Las Lipasas :

Aplicaciones en Biotecnología
Definición :

Una “lipasa verdadera” (EC 3.1.1.3) se define

como una carboxilesterasa capaz de catalizar
la hidrólisis y la síntesis de acilgliceroles de
cadena larga, teniendo como sustrato standard
a la trioleina.

Acilglicerolhidrolasas o triacilglicerolhidrolasas
Origen de las lipasas:
•Las lipasas son enzimas ubicuas que pueden ser encontradas
en:
Microorganismos
Plantas
Animales

•Comercialmente en su mayoría son de origen microbiano

Hongos
Bacterias
Levaduras

•Generalidades
Peso molecular 20-60 kD
Contienen 2-15% de carbohidratos
pH óptimo = 8-9 lipasas animales; 5.5-8.5 microbianas
Topt = 30-60 oC
Lipasas disponibles comercialmente
 Pureza de lipasas disponibles comercialmente

Origen de la lipasa % de Actividad vs Bandas bandas Número % de

proteína Trioleína SDS-PAGE SDS-PAGE de actividad
U/mg kD bandas proteolítica
esterasa

Rhizomucor miehei 3.5 16 25 5 2 1

Rhizopus spec. 4.8 32 43, 67 10 4 3
Humicola lanuginosa 2.9 10 20,30 4 2 20
Candida rugosa I 4.2 11 20,30,43, 13 2 <1
67,90
Candida rugosa II 6.4 14 43,67 11 2 <1
Geotrichum candidum 4.3 8 67 3 0 <1

Pseudomonas fluorescens 1.2 30 14,25,40, 6 3 <1

43
C.viscosum I 1.1 45 17,30,40 3 1 0

C. viscosum II 9.5 154 17,30,40 3 1 12

 Controversias en las propiedades de lipasas
disponibles comercialmente

Origen de la lipasa Observaciones

Candida rugosa (CRL) Inicialmente clasificado como Candida cylindracea,

clonación y purificación de la proteína revela al menos
cinco isoformas.

Geotrichum candidum (GCL) Contiene dos isoformas que se diferencían en la

especificidad cis o trans en acidos grasos insaturados

Rhizopus (RAL, ROL,RDL, RNL) En la literatura se reportan diferentes especificidades

aunque la clonación reveló identidad casi total.
Penicillium camembertii (PeCL) Clasificada como lipasa de P. cyclopium hasta 1990,
recientemente se encontraron cuatro isoformas que
difieren principalmente en el patrón de glicosilación

Pseudomonas glumae (PGL) Clonación y secuenciación reveló alta identidad con la

lipasa de Chromobacterium viscosum (CVL).

Pseudomonas cepacia (PCL) Reclasificada en 1995 como Burkholderia cepacia.

Clonación y secuenciación reveló identidad con la lipasa
de Pseudomonas. sp. ATCC21808 (PSL).
Clasificación reciente basada en los motivos
conservados de su secuencia y en sus
propiedades biológicas
 Propiedades estructurales : Plegamiento común de las
lipasas
C
His
Ser
Asp/Glu •Patrón de plegamiento /
compuesto por un “core” de 
hebras rodeado por helices 
N tipico de numerosas
hidrolasas

D •El sitio activo esta

A B C F compuesto de una triada
catalítica formada por Ser-
His-Asp/Glu
2
4 5 6 8
3 7
•A diferencia de muchas
enzimas el sitio catalítico no
esta expuesto en la
En rojo se presentan los motivos comunes a todas las lipasas
superficie, se encuentra
En blanco se presentan los motivos presentes en la mayoría de
cubierto por residuos
las lipasas
hidrofóbicos
Las hélices A y F están en el lado cóncavo de las hebras 
La hélice D esta a menudo compuesta de una sola vuelta
Mecanismo de activación interfacial en las
lipasas

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décompresseur
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 Mecanismo de activación interfacial en las
lipasas

C) estructura cerrada D)estructura abierta

•El sitio catalítico de muchas lipasas se encuentra cubierto por una “tapa” formada por
un “loop”
•Este arreglo estructural hidrfóbico al interaccionar con superficies hidrofóbicas
genera una estructura catalíticamente activa de tapa abierta
•Se localiza desde el N terminal o desde el C terminal
•Cutinasa (lipasa) no posee esta tapa
•La presencia de la tapa
cubriendo el sitio activo de las
lipasas y el fenómeno de
activación interfacial no
adecuado para distinguir
lipasas de esterasas.

•Varias enzimas tienen la tapa

hidrofóbica pero no presentan
activación interfacial

•p.e. Pseudomonas glumae,

Pseudomonas aeruginosa,
C.antarctica B, y lipasa
pancreática, lipasa
Acceso al sitio catalítico de las lipasas

C) estructura cerrada D)estructura abierta

•Vista de arriba de la lipas de Mucor miehei

•En rojo zonas polares y en azul zonas hidrofóbicas
•En amarillo sitio activo
 Sitio activo y especificidad en lipasas

Se han identificado cuatro sitios de reconocimiento del sustrato en el

sitio activo :
Un agujero oxianión y tres sitios de unión específica de los residuos
acilo en los triglicéridos, sitios sn-1, sn-2, y sn-3 del glicerol
sn1
OR

RO sn2

sn3
OR

La diferencia de tamaño y del balance hidrofóbico/hidrofílico en estos

sitios determina la especificidad de cada lipasa

Especificidad por el tamaño de la cadena acilada

Regioespecificidad sn-1, sn-2, y sn-3
 Mecanismo catalítico
His

O Se r
Asp N N H O
O H
R
O
H
O
dona dor de a cilo

His

O Se r
Asp N N H O
O R1 O R
His H
R1 OH O
O Se r
Asp N N O
O H R
Intermediario acil-enz ima O
R2 OH

+ R1 OH
His

O Se r
Asp N N O

O H R
H O
R2 O

His

O Se r
Asp N N H O

O R2 O R
H
O His

O Se r
Asp N N H O

O H
R
O
+ R2
O
PRODUCTO
 Reacciones catalizadas por las lipasas
Hidrólisis
O O
+ H2O + R2OH
R1 OR2 R1 OH

Esterificación
O O
+ R2OH
O + HOH
R1 OH R1 OR2

Transesterificación
O O O O
+ + Acidólisis
R3 OH R1 OR2 R1 OH R3 OR2
O O
+ R3OH + R2OH Alcoholisis
R1 OR2 R1 OR3
 (cont.)
Interesterificación
O O O O
+ +
R3 OR4 R1 OR2 R1 OR4 R3 OR2

Aminólisis
O O
+ R3NH2 + R2OH
R1 OR2 R1 NHR3

Tioesterificación
O O
+ R2SH + HOH
R1 OH R1 SR2

Amidación
O O
+ R3NH2 + HOH
R1 OH R1 NHR3
 Control del equilibrio termodinámico del proceso

Control del grado de acilación de polioles

OH

Monoésteres, OH
n
Diésteres, OH

Triésteres……..
HO
O
HO
OH
HO OH

-Emulsificantes para especialidades farmacéuticas

-Vehículos para medicamentos
-Bloques de construcción en síntesis orgánica
Control de la posición del equilibrio termodinámico

Actividad termodinámica: a = X
 = coeficiente de actividad
X = fracción mol
El coeficiente de actividad termodinámica función del
número del número y tipo de interacciones soluto-solvente
Control de la posición del equilibrio termodinámico en reacciones laterales

fatty aci d fatty aci d fatty aci d

RCOOH RCOOH RCOOH
HO RCOO RCOO RCOO
OH OH OH OOCR
HO HO RCOO RCOO
H2O H2O H2O
gly cerol monoacylglycerol dia cy lgly ce rol tria cy lgly ce rol

•Bloqueo de la síntesis de di- y triésteres por aumento de

sus coeficientes de actividad
•Favorecer la síntesis de monoésteres por disminución de
sus coeficientes de actividad
 triole ína
monoole ína
dioleína
O monoole ína
O
monoole ína O
triole ína
monoole ína
O monoole ína O dioleína
dioleína monoole ína monoole ína

triole ína O monoole ína monoole ína O

dioleína
monoole ína
O ína
monoole monooleO
ína
O dioleína
dioleína

trdioleína

•Coeficiente de actividad alto = baja interacción soluto-solvente,

baja concentración al equilibrio

•Coeficiente de actividad bajo = alta interacción soluto-solvente,

alta concentración al equilibrio
Síntesis enzimática de monooleína :
Glicerol + Ácido oléico en n-hexano
•Buena solubilidad del ácido graso >0.5 M
•Compatibilidad de las enzimas con solventes hidrofóbicos
• Baja solubilidad del glicerol

•Rendimiento alto: 80%

•Baja selectividad por
monoésteres
•Trioleina 70%
trioleina
•Dioleina 27%
dioleina •-Monooleina 3%
monooleina
Síntesis selectiva de monoésteres de polioles

Concentración de productos (mM)

45
45
40
35
35
30
25
25
20

monooleina 15
15
10
dioleina
55
0
trioleina 15 10 55 0
0
75 50 20 15 10
100 50 20
100 75
% de 2M2B en n-hexano
Modelo de predicción de la síntesis selectiva de
monoésteres de polioles

•Cálculo teórico de los

coeficientes de actividad por
UNIFAC

•Calculo de las actividades

termodinámicas de los productos
al equilibrio

•Buena correlación del modelo

con resultados teóricos
 Síntesis selectiva de monooleina por glicerólisis
70

Glycerolysis Products (mol %)

60

50

40

30

20

10

•Se pueden alcanzar concentraciones de producto entre 0.5-1 M

•Proceso que se puede realizar en reactor contínuo
Síntesis selectiva de ésteres de xilitol
CH3
OH OH
O CH3
OH O
OH O
+ 2 H3C CH3
HO O
OH H3C O
CH3
OCO-R RCO-Cl/trietilamina

OH
OH CH3
OCO-R
O ethanol 95 oC/H+ O CH3
O
H3C O
CH3 O

H3C O
ethanol 95 oC/H+
CH3

OCO-R ethanol 95 oC/H+

OH
Lipasa OH
RCOOH/45 oC
HO
OH
 Síntesis selectiva de ésteres de xilitol
O-Acyl
OH
Pola r solvent
OH OH 1-O-mono-acylxylitol
mixtures
OH HO
OH OH
+ Acyl
HO
O-Acyl O-Acyl
Xy lito OH
OH OH
Hy drophobic solvent O-Acyl+ O-Acyl
mixtures
HO Acyl-O
OH OH
1,5-O-di-acylxylitol 1,3,5-O-tri-acylxylitol

100

90
monoéster de xylitol 94
di- and triésteres de xylitol
80
Productos (mol%)

70 73
69
60 63
55
50
45
40
37
30 31
27
20

10
6
0
2M 2P/DM SO 80:20 2M2P 2M2B 2M 2B/hex 50:50 n-hexane
(44,9) (43,8) (41,5) (39,7) (30,9)

Solv ente
Parame tro de polaridad ET(30)
Coeficiente de actividad en función del parámetro de polaridad ET30

•Predicción de la abundancia de los prooductos en función

de la polaridad del medio de reacción

•Evaluado para un gran número de mezclas de solventes

(acetona, acetonitrilo, DMSO, hexano, 2M2P, ……..)
 Control de la quimioselectividad del proceso

R1 O O
NH2
R1 R1
N R3 + O R3
R2 2M2B H
Vainillilamina+ R2 R2
R3-COOH Amida 95% Ester 52%
R1 Lipase
OH
O O
R1 R1
R2
n-hexane N R3 + O R3
Vainillilalcohol H
R2 R2
R1 = -OCH3
R2 = -OH Amida 54% Ester 95%

Baja actividad termodinámica de ésteres en n-hexano

Baja actividad termodinámica de amidas en 2M2B
 Resolución de mezclas racémicas
quimioselectivamente
17% 83%
RCO O NH2 H
OH N OCR
n +
n
OH OH
OH NH2 2M2B
(S) (R)
n + R-COOH Lipasa
OH
RCO O NH2 H
(rac)
n-hexano
OH N OCR
n +
n
OH OH
(S) (R)
70% 30%
 Síntesis de inductores selectivos de apoptosis en
células cancerosas
OH R2
R1 NH2
HO
R3
R2 + O ácido ferúlico

R1 = H 2M2B Lipasa
R2 = -OH
R3 = -OMe
R2
OH H
R1 N
R3
O
R2

3-(4-Hydroxy-3-(S)-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxy-phenyl)-2-methoxy-ethyl]- acrylamide

Síntesis preferencial de amidas en 2M2B

Reacción enantioselectiva
 The Chiral Market
• Market Share Forecast
Chiral Technology Market Share Forecast Breakdown 2002-2009

2002

2003

Growth of Biological
2004

2005
Traditional

Decline of Traditional
2006 Asymmetric
Biological
2007

2008

2009

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Chiral Technology Market
 •Enantioselectividad

Poderosos Bloques de construcción

en química orgánica

25% : (2S,4S)

Enzimas mas utilizadas:

•Lipasas
•Esterasas
•Amidasas

50% : (2R,4R) 25% : (2R,4S)

Resolución cinética con lipasas

Evitar reversibilidad de la resolución

•Generación de centros quirales por acilación
OH OH COOH OH OOPhe
Lipasa
n + n + H2O
Solvente orgánico
OH OH
carbono aquiral (R) ó (S)

•Bloques de construcción en síntesis orgánica

•Construcción de librerias
•Resolución de centros quirales (en polioles)
•Modelos moleculares para RMN
 “Easy-On, Easy-Off Technology”
CH3 CH3 CH3
R1 Lipasa R1 R1
NH2 + N OCR3+ NH2 + H O
R3COO 2
2M2B H
R2 R2 R2
(R) (S) EASY-ON
CH3 CH3
R1 Lipasa R1
OCR3 N NH2
H
+ H2O + R3COO EASY-OFF
R2 R2
(R)
(R) ó (S)
R 1 = -0CH3 R 2 = -0H R 3 = cadena hidrocarbonada

Sintesis-hidrólisis de amidas
“Imposible” la hidrólisis de amidas con lipasas
Proceso altamente enantioselectivo
Sistemas de reacción para las lipasas

SOLVENT SYSTEMS AND PROCESSES

1. Aqueous Reaction Media : Hidrolysis

2. Water: Water-Miscible Systems : Hydrolysis or Synthesis

3. Water: Water-Immiscible Systems : Hydrolysis or Synthesis

4. Nonaqueous Reaction Media : Synthesis

5. Anhydrous Reaction Media : Synthesis

6. Supercritical Fluids : Synthesis

7. Reverse Micellar Systems : Synthesis Sistemas

con bajo
8. Solvent-Free Systems : Synthesis contenido
de agua
9. Gas-Phase Catalysis : Synthesis

10. Ionic Liquids : Synthesis

PREPARATION OF MODIFIED LIPASES

A. Immobilization

• Adsorption onto solid supports such as silica gel

• Covalent attachment to solid supports
• Entrapment in organic polymers or microemulsions.

B. Chemical Modification

1. Cross-Linking :

• Use of glutaraldehyde to prepare insoluble cross-linked

enzyme crystal (CLEC)

• P. cepacia and C. antarctica lipases for CLEC-catalyzed

resolution of phenyl acetate (ALTUS-Biotech)
2. Modification with Polyethylene Glycol, Polymers and Surfactants

• Enhanced stability of C. rugosa lipase in isooctane by treating the

enzyme with p- nitrophenyl chloroformate and cyanuric acid
chloride activated PEG.

• Alternative to PEG is to use the nonionic amphiphilic

polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35) as a covalent modifier

• Hydrophobic polymers such as polystyrene and polymethyl

methacrylate or amphiphilic polymers such as poly N-vinylpyrrolidone

• Nonionic synthetic dialkyl amphiphiles or sorbitan monostearate

(Span 60)
Aplicaciones industriales de las lipasas

•Aplicaciones en oleoquímica : Hidrólisis de triglicéridos

• Disponibilidad de materia prima, 60 millones de tons de aceites y

grasas por año.

•Cinco millones de toneladas para uso no alimentario

•La principal aplicación es la obtención de jabones, proceso químico

•El uso alternativo de las lipasas (hidrólisis de grasas y aceites)

permite condiciones mas suaves, mejor calidad del producto y
mejor rendimiento de glicerol como subproducto

•Miyoshi Yushi, en Nagoya, Japón, la única empresa en el mundo

que usa esta tecnología con Candida rugosa lipase.

•Proceso en lote a 40 oC, durante 48 horas

 •Síntesis de metil- o etil- ésteres de ácidos
grasos por alcoholisis : Biodiesel

•An alternative source of energy for public transport is the so-called

biodiesel, reduces sulfur oxide production.
•METHYL ESTERS OF FATTY ACIDS

•Produced chemically using oil from various plants (e.g. rapeseed).

•Alcohoysis catalyzed by KOH

•Can be catalysed in a single transesterification reaction using lipases in

organic solvents.

•At an industrial scale failed so far because of the high cost of the
appropriate biocatalyst.

•Two strategies were recently presented :

•Immobilisation of P. fluorescens lipase increased its stability even

upon repeated use

•Cytoplasmic overexpression of Rhizopus oryzae lipase in

Saccharomyces cerevisiae with subsequent freeze-thawing and air
drying resulted in a whole-cell biocatalyst
Mejoramiento de la untabilidad de los aceites

Se puede modular el punto de fusión de una grasa por

hidrogenación de dobles enlaces

Un metodo alternativo es la incorporación de ácidos grasos

saturados al aceite por interestificación enzimática

sn1 sn1 sn1 sn1

OR OX OX OR
Lipase
RO sn2 + XO sn2 RO sn2 + XO sn2

sn3
OR sn3
OX OX OX
sn3 sn3
Síntesis de sustitutos de grasa de cacao

•En 1995 100,000 toneladas de grasa de cacao fueron exportadas

por Kenia y Malasia

•Grasa con demanda en alimentos y farmacia (Pf = 37 oC)

sn1
OR

Para X = oléico, Y = esteárico y R = palmítico

XO sn2

OY Grasa de cacao compuesta de SOS o SOP primordialmente

sn3

•Interesterificación enzimática del aceite de palma (POP) o de girasol

(OOO) con ácido esteárico o triesterarina (SSS).

•Uso de lipasas 1,3 específicas en proceso limpio

•Unichema (ICI) produce varios cientos de toneladas y Fuji Oil varios

miles de toneladas utilizando lipasas de Rhizopus.
 Grasas de alta digestibilidad

•Mejoramiento en la absorción de triglicéridos

•Triglicéridos con palmítico en posición sn-2 mejor absorción

sn1
OR

Para X = palmítico
XO sn2

OY Grasas de alta digestibilidad, p.e. leche materna

sn3

•Unichema produce OPO en dietas para niños prematuros por

interestirificación de tripalmitina y ácido oléico

•Otro tipo de grasas de facil digestión son MLM (M=medium, L=long

refiriendose al tamaño de cadena acilada)

•“Caprenin” (C6,C22:0,C8) producido por Procter&Gamble mediante

síntesis química
Síntesis de emulsificantes

•Monoglicéridos emulsificantes mas utilizados en la industria de

alimentos

•150,000 ton preparadas por glicerólisis química a partir de

triglicéridos

•Los métodos enzimáticos incluyen :

Esterificación y glicerólisis

•Bajos rendimientos y proceso económicamente desfavorable

•Necesidad de abaratar el costo del biocatalizador y aumentar su

estabilidad operacional
Aplicaciones diversas (Hidrólisis)

•Detergentes: Remoción de productos lipídicos

•Productos comerciales : Lipolasa de Novo-Nordisk, Lipomax de

Gist-Brocades y Lumafast de Genencor.

•Industria papelera : Eliminación de triglicéridos de pulpa de

celulosa o eliminación de tintas a base de lípidos en papel reciclado
por Nihon Seishi Co.,

•Industria de lacteos : mejorar la calidad de cuajadas,

generación de aromas y sabores en quesos o preparación de
aditivos a partir de productos lacteos
 Promiscuidad Catalítica:

Viejas enzimas Nuevas reacciones

O O
O O O O Nü
NŸ
O O
+ "Natural reaction" "Unatural reaction" O O
O O
OH O O
Ser-Hydrolase Ser-Hydrolase HO OH
O HOHO OH HO
HOHO OH OH + Nü
NŸ OH
OH NŸ=Nucléophile
= Nuclˇ ophile
Nü

Single-enzyme multi-step conversions

 “Catalytic promiscuity in enzymes is the ability of
enzyme active sites to catalyze more than one chemical
transformation”

•Posibilidad de las enzimas para reaccionar sobre:

•Diferentes grupos funcionales

•Diferentes tipos de enlace
•Diferente mecanismo de reacción

47
Angew. Chem. Int Ed. 2004, 43, 6032-6040
 Reacciones de adición tipo Michael catalizadas por
lipasas

• Formación de enlaces C-C

Nucleófilos
Nucleófilo

Electrófios

Ataque nucleofílico
enlaceC-C
48
 Addition d'amines secondaires
R1 R1
CALB
NH + CN N
R2 R2 CN
(5) (6) (7)

Amines NH NH
N
H
addition d'imidazoles
R2
H
N O Hydrolase
R1 + R3
N
N O
N O 50ū C
50°C R3
R2
solvant
Solvant org.
organique
R1
(8) (9) (10) O

Addition 1,4 d'amines sur des systèmes  insaturés

a) Torre, O.; Alfonso, I.; Gotor, V.; Chem. Commun. 2004, 1724; 14; b) Cai, Y.; Wu, Q.; Xiao, Y. M.; Lv, D. S.;Lin, X. F.
J. of Biotech., 2006. 49
Mecanismo Clásico
Oxyanion
hole
CH3 O
(Thr40)
CH3 O H
O H
(Gln 106) N O
H H
H
H
O-
(Ser)
O O
H

N
N
H
O O (His)

(Asp)

50
 Mecanismo propuesto para
Ser-Hidrolasas

Acido de Lewis

Transferencia de protón
Acido-Base

Desplazamiento catalítico

51
But : Preparación de intermediarios de la
síntesis de -aminoácidos con estereo
quuimica específica

NH2 O

R  OH

52
 O O O

H OCH3 Me OCH3 Ph OCH3

(12a) (12b) (12c)

methyl acrylate methyl crotonate methyl cinnamate
Esters   insaturés
O O

H OCH3 H OCH3
Me Ph
(12d) (12e)
methyl methacrylate methyl 2-phenylacrylate

CH3

NH2 NH2

Amines primaires NH3

(R) and (S)
Amoníaco
Ammonium Benzylamine
Bencilamina (R) y (S) 53
phenylethylamine
-feniletilamina
 Oxyanion Oxyanion
hole hole
CH3 O CH3 O
(Thr40) (Thr40)
CH3 H CH3 O H
O O O H
H N O
(Gln 106) N O (Gln 106) H H
H H H
H O H
H
O-
MeO
(Ser)
O O H CH3
HN
H
H
N N
N N
H H
O O (His) O O His

(Asp) Asp

Figure 1. Hypothetical catalytic addition of benzylamine to

methyl crotonate in the active site of CaL-B. The carbonyl
oxygen of the ,-unsaturated is bound to the oxyanion 54
hole and the nucleophile is activated by His.
 Posibles reacciones
Ph NH O
Adición 1,4

Me OMe (3)
O
+
CaL-B
Ph NH2 + Me OCH3 72 h, 65oC
O

(1) (2) Solvent

Me N Ph (4) Adición 1,2
H
+
Ph NH O

Me N Ph
(5) Doble Adición 1,4
H

Se ha reportado la formación preferencial de amidas :

•Solventes no polares
•Bajas concentraciones de sustrato (Metil acrilato)
•Temperaturas ≈ 45 ºC 55
Table 1. Influence of organic media on the reaction of 0.5 M of
Benzylamine (1) and 0.75 M of Methyl crotonate (2) using 20
mg/mmol of CaL-B/(1), at 65 °C for 72 h.

Entry Solvent ET(30) NMR Ratio

% (3) % (4)

1 n-Hexane 30.9 95 5
2 Toluene 33.9 76 24
3 DisoPropyl ether 34 64 36
4 THF 37.4 60 40
5 n-Hex:2M2B, 1:1 39.2 46 54
6 n-Hex:2M2B, 1:3 40.1 48 52
7 2M2B 41.0 20 80

56
Changes in polarity of reaction media describing the profile of (A) Michael
adduct (3) and (B) aminolysis product (4) as a function of empirical polarity
parameters ET(30).

57
Table 2. Influence of the initial concentration of (1) in n-hexane on
the ratio of (3) and (4) determined by HPLC, after 72 h of reaction.

Entry[a] [1] (M) %3 %4 (%)Conv [b] Final Conc. (M)

(3) (4)

1 0.50 >95 <5 85 0.40 0.02

2 0.25 63 37 49 0.08 0.04
3 0.10 62 38 53 0.03 0.02
4 0.05 37 63 66 0.01 0.02

[a] Substrate initial concentration ratio 1:1.5 (1) with respect to (2).
[b] Determined by HPLC and referred to initial concentration of (1).

58
Aplicacion en química orgánica
 Las Lipasas :

Aplicaciones en Biotecnología