PRACTICA DE COLIMETRIA Pipetas de 1 mL estériles. Mechero Bunsen. Encendedor. Agitador de tubos Vortex.

Gradillas para tubos Asa Bacteriológica. Incubadora a 35 °C Baño María a 44 °C

Lasaguasresidualessondecomposiciónvariadaprovenientesdedescargasdeusosindustrial
es,comerciales,deservicios,agrícolas,pecuarios,domésticos,engeneraldecualquieruso,así
comolamezcladeellas,contienendiferentestiposdemicroorganismoscontaminantesylasdife
rentesconcentraciones,dependiendodesufuente.

PROCEDIMIENTOPreparación de agua de dilución

Ennuestropaísexisteungraveproblemadecontaminaciónderíos,lagosacuíferosycostasde
bidoaqueconstituyeneldepósitodelosdeshechosgeneradosporlasactividadeshumanas.

Lapresenciayextensióndecontaminaciónfecalesunfactorimportanteenladeterminacióndel
acalidaddeuncuerpodeagua.Lashecescontienenunavariedaddemicroorganismosloscuale Preparar agua Peptonada, pesar 0.25 g de peptona, 2.125 g NaCl, diluir en 250 ml de
ssonunriesgoparalasaludpublicaalestarencontactoconelserhumano.Elexamendemuestras Agua destilada y distribuir 9 ml de este medio en cada tubo y esterilizar junto con
deaguaparadeterminarlapresenciademicroorganismosdelgrupocoliformedaindicacióndelg materiales de vidrio (pipetas).
radodecontaminaciónfecal.
Se hará la dilución según el tipo de muestra a analizar
COLIFORMES TOTALES Preparación de Caldo Verde Brillante
•Grupodebacteriasaerobiasyanaerobiasfacultativas ColocarlostubosDurhamenformainvertidaenlostubosdeensayoqueconformaranlabatería
detubosconCaldoLaurily/oBrilla.LaBateríaconstade9tubosporcadamuestraaanalizar.
•Gramnegativas,capacesdecrecimientoaeróbicoyasea35ó37±1°Cenmediodecultivo

•Fermentalactosaconproduccióndeácidoygasdentrodeunperiodode48h. Pesar20gdeCaldodecultivoydiluiren500mldeaguadestilada,distribuir10mldemedioencad
atubo(45tubos–bateríade9tubosparaanalizar5muestras).Colocar en autoclave y
•Grupoconformadopor4génerosprincipalmente:Enterobacter,Escherichia,CitrobacteryKle esterilizar.
bsiella. Procedimiento:siembradelas3ultimasdiluciones.Porcadadilucióninocularen3tubos,
1mldemuestraporcadatubo.
COLIFORMES FECALES Procedimiento de Siembra
•IncluyeE.ColiyalgunosKlebsiellayEnterobacterspp. Realizarlasiembraapartirdelas3últimasdiluciones.Porcadadilucióninocular3tubosconteni
endocaldoLauril(1mldemuestraporcadatubo).
•Sonunsubgrupodeloscoliformestotales
Incubardurante48ha35°C.
•GrupodeBacteriasrepresentadoporE.coliseencuentracasiexclusivamenteenlashecesdelo
sanimalesdesangrecaliente(termotolerantes)porsucapacidaddesoportartemperaturasmás
elevadas. Despuésdelaincubaciónobservarlapresenciadeturbidezydegas.

•Supresenciaseinterpretacomounaindicacióndequelosorganismospatógenospuedenestar ApartirdelostubospositivossembrarennuevostubosconteniendoCaldoBrillaeincubarparac
presentes onocersihaypresenciadecoliformestotalesy/otermotolerantes
Calculo del Numero mas Probable (NMP)
•Unaltoniveldebacteriascoliformesfecales,porlogeneralindicalapresenciaenelaguadeunagr •Elcálculodeladensidadprobabledebacteriascoliformestotalesenunamuestraestábasadoen
ancantidaddehecesyotrosmaterialesorgánicossintratarquepuedentenerunserioimpactoen lacombinacióndelosresultadospositivosynegativosobtenidosencadadilución
elambiente.

METODO PARA DETECTAR COLIFORMES Los resultados obtenidos se expresarán de la siguiente manera:
MNP NMP DE COLIFORMES TOTALES/ 100 mL
•Basado en probabilidad estadística NMP DE COLIFORMES FECALES/ 100 mL

•No es contaje directo Tres porciones de 0.01ml resultaron positivos, dos de0.001 ml y ninguno de 0.0001ml.E
lcódigo resultante será: 3-2-0 se localiza el valor en la tabla y se obtiene en NMP ajustando
•Técnica en medio liquido las diluciones de acuerdo a la siguiente formula(5)
Valor en la tabla de NMP *10/ volumen de la dilucion inicial = NMP/ 100 ml
•Consta de : prueba presuntiva , prueba confirmativa Reemplazando tenemos:
PruebaPresuntiva 93 . 10 /0.01 = 93,000/100ml
•Consisteencolocarvolúmenesdeterminadosdemuestraenunaseriedetubosconteniendocal
dolauriltriptosaysonincubadosa35°Cdurante24-48horas.
PRACTICA DE COLIMETRIA - COLIFORMES TOTALES Y FECALES
I. INTRODUCCION
•Enestapruebalaactividadmetabólicadelasbacteriasesestimuladavigorosamenteyocurreun
aseleccióninicialdeorganismosquefermentanlalactosaconproduccióndegas.
Las aguas residuales son de composición variada provenientes de descargas de usos
PruebaConfirmativa
municipales, industriales, comerciales, de servicios, agrícolas, pecuarios, domésticos,
•Consisteentransferirtodoslostubospositivosdelapruebapresuntivaatubosconteniendocald
incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier uso, así como la mezcla de ellas,
olactosadoverdebrillantebilis2%,ysonincubadosdurante24-48horasa35°C.
contienen diferentes tipos de microorganismos contaminantes y las diferentes
concentraciones, dependiendo de su fuente. La variada población de microorganismos en
•Estapruebareducelaposibilidadderesultadosdefalsosgas- esta agua, proviene del suelo y de origen intestinal, incluyen aerobios y anaerobios
positivosquepuedenocurrirporlaactividadmetabólicadelosorganismosformadoresdeespora estrictos y facultativos así como también numerosos virus (hepatitis). Igualmente pueden
soporlaproducciónsinergisticadegasdebidoaquealgunascepasbacterianasnopuedenprodu obtener formas parasitarias variables como quistes de Protozoarios y huevecillos de
cirloapartirdelafermentacióndelalactosa. Helmintos.
En nuestro país existe un grave problema de contaminación de ríos, lagos acuíferos y
Caldo Lauril Triptosa (CLT) costas debido a que constituyen el depósito de los deshechos generados por las
•Medioricoennutrientesquepermiteunrápidodesarrollodelosmicroorganismosfermentadore actividades humanas. Estos microorganismos pueden sobrevivir al tratamiento, por lo que
sdelalactosa. su reúso por ejemplo en riego agrícola actividades recreativas: Aguas de piscinas, baños
de hidromasaje, aguas potables naturales, actividades piscícolas y aguas marinas
•Latriptosaeslafuentedenitrógeno,vitaminas,mineralesyaminoácidos,lalactosaeselhidratod superficiales (playas), representan un riesgo potencial a la salud pública.
ecarbonofermentable,lassalesdefosfatoproveendeunsistemabufferyelclorurodesodiomant La presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en la
ieneelbalanceosmótico. determinación de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de
microorganismos y formas de resistencia de los mismos involucrando organismos
•ESunmedioselectivo,yaqueellaurilsulfatodesodioinhibeeldesarrollodelafloraacompañante patógenos, los cuales son un riesgo para la salud publica al estar en contacto con el ser
. humano. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de
microorganismos del grupo coliforme da indicación del grado de contaminación fecal.
CALDO VERDE BRILLANTE Coliformes Totales: Grupo de bacterias aerobias y anaerobias facultativas, Gram
•Estemedioestárecomendadoparaelrecuentodecoliformestotalesyfecales,porlatécnicadel negativas, capaces de crecimiento aeróbico ya sea 35 ó 37 ± 1°C en medio de cultivo,
númeromásprobable. fermentando lactosa con producción de ácido y gas dentro de un periodo de 48 h. Grupo
•Contienelosnutrientesnecesariosparaeldesarrollodebacteriasperoeslabilisyelverdebrillant conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y
elosagentesselectivosparaeldesarrollodecoliformes Klebsiella.
Coliformes Fecales: son un subgrupo de los coliformes totales, conformado por bacterias
OBJETIVO Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de
•DeterminarlapresenciadebacteriasdelgrupoColiformeenefluentesdeunaPlantadeTratami incubación a 44 °C.
entomediantelatécnicadelNúmeroMásProbable(NMP),usandotubosdefermentaciónmúltipl Este grupo de Bacterias representado por E. coli se encuentra casi exclusivamente en las
e. heces de los animales de sangre caliente. También son denominados termotolerantes por
su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Su presencia se interpreta como
MATERIALES una indicación de que los organismos patógenos pueden estar presentes
Muestra de agua de efluente. Medio de Cultivo: Caldo Lauril Sulfato y Lactosa Bilis Método NPM: Método empleado para estimar el número de microorganismos en muestras
Verde Brillante estéril. Agua de dilución: agua Peptonada (peptona 1.0 g, NaCl 8.5 g, de alimentos, suelos y aguas. Es un método que puede aplicarse en cualquier tipo de
Agua dest. 1 L). Tubos de 18 x 150 mm para la dilución de la muestra. Batería de 9 agua, aún aquellos que contienen gran cantidad de materia orgánica.
Tubos de 18 x 150 mm con campana Durham por cada muestra a analizar. Para la determinación del NMP de Coliformes Totales y Fecales en este tipo de aguas, es
necesario proceder a preparar diluciones decimales de la muestra, debido a que se espera
que la concentración de coliformes sea superior en éstas que en un agua potable.
El número de diluciones varía mucho, dependiendo del origen de la muestra a tratar. Por
lo demás, para su análisis se procede en la misma forma que para una muestra de agua
potable.
II. OBJETIVO:
Determinar la presencia de bacterias del grupo Coliforme en efluentes de una PTAR La degradación anaerobia de sustratos complejos, como es el caso de muchos efluentes
mediante la técnica del Número Más Probable (NMP), usando tubos de fermentación residuales, transcurre en diferentes etapas secuenciales, siendo diferentes grupos
múltiple. tróficos microbianos los responsables de cada una de ellas
III. MATERIALES El test de actividad de un lodo se realiza habitualmente en experimentos en discontinuo
- Muestra de agua de efluente. en los que una determinada cantidad de sustrato (agua residual o sustrato sintético
- Medio de Cultivo: Caldo Lauril Triptosa, Caldo Brilla. específico) sirve como alimentación a una determinada cantidad de lodo.
Método Volumétrico
- Agua de dilución: agua Peptonada (peptona 1.0 g, NaCl 8.5 g, Agua dest. 1 L). Se basa en la cuantificación del volumen de metano producido mediante el uso de una
- Tubos de 18 x 150 mm para la dilución de la muestra. sustancia desplazante, como el NaOH. Reacciona con el CO2 presente en el biogas
- Batería de 9 Tubos de 18 x 150 mm con campana Durham por cada muestra a analizar (CH4+CO2) permitiendo una medición aproximada del metano producido. El pH del
- 9 Pipetas de 1 mL estériles. sistema debe ser superior a 12 para garantizar el secuestro de CO2 producido
- Mechero Bunsen. 𝐶𝑂2+2𝑁𝑎𝑂𝐻→𝑁𝑎2𝐶𝑂3+𝐻2𝑂
II. OBJETIVOS:
- Encendedor.
- Agitador de tubos Vortex. Realizar un ensayo anaerobio discontinuo de un lodo procedente de aguas residuales de
- Gradillas para tubos origen doméstico.
- Asa Bacteriológica. III. MATERIALES:
- Incubadora a 35 °C – 44 °C.
Sistema Experimental
IV. PROCEDIMIENTO Digestor o Reactor Batch de 500 mL
Botella para solución de Hidróxido de sodio para capturar el CO2 (Frasco Mariotte)
Preparación de agua de dilución: Preparar agua Peptonada, pesar 0.25 g de peptona,
2.125 g NaCl, diluir en 250 ml de Agua destilada y distribuir 9 ml de este medio en cada Probeta de 500 ml (recepcionar el líquido desplazado por el metano producido)
tubo y esterilizar junto con materiales de vidrio (pipetas). (26 tubos de dilución)
Manguerillas de silicona 1 m aproximadamente para armar el sistema
Preparación de Caldo Lauril Triptosa:
Colocar los tubos Durham en forma invertida en los tubos de ensayo que conformaran la Frascos pequeños (cámara de seguridad)
batería de tubos con Caldo Lauril Triptosa. La Batería consta de 9 tubos por cada muestra
a analizar. Agujas hipodérmicas (5 por sistema)
Pesar Caldo Lauril y diluir en 450 ml de agua destilada, distribuir 10 ml de medio en cada Equipos:
tubo (45 tubos – batería de 9 tubos para analizar 5 muestras). Colocar en autoclave y Baño María
esterilizar. Nota: Después de observarse tubos con resultados positivos será necesario
preparar Caldo Brilla para continuar con los ensayos (coliformes fecales), la cantidad Reactivos y Muestra de Inoculo:
requerida dependerá del resultado - número de tubos positivos) Ácido Acético
PRUEBA PRESUNTIVA Agua destilada
1. Agitar la muestra para lograr una distribución uniforme de los microorganismos.
2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar NaOH
diluciones. Na2S
3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estéril tomar una alícuota de 1mL de la
muestra original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9 mL de agua de dilución estéril, NaHCO3
obteniendo de esta manera una dilución de 10-1 agitar y con otra pipeta estéril tomar una Muestra de lodo.
alícuota de 1 mL y llevarlo a otro tubo con 9 mL de agua de dilución para obtener una
dilución de 10-2 proceder de la misma manera hasta donde sea necesario diluir IV. PROCEDIMIENTO:
dependiendo del tipo de muestra.
4. Inocular asépticamente con 1 mL de muestra por triplicado, tubos de fermentación Calcular el Inoculo de lodos para el ensayo
conteniendo caldo Lauril, a partir de las últimas 3 diluciones y conservar todas las Interesa una concentración de inoculo lo suficientemente alta para evitar una
anteriores en refrigeración por si se requiere su utilización posterior. degradación parcial por limitación de Biomasa. Valor sugerido 5 gSSV/L,
5. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24 horas y efectuar una 𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑙𝑜𝑑𝑜= (𝐶𝑓𝐶𝑖)(𝑉𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎)
primera lectura para observar si hay tubos positivos, es decir si se observa turbidez y Cf: Concentración de solidos volátiles final (5 g SSV/L)
producción de gas en el interior de la campana Durham. Ci: Concentración inicial de la muestra de lodo (138,89 g SSV/L- Dato proporcionado por
6. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas la planta de tratamiento)
confirmatorias para coliformes totales y fecales, en caso de no apreciarse crecimiento en Vmezcla: Volumen del reactor (500 ml = 0.5L)
el resto de los tubos, continuarán en incubación 24 horas más. Calcular el volumen del Sustrato:
7. Después de 48 horas (± 2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura final, si tampoco Determinar el volumen de ácido acético para una DQO de 2g/L
se aprecia crecimiento ni producción de gas, los tubos se toman como negativos. 𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻+2𝑂2→ 2𝐶𝑂2+2𝐻2𝑂
Se calcula el volumen del Ácido acetico a usar en el ensayo con la sgte. formula
PRUEBA CONFIRMATIVA 𝑉𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻=𝐷𝑄𝑂𝑚∗𝑉𝑚∗(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 1 𝑚𝑜𝑙 𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻/𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 2 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑂2)∗𝜌, 𝜌=1.05𝑔𝐿
PARA COLIFORMES TOTALES: Vm: Volumen de la mezcla
8. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba anterior, DQOm: Valor de DQO en la mezcla
agitarlos para homogeneizar e inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Brilla. PCH3COOH: Peso de 1 mol de ac. Acético
PO2: Peso de 2 moles de oxigeno
9. Incubar durante 48 h a 35°C.
ρ: Densidad de ac. Acético
10. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas. Producción de Metano
Pesar 0.5 g de NaHCO3 y agregar 100 ml de agua destilada al reactor (Digestor de
PARA COLIFORMES FECALES O TERMOTOLERANTES: 500 ml), homogenizar.
11. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitarlos para homogeneizar e inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo Brilla o Agregar de lodo calculado al digestor (18 ml), homogenizar.
caldo EC.
Agregar el CH3COOH calculado (0.9 ml) al reactor y enrazar hasta 500 ml.
12. Incubar durante 24 h a 44°C.
13. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas. pH recomendable entre 6.5 -7.5
V. ELABORACIÓN Y PRESENTACIÓN DE RESULTADOS. Agregar NaS ( actúa como agente reductor) Llevar el sistema a baño María a 35± 2
°C.
El cálculo de la densidad probable de bacterias coliformes totales en una muestra está
basado en la combinación de los resultados positivos y negativos obtenidos en cada
𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻+𝐻2𝑂→ 𝐶𝐻4+𝐻𝐶𝑂3
dilución
La densidad de Coliformes se expresa como NMP de coliformes por 100 ml (en tabla 95%
de límite de confianza de 95% para cada valor de NMP determinado). Tres diluciones son
necesarias para la obtención del código del NMP.Control de Temperatura
Teniendo en cuenta que los microorganismos metanogénicos tienen mejores
condiciones de crecimiento a 35ºC, se ha proporcionado la temperatura adecuada con
ayuda de un Baño María logrando el control de temperatura para el sistema.
INSTALACIÓN DEL REACTOR
El equipo para la determinación de la actividad metanogénica es un sistema
herméticamente cerrado que consta de:
Digestor: Botella de capacidad de 500 ml
Frasco de Mariotte: que funciona como gasómetro el que estará lleno de solución
alcalina (25 g NaOH/L) que retiene el CO2 formado en el proceso y que permite la
medición directa del metano producido.
Cámara de seguridad: cuya función es capturar el líquido que pueda regresar del
gasómetro.
Probeta calibrada: para medir el metano producido.
Baño termostático: para dar la temperatura necesaria para la digestión anaerobia

PROCESO BIOLOGICO ANAEROBIO – PRODUCCION DE METANO

I. INTRODUCCION:

La digestión anaerobia es un proceso bioquímico en el cual un grupo de diferentes

microorganismos, en ausencia de oxigeno molecular, promueve la transformación de
compuestos orgánicos complejos (carbohidratos, proteínas y lípidos) en productos
simples, como metano, gas carbónico, gas sulfhídrico y amonio. Los microorganismos
que participan en la digestión anaerobia actúan por medio de reacciones específicas
secuenciales, las cuales cuentan con bacterias especializadas en cada una de ellas.