 1.

Apakah guna elektrophoresis dalam biologi

molekuler dan komponen-komponen apa
yang diperlukan .
 2. Bagaimanakah cara mengetahui
pergerakan fragmen DNA dalam gel
agarose elektrophoresis?
 3. Apakah fungsi medium SDS dalam
elektrophoresis?
 4.Apakah guna DNA probe dan apa syaratnya
untuk molekul probe?
ELEKTROPHORESIS
 Alat untuk mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan
dalam suatu medan listrik.
 Prinsip kerja elektrophoresis adalah berdasar
kan pergerakan partikel-partikel bermuatan
negatif (anion) yaitu DNA dari kutub negatif
(katode) menuju ke kutub positif (anode).
 Hasil dari elektrophoresis akan terlihat
berbentuk band(garis-garis pita) pada gel
agarose atau nitro cellulose , yang
menunjukkan jumlah basa pada potongan
tersebut.
 1.
Untuk mengetahui ukuran partikel
DNA/RNA atau molekul protein .

 2.
Untuk mengetahui bentuk partikel
DNA/RNA atau protein.

 3.Untuk mengetahui ukuran basa N yang

dikandung
Sekuensing DNA tertentu.
 1. Alat-alat yang diperlukan.
 > Bak (chamber) , diisi dengan buffer (SDS)
 > Elektrophoresis plate, untuk menempatkan gel
agarose.
 > Kutub-kutub katode atau anade.
 > Power supply
 > Sisir, untuk membuat sumuran sampel.

 2. Bahan yang diperlukan .

 > Gel agarose
 > Sodium Dodecyl Sulphat (SDS)
 > Zat warna : ethidium bromide atau bromophenol blue
 Adalah bahan untuk medium bergeraknya
fragmen-fragmen DNA dalam elektrophoresis
dari katode ke anode.
 Pergerakan fragmen DNA pada gel agarose
dipenga ruhi oleh :
> ukuran partikel/fragmen DNA
> komposisi gel
> konsentrasi gel.
> densitas muatan
> daya medan listrik.
> medium (SDS)
 > 0,15 gr gel agarose + 15 ml 1 x TBE-
DEPC.
 > Panaskan sampai agarose larut.
 > Dinginkan sampai hangat kuku.
 > Tambahkan ethidium bromide 10
ugr/ul.
 > Tuangkan kedalam elektrophoresis
plate yang telah dipasang sisir( untuk
pembu atan sumuran pada agarose) dan
setelah gel padat lalu sisir diangkat.
 > Tempatkan Elektroph plate pada
chamber.
 Bahan ini berguna untuk :
 1. Melisiskan membran sel.
 2. Denaturasi protein.
 3. Menghambat aktivitas nuklese.
 4. Pada medium elektroph. Melapisi
polinukleotida de
 ngan muatan negatif, sehingga semua
polinukleo tida bergerak dari katode (-
) ke anode (+)
 Dengan demikian semua molekul dalam
elektroph bergerak berdasarkan muatan ,
bukan karena berat molekul.
 Pengertian :
 > Manipulasi asam inti dalam bab ini dimaksudkan
untuk mengaplikasikan asam inti dalam
berbagai kepentingan menggunakan teknik-
teknik hibridi sasi.
 > Teknik-teknik hibridisasi dapat diaplikasikan
dalam bidang kesehatan, forensik,bioteknologi,
mendeteksi struktur asam inti dari suatu gene yang
mengalami kelainan atau terinfeksi oleh gene
asing.
 > Adapun teknik-teknik tersebut adalah :
 Hibridisasi DNA, PCR, LCR, RT-PCR, DNA sequencing dsb.
Komponen yang diperlukan dalam hibridisasi
DNA adalah :

I. DNA target
II. DNA probe
III. Sistem pendeteksian.
IV. Format hibridisasi
 Merupakan molekul DNA yang akan diteliti (
ingin diketahui struktur molekulnya).
Biasanya merupakan DNA yang terinfeksi oleh
DNA dari virus atau DNA dari bakteri.

 Syarat DNA target:

 1. merupakan DNA single strand
 2. harus lebih dari satu copy dari tiap sel.
 3. mengandung segmen dari semua kode
dalam DNA atau seluruh bagian dari
plasmid.
II. Molekul DNA/RNA probe
 Molekul DNA/RNA probe dapat dibuat atau
disintesis secara kimiawi di labora torium,
sehingga strukturnya telah diketa hui sesuai
dengan kebutuhan.

 Syarat-s yarat DNA/ RNA probe.

 1.merupakan oligonukleotida, yang
tersusun dari 20 – 50 nukleotida.
 2.Ujung 3 dari probe harus basa G/C
 3.Ujung 3 tidak boleh lebih dari 2 basa N yang
sama, mis GG/CC.
 4.molekul probe harus mengandung reporter
untuk membentu mendeteksi adanya ikat
an antara probe dengan DNA target
 Untuk mendeteksi keberhasilan proses hibridisasi dapat dilacak dengan
menggunakan reporter yang dilekatkan pada DNA probe.
 Reporter harus dapat berfloresensi bila kena sinar ultraviolet.
 Macam reporter:
 a. Zat radioaktif, misalnya : P32 (phosphat radioaktif).
Penggunaan zat radioaktif dihentikan karena
membahayakan lingkungan.
 b. Zat nonradioaktif, biasanya berupa enzim yang dapat
berfloresensi bila kena sinar UV, misalnya: > > Florescen
isothiocyanate
>Chemiluminescent moities.(mis: acridinium ester).
>Biotin, mempunyai avinitet tinggi terhadap avidin dan
streptavidin. Biotin merupakan derivat vit.B yang larut dalam
air. Probe yang dilabel dengan biotin menghasilkan resolusi
hibridisasi tinggi, danstabil pada suhu – 20 derajad C selama
setahun.
Zat-zat tersebut tidak beracun dan ramah terhadap lingkungan, tetapi
sensitifitasnya rendah
 1 Menghilangkan gugus phosphat pada
ujung 5’ dengan enzim alkaline phosphat.

 2. Kemudian bagian tersebut diganti dengan

gugus zat radioaktif atau reporter yang lain
dengan enzim polinukleotida nuklease.
 1. Enzim terminal transferase:
 Untuk mengikatkan reporter pada ujung 3 dari DNA
probe.

2. Enzim Polinukleotida kinase:

Untuk mengikatkan reporter pada ujung 5 dari DNA
probe.

3. DNA polimerase I:
Untuk menghilangkan sebagian ujung dari DNA probe
untuk ditempeli reporter
  ds DNA
(dari virus atau sel target dalam buffer)
+pelarut alkali denaturasi DNA
ssDNA
+nitrosellulose/nylon untuk melektnya ssDNA
ssDNA
(melekat pada nitrosellulose)
+probe bereporter dlm bufer *unt.berhibridisasi ssDNA
ssDNA
(berhibridisasi dengan probe)
+ buffer Unt.pencucian sisa
probe
ssDNA hibrid**
 1. Konsentrasi molekul probe ug/ml (X)
 2. Kompleksitas probe (Y)
 3. Volume reaksi dalam ml (Z)

 Waktu hibridisasi:

 Co t1/2 = 2(1/x)(y/5)(z/10)
 Faktor-faktor yang mempengaruhi
daya ikat antara DNA target dengan
DNA probe (DNA hibrid)
• 1.Banyaknya pasangan DNA yang salah.
• 2.Suhu dalam proses hibridisasi (pada suhu
tinggi dengan kadar garam medium
rendah, ikatan menjadi lemah).
• 3.Konsentrasi garam dalam medium hibridisasi
• (kadar garam tinggi pada medium menye
babkan hibridisasi stabil).
• 4.Kondisi pH dalam medium reaksi hibridisasi.
(pada pH 6 – 7, menyebabkan ikatan stabil.