/litro) La vacuna se mezcla con un adyuvante de emulsin oleosa.

3.

Control del proceso

Se debe comprobar la identidad del microorganismo mediante cultivo e identificacin, as como la ausencia de microorganismos contaminantes.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin del material biolgico se pueden encontrar en el captulo 1.1.9.

b)

Inocuidad
El proceso de inactivacin debe ser completo y debe validarse el mtodo para asegurar la inactivacin antes de que pueda usarse de forma segura. La inactivacin se comprueba inoculando el equivalente de una dosis en el mismo medio y bajo las mismas condiciones que las utilizadas en el proceso de produccin. Este cultivo se incuba 72 horas en las mismas condiciones, despus de las cuales no debe haber evidencia de crecimiento bacteriano. El producto final tambin debe estar libre de contaminantes bacterianos y fngicos viables, utilizando mtodos adecuados de cultivo. Se inoculan dos cobayas con 2 ml del producto por va intramuscular o subcutnea. No debe haber una reaccin adversa atribuible a la vacuna durante un perodo de observacin de 7 das despus de la inoculacin.

c)

Potencia
La potencia de la vacuna puede medirse por seroconversin en conejos. Se miden sus ttulos sricos mediante inmunofluorescencia o por la prueba de aglutinacin en tubo. Se vacunan subcutneamente dos veces, con la mitad de la dosis utilizada en el ganado bovino, cinco conejos que sean serolgicamente

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Captulo 2.4.5. Campilobacterioriosis genital bovina

negativos a una dilucin 1/100 del suero, con un intervalo de 14 das. Como mnimo, el suero de cuatro de los cinco ratones, recogido 14 das despus de la segunda vacunacin, debe mostrar un incremento en el ttulo de al menos cuatro veces.

5.
a)

Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Vase la seccin C.4.b.

b)

Potencia
Vase la seccin C.4.c.

Agradecimiento
Algunas partes de este captulo derivan del captulo sobre campilobacteriosis genital bovina de ediciones previas de este Manual o estn basados en l. Los autores quieren expresar su agradecimiento al Dr. C. Campero (Argentina) por las fructferas conversaciones.

REFERENCIAS
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