Aplicación de un método estadístico en la optimización de un

reactivo para química clínica

Yaimí Farías Domínguez,1 Mariela Sijó Yero2 y Lilliam Valdés Diez3
1 Licenciada en Matemática.
2 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.
3 Licenciada en Química. Investigadora Auxiliar.

RESUMEN
Con el objetivo de determinar la mejor combinación de las concentraciones de los
componentes del reactivo alcalino del juego para la determinación de urea en suero, se
aplicó el método de Box y Wilson, que constituye un tratamiento estadístico muy
utilizado en la búsqueda de las condiciones óptimas en un plan experimental. Los
factores analizados fueron las concentraciones de hidróxido de sodio e hipoclorito de
sodio, y el criterio de combinación óptima de los componentes viene dado por un máximo
de la variable respuesta, que es en este caso la absorbancia. Se evaluaron los resultados
experimentales mediante este método y se determinó el punto extremal del modelo
matemático propuesto; así se obtuvo la combinación de concentraciones de 112 y 4,6
mmol/L para hidróxido de sodio e hipoclorito de sodio respectivamente, que constituye
la mejor variante del reactivo alcalino en el estudio realizado.

Descriptores DeCS: JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; QUIMICA CLINICA;

HIPOCLORITO DE SODIO; HIDROXIDO DE SODIO; MODELOS ESTADISTICOS;
UREA/sangre.

La optimización de procesos y productos plantea la necesidad de diseñar experimentos

para investigar varios factores al mismo tiempo, tratando de obtener un máximo de
información con un mínimo del tiempo necesario para realizar los ensayos, así como del
número de réplicas de cada tratamiento o condición experimental.

Es muy importante la elaboración de un diseño apropiado, a partir del cual se apliquen

procedimientos estadísticos escogidos cuidadosamente, que nos brinden respuestas
eficientes relacionadas con los objetivos del experimento.1

En los laboratorios de la Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay" se desarrolló

el juego de reactivos para la evaluación de urea en suero, basado en el método Berthelot
modificado con salicilato de sodio. El objetivo del presente trabajo es determinar la mejor
combinación de las concentraciones de los componentes del reactivo alcalino de este
juego. Para esto se aplicó el método de Box y Wilson, que constituye un tratamiento
estadístico muy utilizado en la búsqueda de las condiciones óptimas en un plan
experimental y que se ajusta a nuestro trabajo.

MÉTODOS
El rango de concentraciones analizado fue desde 1 hasta 10 mmol/L para el hipoclorito
de sodio (NaOCl) y desde 40 hasta 200 mmol/L para el hidróxido de sodio (NaOH); los
valores de concentración para ambos componentes en la formulación original fueron de
3,75 y 83 mmol/L respectivamente.

El criterio de combinación óptima de los componentes viene dado por un máximo de la

variable respuesta (absorbencia).
El método estadístico utilizado para diseñar el estudio y evaluar los resultados
experimentales fue el método de Box y Wilson o método de la máxima pendien-
te.2,3 Para esto denotamos a los parámetros estudiados de la forma siguiente:

- Absorbancia = Y
- Concentración de NaOCl = X1
- Concentración de NaOH = X2

Se tuvo que investigar el máximo de Y= f(X1, X2) con un número mínimo de corridas. El
valor inicial del estudio fue la formulación hasta ahora utilizada, que se denotó como A.

Procedimiento matemático

Para empezar se escogió un plan factorial 22, que dio lugar a 4 variantes del reactivo
alcalino que se probaron en sulfato de amonio, (NH4)2SO4, con 2 mL de agua destilada
al final de la reacción.

Fue necesario hacer una suposición sobre la forma de la función que relaciona la variable
objetivo y con las variables independientes X 1 y X2 que influyeron en ésta.

Se comenzó proponiendo un modelo lineal para la regresión (Y=B 0 + B1 X1 + + B2 X2),

y los coeficientes desconocidos B 0, B1 y B2 se determinaron en la ruta experimental
mediante el método de los mínimos cuadrados.4

Se continuó el procedimiento aumentando el grado del polinomio, proponiendo un

modelo cuadrático para la ecuación de ajuste (Y = bo + b1 X 1 + b2 X2 +b11 X12 + b22
X22 + b12 X1X2) y se seleccionó un plan factorial 32centrado en la variante de mayor
absorbancia del plan anterior.

A partir de aquí, para obtener los resultados experimentales, se consideraron 3

condiciones diferentes de reacción: (NH4) 2SO4 con 2 mL de agua destilada al final de la
reacción (reacción de trabajo inicial), (NH4)2SO4sin los 2 mL de agua destilada y en
solución de urea sin los 2 mL de agua destilada.

Se realizó el mismo procedimiento que para el plan factorial 2 2, considerando cada

condición de reacción independiente y se obtuvo el punto extremal del modelo cuadrático
propuesto para cada condición de reacción.5Finalmente se determinó la combinación de
concentraciones óptima del reactivo alcalino dentro de todo el estudio realizado.

Los tratamientos estadísticos involucrados en este método fueron aplicados mediante

el software estadístico STATGRAFICS, con un nivel de confianza del 95 %.

RESULTADOS
En la figura 1 se muestra el diseño factorial 22 centrado en el valor inicial A, que da lugar
a 4 variantes del reactivo alcalino.

Los resultados experimentales fueron los siguientes:

Y =Y1 = 0,093
Y2 = 0,083
Y3 = 0,077
Y4 = 0,106

FIGURA 1. Plan factorial 22.

donde: Y1 = absorbancia de la variante j (j=1, 2, 3, 4).

Mediante el análisis de regresión lineal se obtuvo la ecuación de regresión Y = 0,0797 +

0,00173 X1 + 0,000044 X2, con un coeficiente de determinación r2 = 0,2123, un valor
de la F calculada de 0,135 y la F teórica = F (0,05,2,1) = 199,5.

Del análisis de los resultados de las corridas se concluyó que la superficie presenta una
curvatura, por lo que se continuó el procedimiento aumentando el grado del polinomio,
proponiendo un modelo cuadrático:

Y = bo + b1 X1 + b2 X2 + b11 X12 + b22 X22 + b12 X1X2

y se seleccionó un plan factorial 32 tomando como centro del nuevo sistema a la variante
4 (X1 = 6,5, X2 = 123), que es el punto de mayor absorbancia del plan anterior como se
muestra en la figura 2, que da lugar a 9 variantes del reactivo alcalino.

Los resultados experimentales se obtuvieron en 3 condiciones diferentes de reacción,

como se muestra en la tabla 1.

TABLA 1. Valores de absorbancia en cada tratamiento. Diseño 3 2

Variante Sulfato de amonio Sulfato de amonio Solución de urea sin
con H2O sin H2O H2O
1 0,1033 0,1650 0,1506
2 0,1096 0,1530 0,1493
3 0,0880 0,1323 0,1373
4 0,1090 0,1673 0,1540
5 0,1016 0,1556 0,1506
6 0,0820 0,1340 0,1500
7 0,1113 0,1636 0,1380
8 0,1016 0,1513 0,1620
9 0,0870 0,1255 0,1515
El procedimiento se continuó aplicando independientemente para cada tratamiento, de
donde se obtuvo la ecuación de regresión cuadrática para cada uno de los casos
anteriores:

a) (NH4)2SO4 con H2O

Y = 0,10259 - 0,01117 X1 - 0,00014 X2 - 0,00767 X12 + 0,00255 X22 - 0,00225 X1X2

b) (NH4)2SO4 sin H2O

Y = 0,15578 - 0,01737 X1 - 0,00116 X2 - 0,00538 X12 - 0,00377 X22 - 0,00135 X1X2

c) Solución de urea sin H2O

Y = 0,15286 - 0,00056 X1 - 0,00238 X2 - 0,00712 X12 - 0,00338 X22 - 0,0067 X1X2

FIGURA 2. Plan factorial 32.

Del punto extremal de cada polinomio aproximado surgieron las variantes siguientes:

[NaOl] = 4,6 mmol/L

(1)
[NaOH] = 112 mmol/L
[NaOCl] = 2,01 mmol/L
(2)
[NaOH] = 128 mmol/L
[NaOCl] = 7,15 mmol/L
(3)
[NaOH] = 146 mmol/L
Finalmente estas 3 variantes se probaron en los distintos ensayos y los resultados se
muestran en la tabla 2, donde se observa que la combinación de concentraciones (1) se
comporta como la mejor variante en cada uno de los distintos ensayos.

TABLA 2. Valores de absorbancia en cada tratamiento. Puntos extremales

Variante
[NaOCl] [NaOH] Sulfato de Sulfato de sin Solución de
amonio con H2O amonio H2O urea sin H2O
4,6 112 0,1162 0,1766 0,1722
2,01 128 0,1028 0,1498 0,0996
7,15 146 0,1029 0,1438 0,1637

DISCUSIÓN
Con vistas a lograr la formulación óptima del reactivo alcalino del juego para la
determinación de urea en suero, se aplicaron tratamientos estadísticos basados en el
método de Box y Wilson o método de la máxima pendiente, para estudiar las
combinaciones posibles de las concentraciones de hipoclorito de sodio e hidróxido de
sodio dentro de un rango determinado y encontrar niveles de estas variables para los
cuales la respuesta (absorbancia) es óptima.

De acuerdo con el análisis de regresión lineal, podemos considerar falta de ajuste en el

modelo lineal inicialmente propuesto. Según el análisis de los resultados de las corridas,
se concluye que se está en una región en la cual la curvatura de la superficie debe
considerarse, por lo que se continúa el procedimiento proponiendo un modelo
cuadrático. Con el plan factorial seleccionado logramos un mínimo de 9 combinaciones
para ensayar en las 3 condiciones experimentales, se obtiene la ecuación de regresión
cuadrática y el punto extremal en cada caso. Con este análisis se determinan 3 nuevas
variantes, que nos posibilitan llegar a la mejor combinación de ambos componentes.

Este estudio nos ha permitido concluir la optimización del producto satisfactoriamente

con el menor número de ensayos posible y el procedimiento estadístico empleado es
aplicable, en general, para la optimización de un reactivo clínico, salvo cambios
inherentes a cada caso específico, en dependencia del objetivo del experimento.

SUMMARY
With the aim of determining the best combination for the concentrations of the
components of the alkaline reagent kit for the determination of serum urea, the method
of Box and Wilson was employed which constitutes a very used statistical treatment to
look for optimum conditions in an experimental plan. Factors subjected to analysis were
the concentrations of sodium hydroxide and sodium hypochlorite. The criteria for an
optimal combination of the components is the maximum of the response variable, which
in this case is the absorbance. Experimental results were assessed through this method,
and the extreme point of the proposed mathematical model was determined: Thus, the
combination for concentrations of 112 and 4.6 mmol/L was obtained for sodium
hydroxide and sodium hypochlorite, respectively, which constitutes the best variant of
the alkaline reagent in the study carried out.
Subject headings: REAGENT KITS; DIAGNOSTIC; CHEMISTRY, CLINICAL; SODIUM
HYPOCHLORITE; SODIUM HYDROXIDE; MODELS; STATISTICAL; UREA/blood

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Sigarroa A. Biometría y diseño experimental. La Habana: Editorial Pueblo y

Educación, 1985:256-66.
2. Box GEP, Wilson KB. On the experimental attainment of optimun conditions. J R
Stat Soc 1951: B13:1-45.
3. Cochram WG, Cox GM. Experimental designs. 2 ed. New York: Wiley and Sons,
1957:357-65.
4. Johnson NL, Leone FC. Statistics and experimental design. New York: Wiley and
Sons, 1964:176-80, 308--17.
5. Petersen RG. Design and analysis of experiments. New York: Marcel Dekker,
1985:252-82.

Recibido: 13 de enero de 1997. Aprobado: 2 de marzo de 1997.

Lic. Yaimí Farías Domínguez. Empresa de Productos Biológicos "Carlos J Finlay." Infanta
No. 1162, municipio Centro Habana, La Habana 10300, Cuba.