S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L.

Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253

PA

Institut Nutrisi Ternak

Sven Dänicke Ewa Swiech

Tanja Goyarts Lucyna
Buraczewska

Pengukuran sintesis albumin pada babi dengan

menggunakan L- [2H5] fenilalanin sebagai
pelacak isotop stabil

Diterbitkan di: Landbauforschung Völkenrode 55 (2005) 4: 245-253

Braunschweig
Federal Agricultural Research Center (FAL)
2005
PA
 S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
PA

2
Pengukuran sintesis albumin pada babi dengan menggunakan L- [ H5] phenylalanine sebagai
pelacak isotop stabil
1 2 1 2
Sven Dänicke , Ewa Swiech , Tanja Goyarts dan Lucyna Buraczewska

Ringkasan
Zusammenfassung
Dua percobaan dengan babi yang sedang tumbuh
dilakukan untuk mengukur laju sintesis albumin Messung der Albuminsynthese des Schweins unter
2
2
menggunakan [ H5] fenilala-sembilan sebagai pelacak Verwendung von L- [ H5] Phenylalanin als
isotop stabil. Isotop diinfuskan bersama dengan Stabilisoteptor-Penanda
fenilalanin tak berlabel pada dosis besar 45 dan 125 mg /
kg berat badan untuk "membanjiri" semua kolam Es wurden zwei Eksperimen mit Mastschweinen
prekursor albumin yang semaksimal mungkin dalam durchgeführt, um die Syntheserate von Albumin mittels
2
Eksperimen 1 dan 2, masing-masing. Sampel darah des Stabilisotop-Spidol [ H5] Phenylalanin zu messen.
dikumpulkan sering hingga 90 menit setelah infus dan Das Isotop wurde zusammen mit unmarkiertem Phenyla
waktu pengayaan isotop dari kolam renang albumin-pre- lanin dalam massiven Dosen von 45 (Exp. 1) und 125
kursor (diasumsikan diwakili oleh pengayaan fenilalanin (Exp. 2) mg / kg Körpergewicht infundiert, um alle
bebas plasma) dan albumin diikuti. Pengayaan kolam möglichen Albumin-Precursor-Pools jadi einheitlich wie
prekursor menurun secara signifikan lebih tajam dalam möglich zu markieren und zu „fluten“ . Eswurden
Percobaan 1 dari pada Percobaan 2 seperti yang mehrere Blutpro ben bis zu 90 Minuten nach der Infusion
ditunjukkan oleh pengayaan isotop 60 menit setelah infus entnommen, um den Zeitverlauf der Isotopen-
dibandingkan dengan pengayaan ekstrapolasi pada nol, Anreicherung des Albumin- Precursor-Pools (hierbei
menunjukkan bahwa "banjir" dari kolam prekursor lebih wurde angenommen, dass dieser durch die Anreicherung
efisien. dalam eksperimen yang terakhir. Integrasi isotop des freien Phenylalanins im Plas ma repräsentiert würde)
tergantung waktu ke dalam albumin terbukti linear dalam und von Albumin verfolgen zu können. Im Eksperimen 1
kedua percobaan meskipun banjir jelas jelas dari kolam tenggelam mati Anreicherung des Albumin-Prekursor-
prekursor dalam studi pertama. Meskipun tidak ada Pools yang menunjukkan steiler al di Experi ment 2,
perbedaan yang signifikan yang terdeteksi untuk estimasi wenn die Isotopen-Anreicherung 60 menit n der der
tingkat sintesis albumin fraksional antara kedua penelitian Infusion mit der extrapolierten Anreicherung zum Zeit
(16 30% per hari dari massa albumin intravaskuler) itu punkt null in Verhältnis gesetzt wurde. Daher kann ange
dipuji untuk menggunakan dosis yang lebih tinggi dari nommen werden, dass das „Fluten“ des Albumin-Precur-
125 mg fenilala sembilan / kg berat badan untuk sor-Pools im letzten Experiment effizienter war. Die zeit
memastikan pelabelan bentuk yang cukup tinggi dan uni abhängige Isotopen-Inkorporation dalam perang das
dari semua prekursor pendahuluan yang mungkin, yang Albumin, trotz der offensichtlich weniger effizienten
merupakan prasyarat penting untuk perkiraan tingkat „Flutung“ des Albumin-Prekursor-Renang im ersten
sintesis protein yang memadai sesuai dengan apa yang Eksperimen, di lini eksperimen. Obwohl keine
disebut teknik dosis banjir. signifikanten Unter schiede der geschätzten fraktionellen
Syntheserate (16 30% pro Tag der intravaskulären
Kata kunci: Sintesa albumin, babi, isotop stabil Abumin-Masse) zwi schen den beiden Studien
nachgewiesen werden konnte, wird empfohlen, die
höhere Dosis von 125 mg Phenylala- nin / kg
Körpergewicht zu verwenden, um eine ausreichend hohe
und gleichmäßige Markierung aller möglichen Albuine-
Precursor-Pools als eine entscheidende Vorbedingung zur
adäquaten Schätzung der Protein-Syntheseraten ent
sprechend der angewendeten jadi genannten „flooding
dose“ -Technik, zu gewährleisten.

Schlüsselwörter: Albumin Synthese, Schwein, Stabil-Iso-

top

1
Institut Nutrisi Hewan dari Pusat Penelitian Pertanian Federal (FAL),
Bundesallee 50, 38116 Braunschweig / Jerman
2
The Kielanowski Institute of Animal Physiology and Nutrition, ul.
Instytucka 3, 05-110 Jablonna dekat Warsawa / Polandia
 PA

1 Pendahuluan
menggabungkan hasil kedua studi itu harus dievaluasi
apakah banjir dari kolam gratis tercapai atau tidak,
Konsentrasi albumin plasma tidak selalu mencerminkan
yang sangat penting untuk perkiraan tingkat tesis
sintesisnya oleh hati karena hanya keseimbangan bersih
albumin pecahan.
antara sintesis albumin, degradasi dan melarikan diri
transcapil lary dan mungkin lebih lanjut dipengaruhi oleh
2 Bahan dan Metode
perubahan dalam plasma. volume (Ballmer et al., 1990).
Oleh karena itu, pengukuran langsung sintesis albumin
2.1 Prosedur
dengan menggunakan niques teknologi isotop sangat
membantu dalam menafsirkan banyak kondisi gizi,
2.2.1 Percobaan 1
fisiologis dan patologis jaringan ini. Ada dua teknik utama,
yang disebut sebagai "metode infus konstan" dan "metode
Tiga ekor babi betina Polandia Besar Putih x
banjir," menggunakan isotop baik radioaktif atau stabil
(Pietrain x Duroc) yang disilangkan (39 kg + 3 kg,
berlabel asam amino untuk pengukuran in vivo sintesis
babi 1-3) digunakan. Mereka secara pembedahan
protein(Garlick et al., 1994). Kedua metode bergantung
dilengkapi dengan kateter polivinil klorida permanen
pada pencapaian dataran konstan dari aktivitas spesifik atau
yang ditempatkan di vena jugularis, kemudian
pengayaan isotop dari kolam prekursor. Kerugian dari
tunnelled subkutan dan punggung dibesarkan riorized.
metode infus konstan, yang membutuhkan infus sekitar 6
Babi disimpan di kandang keseimbangan individu
jam dari asam amino tracer, didiskusikan oleh Gar lick et al. setelah operasi selama prosedur berikut. Pada hari
(1994). Ini terutama mencakup kebutuhan untuk pengukuran, dosis besar campuran L-fenilalanin (P
pemeliharaan kondisi mantap selama pengukuran ini dan 8324, Sigma-Chemie, Deisenhofen, Jerman) dan L-
pelabelan non-seragam asam amino bebas-plasma, bebas 2
[ H5] fenilalanin (DLM 1258, Promochem, Wesel,
intraseluler dan tRNA. Sebaliknya, metode banjir
didasarkan pada infus dosis besar asam amino pelacak Jerman) secara fisiologis saline (104 mmol / L, 11
persen atom berlebih, MPE) diinfus intravena (45 mg
sebagai bolus yang meningkatkan konsentrasi asam amino
fenilalanin per kg berat badan) setelah menyelesaikan
itu di semua kolam bebas berkali-kali di mana di mana
makan pagi. Infus selesai dalam 3 menit. Sampel darah
kemungkinan kolam prekursor diberi label lebih seragam
diambil pada 2, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70 dan 90 menit
dalam waktu singkat. Hal ini memungkinkan evaluasi
setelah infus, disiapkan untuk plasma dan disimpan
kinetik yang disederhanakan dari penggabungan label ke
beku sampai disiapkan untuk analisis lebih lanjut.
protein yang baru disintesis seperti albumin.
Pada manusia, sintesis albumin diukur dengan metode 2.1.2 Percobaan 2
banjir ini dengan menggunakan isotop stabil. Dosis yang
digunakan untuk membanjiri kolam gratis berkisar antara Untuk percobaan ini, empat ekor babi jantan dikebiri,
43 dan 57 mg / kg berat badan dan tingkat sintesis fracional Jerman Landrace x Pietrain yang disilangkan,
yang sesuai dari albumin (FSR) bervariasi antara sekitar 3 digunakan (38 kg + 3 kg, babi 4-7). Pada prinsipnya,
dan 10% dari kolam albumin intravaskular per hari babi diperlakukan seperti yang dijelaskan untuk
tergantung pada eksperimental. faktor ujian masuk (Hunter Percobaan 1, dengan pengecualian bahwa dosis
et al., 1995, 2001; Ballmer et al., 1990, 1995a, b, 1996; fenilalanin infus ditingkatkan menjadi 125 mg / kg
McNurlan et al., 1996; Slater et al., 1995). Pada babi, FSR berat badan (150 mmol / L). Pengayaan larutan infus
albumin sering diukur dengan metode infus konstan saja juga ditingkatkan menjadi 29 MPE untuk
dan nilai berkisar antara sekitar 10 dan 40% (Jahoor et al., meningkatkan keandalan pengukuran pengayaan isotop
1994, 1999; Mackenzie et al., 2003) yang umumnya akan yang sangat rendah dalam fraksi albumin. Selain itu,
memberikan gest tingkat yang lebih tinggi. di babi yang sampel kali berbeda dari Percobaan 1 dalam sampel
sedang tumbuh. darah dikumpulkan hanya 30, 40, 50, 60 dan 90 menit
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengadopsi setelah infus untuk babi 6, dan 30,
2
teknik dosis flooding - dengan L- [ H5] fenilalanin sebagai 45 dan 60 menit setelah infus untuk Babi 4, 5 dan 7.
asam amino pelacak yang diukur dengan spektrometri
massa kromatografi gas (GC-MS) - untuk pengukuran 2.2 Analisis
sintesis albumin pada babi. . Untuk tujuan ini, dua
percobaan dilakukan. Dalam percobaan pertama, dosis The langkah-langkah prinsip dalam persiapan plasma
membanjiri dari pelacak asam amino fenilalanin adalah cho untuk mengukur peningkatan pengayaan isotop di
sen menurut studi manusia yang dikutip, sedangkan pada albumin dan dalam plasma bebas fenilalanin, yang
percobaan kedua dosis ditingkatkan untuk dianggap sebagai indikator dari kolam prekursor,
memperhitungkan FSR jelas albumin pada babi. Dengan digambarkan pada Gambar 1.
 S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
PA

Albumin P
P Trichlorooaacceettic acidSup pada 60 ° C dalam oven pengeringan, dicuci dengan 5 ml
Dissolvin
Electroph concentratio l Clean-up,
P precipitaattion of proteins
erna air suling ganda dan dikeringkan lagi. Residu diambil
oresis n g of the a derivatization
e tant
(Confirma aallbbumi
e
s GC-MS: m/z menjadi 1 ml buffer sitrat (pH = 6,3) dan dipindahkan ke
tion of inn m 239 and m/z botol Eppendorf (2 ml). Langkah-langkah persiapan
l
ppuuriitty fraaccttiio a 236
l lebih lanjut untuk pembentukan turunan-turunan
y) onn liinn (Precursor-
ethanol
l enrichment) fenilalanin dari fenilalanin dari fenilalanin hidrolisat
e yang diukur dengan GC-MS dijelaskan secara rinci oleh
e Dänicke et al. (2001).
t

2.2.2 Elektroforesis
Asam
pengend Natrium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elec
apan
album trophoresis (SDS-PAGE, 10%) dilakukan untuk
in mengkonfirmasi kemurnian fraksi albumin yang diisolasi
dari plasma (lihat Bagian 2.2.1). Sebuah penanda berat
perkoklorat molekul yang luas (M4038, Sigma-Chemie,
-PPeelllleet Deisenhofen, Jerman) dan albumin babi (A1173, Sigma-
HCl-hidrolisis, dekarboksilasi ,
derivatisasi, GC-MS: m / z 183 Chemie, Deisenhofen, Jerman) digunakan sebagai
dan m / z 180 standar. SDS-PAGE dibentuk dengan menggunakan
(Pengayaan →
albumin) Mini-Protean sel elektroforesis (Bio-Rad Laboratories,
Gambar 1:
München, Jerman) menurut sistem bufer Laemmli
Diagram alur persiapan plasma untuk pengukuran tingkat sintesis seperti yang dijelaskan oleh turer pabrikan.
albumin
2.2.3 Persiapan fenilalanin bebas plasma untuk GC-MS-
2.2.1 Isolasi albumin dari plasma dan persiapan analisis
fenilalanin terikat albumin untuk GC- Analisis MS
Supernatan dikumpulkan dari TCA-pengendapan
Isolasi albumin dari plasma didasarkan pada solu bility plasma (lihat Bagian 2.2.1), mengandung asam amino
dalam etanol dan dilakukan sesuai dengan prinsip-prinsip bebas, dicairkan dan dimuat ke 1,2 ml AG- 50W-X8
yang diuraikan oleh Korner dan Debro (1956). Secara +
resin penukar kation (H bentuk, 100 - 200 mesh, Bio-
singkat, 10 ml asam trichloroacetic es dingin (TCA, 12%) Rad Laboratories, München, Jerman) dan dicuci dengan
dan 3 manik-manik kaca ditambahkan ke 1 ml plasma, 4 ml air suling. Asam amino dielusi dengan 2 ml 2 M
secara menyeluruh vor tex dicampur dan dibiarkan di atas NH4OH diikuti oleh 1 ml air suling. Eluat dikeringkan di
es selama 10 menit. Sampel kemudian dicampur lagi dan bawah aliran nitrogen pada 40 ° C dan kemudian
disentrifugasi pada 4 ° C dan 3500 rpm selama 20 menit. diturunkan untuk menghasilkan turunan t-BDMS-
Supernatan dikumpulkan dan disimpan beku sampai fenilalanin menurut Calder dan Smith (1988).
disiapkan lebih lanjut untuk GC-MS-analisis pengayaan
fenilalanin bebas plasma (lihat Bagian 2.2.3). Pellet dicuci 2.2.4 GC-MS dari t-BDMS-phenylethylamine
dengan 10 ml TCA (12%) dan disentrifugasi pada 4 ° C (pengayaan albumin) dan t-BDMS-phenylalanine
dan 4000 rpm selama 20 menit. Supernatan disingkirkan (pengayaan pool gratis)
dan pelet dihomogenisasi menjadi pasta kental yang
ditambahkan 10 ml etanol absolut. Mix ture ditinggalkan Kedua derivatif diukur pada instrumen GC-MS yang
pada suhu kamar dengan satu campuran pusaran sama yang terdiri dari autosampler A200S (CE
menengah. Sampel kemudian disentrifugasi pada suhu Instruments) GC 8000 (Fisons Instrumen) dan
kamar dan 4000 rpm selama 20 menit. Tiga ml supernatan spektrometer massa quadrupole MD 800 (Fisons Instru
yang mengandung albu-min dikumpulkan dan disimpan ments).
beku untuk elektroforesis sedangkan sisa 7 ml diuapkan Sistem ini dikalibrasi untuk pengukuran pengayaan
sampai kering pada 40 ° C menggunakan aliran nitrogen rendah fenilalanin yang terikat albumin dalam kisaran
yang lembut. Residu kering dilarutkan kembali dalam 7 antara 0,01 dan 1,0 MPE. Konversi fenilala sembilan
ml 0,3n natrium hidroksida (NaOH) dan diinkubasi dalam menjadi phenylethylamine sebelum derivatisasi
bak air pada 37 ° C selama 20 menit. Dua ml asam ditunjukkan untuk meningkatkan sensitivitas GC-MS
perklorat dingin (PCA, 20%) ditambahkan dan dicampur untuk mengukur dari pengayaan yang sangat rendah dari
dengan sampel, dan dibiarkan di atas es selama 5 menit. pro tein yang baru disintesis (Calder et al., 1992; Slater
Campuran disentrifugasi pada suhu kamar dan 3500 rpm dkk., 1995; Dänicke et al. ., 2001). Area puncak pada m /
selama 20 menit. Natant super dibuang dan pelet dicuci z 183 dan m / z 180 dari contoh dan standar dicatat
dua kali dengan menggunakan 6 ml PCA dingin (2%) dan dalamion yang dipilih di
sentrifugasi seperti dijelaskan di atas. Pelet akhir
direndam dengan 0,5 ml 0,3n NaOH dan kemudian
dihidrolisis dengan 6 ml asam hidroklorat 4n (HCl) pada
110 ° C dalam oven pengeringan selama 18 jam. Tiga ml
hidrolisat diambil untuk dikeringkan
 PA

mode perekamanbawah kondisi ionisasi elektron dan

Experiment 1:
kemudian digunakan untuk analisis rasio isotop. Hubungan
kapal antara MPE dihitung dari phenylalanine stan dards
MPEalbumin = (ts· b + a) · (t≤ ts) + (a + b · t) · (t> ts) (2) di
(0,01 - 1 MPE) dan rasio antara daerah puncak di m / z 183
2
dan m / z 180 sangat linier (r ~ 0,99). Rincian lebih lanjut mana MPEalbumin = albumin-terikat fenilalanin MPE; t
tentang pengukuran dan menjalankan instrumen diberikan = waktu (mnt); ts = waktu sekresi albumin (menit); b =
oleh Dänicke dkk. (2001). slope (MPE / menit), a = intercept on ordinate (MPE).
Pengukuran pengayaan fenilalanin bebas-plasma tidak
memerlukan langkah pra-derivatisasi karena pengayaannya Percobaan 2:
yang secara substansial lebih tinggi dibandingkan dengan
fenilalanin yang terikat albumin memungkinkan suatu MPEalbumin = a + b · t (3) di
perlakuan sampel yang fleksibel yang menyediakan
pemantauan rasio isotop yang handal. Rasio antara area mana singkatan seperti dalam persamaan 2. Waktu
puncak pada m / z 239 dan m / z 234 digunakan untuk penutupan albumin (ts) diperkirakan dari ekstrapolasi
perhitungan MPE dari fenilalanin bebas plasma sesuai intercept pada sumbu x ketika MPEalbumin = 0 sebagai:
dengan persamaan dengan Campbell
(1974 ). Kondisi GC dan MS serupa dengan yang a
dijelaskan oleh Slater et al. (1995). Pada instrumen kami, t =- (4)
hubungan antara MPE yang dihitung dari sembilan standar s
fenilala (1-30 MPE) dan rasio antara area puncak pada m / z b
239 dan m / z 234 adalah sangat linier (r² ~ 0,99).
Pengetahuan tentang ts sangat penting untuk
2.2.5 Konsentrasi Albumin Konsentrasi penugasan yang benar dari daerah di bawah kurva
pengayaan prekursor (A) yang dihitung berdasarkan
Albumin ditentukan dengan metode bromocresol green di regresi linier waktu setelah infus pada MPE fenilalanin
semua sampel plasma. bebas plasma , dikoreksi untuk ts seperti yang
diperkirakan oleh persamaan (2) dan (4), masing-
2.3 Perhitungan dan statistik masing:

Laju sintesis albumin fraksional (FSR) dihitung dari rasio MPEbebas = a + b · t (5)
antara peningkatan linear dalam waktu yang berkaitan
dengan pengayaan albumin dan daerah yang sesuai di di mana MPEbebas = plasma bebas fenilalanin MPE; t =
bawah kurva waktu MPE dari prekursor (fenilalanin bebas waktu (mnt); b = slope (MPE / menit), a = intercept on
plasma) menurut Ballmer et. Al. (1990): ordinate (MPE). Koefisien regresi digunakan untuk
memperkirakan MPEgratis pada waktu t1 dan t2 sebagai
prasyarat untuk estimasi "A" yang diperlukan dalam
perhitungan FSR sesuai dengan persamaan (1):
MPE (t ) - MPE
FSR = albumin 2 albumin A = (MPEgratis(t 2 - ts) + MPEgratis(t1 - (6)
(t ) ts)) ⋅ pada
1 ⋅100
2
(1) mana singkatan seperti pada
A di persamaan (1) dan (5).
mana FSR = laju sintesis albumin
pecahan (% / d), yaitu persentase
massa albumin intravaskular yang
setiap hari baru disintesis; MPEalbumin (t1)dan MPEalbumin Tingkat sintesis mutlak albumin (ASR) diperkirakan
(t2)= pengayaan fenilalanin albumin terikat pada waktu t 1 atas dasar FSR dikalikan dengan massa albumin
dan t2 (min), masing-masing; A = area di bawah kurva intravaskuler, yang, pada gilirannya, adalah ed calculat
pengayaan pre-kursor (MPE ⋅ min). dari konsentrasi albumin diukur dalam plasma
MPE (t1)dan MPEalbumin (t2) diperkirakan dikalikan dengan perkiraan volume
albumin
plasma:
dari regresi linier waktu setelah infus pada pengayaan waktu pengumpulan plasma yang berbeda.
fenilalanin yang terikat albumin. Dua model regresi linier
digunakan dalam mengevaluasi data dari Eksperimen 1 dan
2 karena fakta bahwa label muncul dalam darah setelah jeda
waktu tertentu yang dikenal sebagai waktu sekresi albumin
(misalnya, Ballmer et al., 1990), yaitu, waktu yang
diperlukan untuk sintesis dan pengolahan albumin di hati
dan rilis selanjutnya dalam sirkulasi darah, dan karena
ASR = VP ⋅ AC ⋅ FSR / 100 (7) di plasma albu min (g / l).
S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung
HasilVölkenrode 4/2005
dari kedua (55):245-253
percobaan dibandingkan dengan t-
mana ASR = fraksional tingkat sintesis albumin absolut test. Semua statistik dilakukan menggunakan Satistica PA
(g / d); VP = volume plasma (l) = 1,06 + 0,037 ⋅ berat TM
untukWindows sistem operasi(StatSoft, 1984).
badan (kg) (Yang dan Lin, 1997) dan AC = konsentrasi
PA

3 Hasil dan diskusi

er asam amino dalam semua prekursor sintesis protein
yang mungkin, seperti plasma asam amino bebas-bebas,
Untuk pengetahuan penulis, tidak ada laporan dalam intra-intersellular-free dan tRNA-terikat, lebih berhasil
literatur tentang pengukuran sintesis albumin pada babi dalam percobaan kedua. Namun, validitas asumsi bahwa
dengan teknik flooding. Dengan demikian, percobaan pengkayaan fenilalanin bebas plasma dapat dilihat
proto col dan dosis asam amino pelacak untuk percobaan sebagai indikator untuk pengkayaan fenilalanin bebas
pertama diadopsi dari penelitian pada manusia (Ballmer et hati, yang merupakan prekursor utama untuk sintesis
al., 1990, 1996; Slater et al., 1995). Dalam penelitian ini, albumin, tidak dapat sepenuhnya dideduksi dari
penurunan pengayaan isotop dari asam amino bebas perubahan pengayaan. dalam fenilalanin bebas plasma.
plasma selama periode 60 menit setelah pemberian isotop Untuk memperkuat asumsi ini akan diperlukan untuk
berjumlah sekitar 67, 77 dan 79% ketika substraksi diberi mengikuti kursus pengayaan waktu dalam fenilalanin
dosis 57 mg leusin, 56 mg fenilalanin atau 43 mg bebas hati, yang akan membutuhkan pembusukan
fenilalanin, masing-masing, per kg berat badan. Meskipun komparatif terkait waktu sejumlah babi untuk
dosis yang sebanding dari 45 mg fenilalanin per kg mendapatkan sampel hati. Pendekatan semacam itu diuji
digunakan dalam penelitian babi saat ini (Percobaan 1), oleh Bregendahl et al. (2004) yang menyuntikkan babi
pengayaan isotop dari fenilalanin bebas plasma menurun 2
secara intraperitoneal dengan 250 mg [ H5] fenilalanin
menjadi 46% dari nilai awal setelah periode waktu yang per kg berat badan. Pengayaan fenilala sembilan hati-
sama (Tabel 1, Gambar 2). . Peningkatan dosis infus bebas sembilan menurun sekitar 0, 9, 6, 17 dan 6%
hingga 125 mg / kg berat badan dalam Percobaan 2 terkait dengan pengayaan isotopik bebas plasma fenilala
menghasilkan proporsi yang jauh lebih tinggi dari sembilan ketika diukur setelah 15, 30, 45, 60 dan 75
pengayaan isotopik dari kolam prekursor sebesar 86% menit, masing-masing. Dänicke dkk. (2005) melaporkan
setelah 60 menit dibandingkan dengan pengayaan propor ini menjadi 28% ketika protokol yang sama
ekstrapolasi pada waktu nol (Tabel 1, Gambar 3). ure 3). digunakan sebagai dalam Percobaan 2 dari penelitian ini.
Dengan demikian, banjir dari kolam prekursor, yang Karena pengayaan bebas plasma dikoreksi untuk waktu
berarti elevasi cepat, masif dan seragam dari trac- sekresi albumin (ts) dalam penelitian ini, nilai-nilai
pengayaan akan
Tabel 1:
Perincian eksperimental dan ringkasan hasil dari Eksperimen 1 dan 2

Percobaan Probabilita PSEM

s
1 2

Sex perempuan laki-laki

n 3 4
Pengayaan fenilalanin larutan injeksi (MPE) 11 28
Phenylalanine dose ( mg / kg berat 45 125
badan) Hidup berat (kg) 39,0 37,5 0.470 1,4

Plasma bebas fenilalanin

MPE lereng Linear (MPE / -0,061 -0,054 0,762 0,015
min)
Intercept (MPE) 6,7 22,1 <0,001 1.0
Rasio antara MPE setelah 60 menit dan MPE nol (%) 46,0 86,1 0,001 4,2
Area di bawah kurva (MPE⋅min) 178 635 <0,001 25

Albumin-terikat fenilalanin MPE

Kemiringan linier (MPE / 0,0007 0,003 0,004 0,000
menit) 5 4
Intercept (MPE) -0,009 -0,099 0,002 0,011
Waktu sekresi albumin (min) 13 28 0,005 2
Sintesis albumin fraksional rate (% / 23,0 24,2 0,776 2,8
d) Albumin konsentrasi (g / l) 20,4 32,5 0,006 1,8
1 2,50 2,45 0,470 0,05
Volume plasma (l) Massa
albumin intravaskuler (g) 51,0 79,4 0,005 4,2
Sintesis albumin absolut (g / d) 11,8 19,2 0,076 2,3
Sintesis albumin absolut (mg / kg berat badan per hari) 306 508 0,057 58
2 2,6 4,3 0,057 0,5
Sintesis albumin absolut (% total sintesis protein tubuh)
Singkatan: MPE - kelebihan molar%, PSEM - kesalahan standar gabungan dari rata-rata
1
Volume plasma (l ) = 1,06 + 0,037⋅berat badan (kg) (Yang et al., 1997)
2
Asumsi data: Kandungan protein tubuh kosong = 17%, Sintesis protein seluruh tubuh pecahan = 7% / d (Simon, 1989)
 S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
PA

sesuai dengan jendela waktu kira-kira 0 sampai 30 menit

Dengan demikian, pengayaan fenilalanin bebas plasma
setelah infus, di mana pengayaan fenilalanin bebas-hati
dapat dilihat sebagai indikator yang dapat diandalkan
hampir sama dengan fenilalanin bebas-plasma.
untuk sintesis albumin.
Kemurnian albumin yang diisolasi dari plasma
sangat penting untuk pengukuran yang andal dari
pengayaannya karena kontaminasi fraksi ini dengan
fenilalanin bebas plasma yang sangat diperkaya atau
dengan protein lain dari fraksi plasma precipitable yang
berbeda dalam pengayaan dapat menghasilkan isotop
perselingkuhan. Kontaminasi dengan fenol lalanin
bebas-plasma yang sangat diperkaya dihindari dengan
pencucian berulang dari pelet selama persiapan sampel
(Bagian 2.2.1). Itu jelas ditunjukkan oleh Slater et al.
(1995) bahwa fenilala sembilan bebas sepenuhnya
dihapus dari fraksi albumin setelah pencucian ketiga.
Dalam penelitian ini, pel pel albumin juga dicuci tiga
kali. Bersama-sama dengan dua pencucian awal dari
fraksi yangTCA (protein plasma total) kontaminasi
fraksi albumin dengan

Ph dapat000..55500 Fre
hee e
Pig6 22
eny phe
20
lala nyl
18
nnii ala
16
inn 14 nin
eee 12 e
enri 10 enri
ch 8 ch
me 6 me
nt 4 nt
diekresi000..44455 in
in 2
000 ..44400 alb pla
000..33355 sm
000..33300 a
(M
000..22255
PE)
000..22200
Fre
000..11155 e
000..11100 pph
000..00055 hee
000..00000 0 nny
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 ylla
TTTTiiimmmeee (( mmmiiiiinnnn)) alla
0,50
Ph 24
Pigs 4, 5, 7 ann
0,45
eny 22
iinn
20
0,40
lala ee
nin 18
0,35 enr
e 16
0,30
enri 14
0,25
ch 12
10
me
0,20
nt0,15 8
in 6
0,10
alb 4
umi
0,05 2
n0,00 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Waktu (min)
Gambar 2: dan bebas plasma dari masing-masing babi percobaan 1.
Waktu kursus kelebihan molar% (MPE) ) dalam fenilalanin bebas albumin
Gambar 3: Waktu kursus kelebihan molar% (MPE) dalam fenilalanin bebas
albumin dan bebas plasma dari individu babi percobaan 2.
PA MPE di fenilalanin albumin-terikat = (ts · b + a) · (t ≤ ts) + 6
7
4
5 MPE dalam fenilalanin terikat albumin = a + b · t,

(a + b · t) · (t> ts), di mana t = waktu (min), ts = waktu sekresi albumin

(menit), a = intercept pada ordinat dan b = kemiringan MPE pada mana t = waktu (menit), a = memotong pada ordinat , b = kemiringan
fenilalanin yang terikat albumin. MPE dalam albu min-bound phenylalanine, ts = waktu sekresi
MPE dalam fenilalanin bebas-plasma = a - b · t, di mana t = albumin (min) = -a / b.
waktu (menit), a = memotong pada ordinat, b = kemiringan MPE dalam
6 4
fenol bebas-plasma di 7 5 MPE dalam fenilalanin bebas plasma = a - b · t, di mana
lalanin. t = waktu (menit), a = intercept pada ordinat, b = kemiringan MPE
dalamplasma
fenilalanin bebas.
 S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
PA

Berdasarkan pengalaman dengan Babi 1, 2 dan 3

(Pengalaman 1, 45 mg fenilalanin per kg berat badan),
dan dengan Babi 6 (Percobaan 2, 125 mg fenilalanin per
kg berat badan) menjadi jelas bahwa itu tidak akan
diperlukan untuk menganalisis sampel darah begitu
sering. Hanya tiga titik pengukuran yang diperlukan
dalam kisaran peningkatan linear dalam pengayaan
albumin. Hal ini juga cukup untuk menganalisis
pengayaan phenylalanine bebas plasma yang sesuai
dalam slot waktu ini, karena penurunannya linear selama
hingga 90 menit (Gambar 2 dan 3). Keuntungan lebih
lanjut dari prosedur tersebut adalah bahwa analisis
pengayaan yang sangat rendah dalam albumin pada
kelimpahan alami, biasanya terjadi pada waktu dekat
atau lebih rendah dari waktu sekresi albumin dapat
dihindari. Tidak perlu memperkirakan waktu sekuritas ini
dengan regresi garis putus (Persamaan 2) tetapi hanya
dengan mengekstrapolasi peningkatan linear dalam
Gambar 4: pengayaan albumin ke nol pengayaan (Persamaan 4).
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elektroforesis (SDS 10%) Untuk pengetahuan penulis, ini adalah laporan pertama
dari albumin terisolasi dari babi 2 (Percobaan 1) dibandingkan dengan tentang waktu sekresi albumin babi yang bervariasi
standar berat molekul dan dengan standar albumin babi (1 - standar berat
antara 6 dan 28 menit. Waktu sekresi rata-rata yang
molekul, 1,1-bovine serum albumin (MW: 66000), 2 - Albu-min-babi 2
(pengenceran 1), 3 - Albumin-babi 2 (pengenceran 2), 4 - Albumin-babi dilaporkan adalah 15 menit untuk tikus (Peters, 1962)
2 dan bervariasi antara 27 dan 37 menit pada manusia
(pengenceran 3), 5 - Standar albumin Porcine (MW: 68000 , 1 μg), 6 - (Ballmer et al., 1990; Hunter et al., 1995; Slater et al.,
Standar albumin Porcine (2 µg), 1995). Dalam penelitian ini, waktu sekresi albumin
secara signifikan lebih pendek dalam Percobaan 1 (Tabel
fenilalanin bebas dapat dikecualikan. Kemungkinan 1, 6
kontaminasi fraksi albumin dengan protein lain diperiksa - 19 menit) daripada di Percobaan 2 (27 - 28 menit),
dengan elektroforesis (Gambar 4) .Tidak ada kontaminasi tetapi perbedaan ini tidak disebabkan oleh pendekatan
fraksi albumin yang terisolasi ( Lanes 2 - 4) dengan yang berbeda yang digunakan. untuk memperkirakan
protein lain dapat dideteksi, waktu ini (Persamaan 2 vs 4), karena intercept pada
penggabungan isotop ditemukan sangat kuat pada sumbu x secara eksklusif ditentukan oleh kemiringan
kedua percobaan dari saat ketika label muncul di plasma linier dalam pengayaan isotop di kedua percobaan.
(Gambar 2 dan 3), terlepas dari fakta bahwa banjir di Alasan biologis untuk waktu sekresi albumin yang lebih
percobaan pertama adalah marjinal.Lereng dari bagian pendek tidak dapat diberikan saat ini, tetapi harus
linier dari regresi adalah signifikan Sangat berbeda karena dipertimbangkan bahwa hewan dari kedua eksperimen
fakta bahwa larutan infus yang digunakan dalam berbeda tidak hanya dalam seks tetapi juga di latar
Percobaan 1 secara substansial kurang diperkaya daripada belakang genetik mereka. Aspek-aspek ini juga perlu
di Percobaan 2 (Tabel 1). Pengayaan yang lebih tinggi dipertimbangkan ketika menafsirkan konsentrasi albumin
dalam Percobaan 2 dipilih untuk menginduksi pengayaan yang lebih rendah dari babi betina yang digunakan dalam
yang lebih tinggi dalam albumin untuk memfasilitasi Percobaan 1 (Tabel 1). Albumin con-
pengukuran GC-MS. Pengayaan albumin yang lebih
rendah dalam Eksperimen 1, terutama segera setelah
infus, dekat dengan sensitivitas instrumen GC-MS yang
digunakan, dan mungkin telah berkontribusi terhadap
beberapa variasi (lihat Babi 3, Gambar 2). Albumin FSRs
akhirnya dihitung tidak berbeda secara signifikan antara
kedua percobaan meskipun perbedaan substansial dalam
protokol eksperimental, mendukung pandangan bahwa
banjir dari kolam prekursor berhasil bahkan dalam
Percobaan
1. Albumin FSR bervariasi antara 20 dan 27% / d dalam
Experi iment 1, dan antara 16 dan 30% / d dalam
Percobaan 2, masing-masing, dan cocok dengan baik ke
dalam kisaran 10 dan 40% / d seperti yang diperkirakan
oleh teknik infus kontinyu (Jahoor et al., 1994, 1999;
Mackenzie et al. ., 2003).
PA
S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
PA
PA
S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
PA
PA
S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
PA
PA
S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
PA
PA
S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
PA
PA
 28
S. Dänicke, E. Swiech, T. Goyarts and L. Buraczewska / Landbauforschung Völkenrode 4/2005 (55):245-253
Pla24 PA
sm
a 20
alb
umi16
n
12
con
cen 8
trat
ion 4
(g/l
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Waktu (min)
Gambar 5:
Kursus waktu konsentrasi albumin plasma individu babi percobaan 1.
1 2 3
 PA

centrations tidak berubah selama eksperimental peri od

Acknowledgements
karena prosedur dan manipulasi (Gambar 5, Percobaan 1)
dan estimasi tingkat absolut albumin synthe sis (ASR)
The assistance of the co-workers of the Kielanowski
karena itu berdasarkan konsentrasi albumin rata-rata.
Institute of Animal Physiology and Nutrition, Jablonna,
Karena FSR albumin tidak berbeda secara signifikan
Poland, and of the Institute of Animal Nutrition of the
antara kedua percobaan, perkiraan albu min ASR yang
Federal Agricultural Research Centre (FAL), Braun
diperkirakan lebih rendah untuk Eksperimen 1 menurut
schweig, Germany, in performing the experiments is
persamaan (7) adalah hasil dari konsentrasi plasma-albumin
gratefully acknowledged. We thank Nicola Grove for
yang lebih rendah (Tabel 1). Albumin ASR bervariasi antara
technical assistance in performing the GC-MS analysis.
236 dan 405 mg / kg berat badan dalam Percobaan 1, dan
antara 347 dan 624 mg / kg berat badan di Eksperimen 2, References
masing-masing. Nilai masing-masing untuk manusia
berkisar antara 120 dan 230 mg / kg berat badan (Ballmer et Ballmer PE, McNurlan A, Essen P, Anderson SE, Garlick PJ (1995a)
al., 1990) dan untuk babi antara 60 dan 600 mg / kg berat 2
Albumin synthesis rates measured with [ H5ring]phenylalanine
badan, tergantung pada faktor eksperimental yang diperiksa are not responsive to short-term intravenous nutrients in healthy
(Jahoor et al., 1999; Mackenzie et al., 2003). Dengan humans.
J Nutr 125: 512-519
demikian, nilai-nilai yang diperoleh dalam penelitian ini
Ballmer PE, McNurlan MA, Hunter HN, Anderson SE, Garlick PJ,
dengan menggunakan teknik dosis banjir memberikan nilai- Krapf R (1995b) Chronic metabolic acidosis decreases albumin
nilai yang berhubungan dengan baik dengan yang diperoleh synthesis and induces negative nitrogen balance in humans. J Clin
dengan teknik infus konstan. Invest 95: 39 45
Parameter lain yang menarik adalah proporsi sintesis Ballmer PE, McNurlan MA, Milne E, Heys SD, Buchan V, Galder
AG, Garlick PJ (1990) Measurement of albumin synthesis in
albumin ke seluruh sintesis protein tubuh babi. Ini
humans: a new approach employing stable isotopes. Am J Physiol
diperkirakan berdasarkan asumsi bahwa seluruh babi dari 259: E797 E803
berat badan yang diberikan mengandung sekitar 170 g Ballmer PE, Reichen J, McNurlan MA, Sterchi AB, Anderson SE,
protein / kg berat badan, yang disintesis setiap hari pada Gar lick PJ (1996) Albumin but not fibrinogen synthesis correlates
tingkat 7% (Simon 1989). Proporsi sintesis albumin yang with galactose elimination capacity in patients with cirrhosis of the
liver. Hepatology 24: 53-59
diperkirakan berasal dari sintesis protein seluruh tubuh
Bregendahl K, Liu L, Cant JP, Bayley HS, McBridge BW, Milligan
bervariasi antara 2 dan 5%. Karena sintesis protein adalah LP, Yen JT, Fan MZ (2004) Fractional protein synthesis rates
proses mengkonsumsi energi yang tinggi, perubahan yang measured by an intraperitoneal injection of a flooding dose of L-
2
dipengaruhi secara fisiologis atau nutrisi dalam tingkat [ring- H5]pheny-
sintesis albumin dapat berdampak pada perputaran seluruh lalanine in pigs. J Nutr 134(10): 2722-2728
tubuh protein dan metabolisme energi. Calder AG, Anderson SE, Grant I, McNurlan MA, Garlick PJ (1992)
The determination of low d5-phenylalanin enrichment (0.002-0.09
Atom percent excess), after conversion to phenylethylalamine, in
4 Kesimpulan relation to protein turnover studies by gas
chromatography/electron ionization mass spectrometry. Rapid
2 Commun Mass Sp 6: 421-424
Teknik dosis flooding menggunakan [ H5] fenilalanin
Calder AG, Smith A (1988) Stable istope ratio analysis of leucine and
sebagai asam amino pelacak isotop stabil cocok untuk ketoisocaproic acid in blood plasma by gas chromatography/mass
mengukur sintesis albumin babi. A dose of at least 125 mg spectrometry. Use of tertiary butyldimethylsilyl derivatives. Rapid
phenylalanine/kg body weight is recommended to ensure Commun Mass Sp 2: 14-16
that flooding of all possible albumin synthesis pre cursor Campbell IM (1974) Incorporation and dilution values- their
pools occurs. The enrichment of the infusion solu tion calculation in mass spectrally assayed stable isotope labeling
experiments. Bioorg Chem 3: 386-397
should be at least 11 molar % excess, but preferen tially Dänicke S, Goyarts T, Döll S, Grove N, Spolders M (2005) Effects of
higher to ensure a good performance of the GC-MS. the Fusarium toxin deoxynivalenol on tissue protein synthesis in
Biologically, further experiments should examine the pigs. submitted
effects of breed, age, sex and varying nutritional condi tions Dänicke S, Schippel K, Halle I (2001) Determination of in vitro
on albumin synthesis of the pig more specifically. protein synthesis of chick livers using GC-MS analysis of
2
[ H5]phenylala- nine. Landbauforsch Völkenrode 51: 101-108
Garlick PJ, McNurlan MA, Essen P, Wernermann J (1994)
Measurement of tissue protein synthesis rates in vivo: a critical
analysis of contrast ing methods. Am J Physiol 266: E287-E297
Hunter KA, Ballmer PE, Anderson SE, Broom J, Garlick PJ,
McNurlan MA (1995) Acute stimulation of albumin synthesis rate
with oral meal feeding in healthy subjects measured with [ring-
2
H5] phenylalanine.
Clin Sci 88: 235-242
Hunter KA, Garlick PJ, Broom I, Anderson SE, McNurlan MA
(2001) Effects of smoking and abstention from smoking on
fibrinogen syn thesis in humans. Clin Sci 100(4): 459-465
Jahoor F, Burrin DG, Reeds PJ, Frazer M (1994) Measurement of
plas ma protein synthesis rate in infant pig: an investigation of
alternative tracer approaches. Am J Physiol 267: R221-R227
Jahoor F, Wykes L, Del Rosario M, Frazer M, Reeds PJ (1999) Chronic
protein undernutrition and an acute inflammatory stimulus elicit dif
ferent protein kinetic responses in plasma but not in muscle of
piglets. J Nutr 129(3): 693-699
Korner A, Debro JR (1956) Solubility of albumin in alcohol after pre
cipitation by trichloroacetic acid: a simplified procedure for separa
tion of albumin (Abstract). Nature (London) 178: 1067
Mackenzie ML, Warren MR, Wykes LJ (2003) Colitis increases
albumin synthesis at the expense of muscle protein synthesis in
macronutrient restricted piglets. J Nutr 133(6): 1875-1881
McNurlan MA, Sandgren A, Hunter K, Essen P, Garlick PJ, Wernerman
J (1996) Protein synthesis rates of skeletal muscle, lymphocytes, and
albumin with stress hormone infusion in healthy man. Metabolism
45: 1388-1394
Peters T (1962) Biosynthesis of rat serum albumin. 2. Intracellular phe
nomena in secretion of newly formed albumin. J Biol Chem 237(4):
1186-1189
Simon O (1989) Metabolism of proteins and amino acids. In: Bock H–
D, Eggum BO, Low AG, Simon O: Protein metabolism in farm
animals, Oxford Science Publications und Deutscher
Landwirtschaftsverlag Berlin : 273-365
Slater C, Preston T, McMillan DC, Falconer JS, Fearon KCH (1995)
2
GC/MS analysis of ( H5)phenylalanine at very low enrichment: meas
urement of protein synthesis in health and disease. J MassSpectr 30:
1325-1332
StatSoft (1984) Inc., Tulsa, OK, 1984-1995: Statistica for the Win
TM
dows operating system. Version 7 1
Yang TS, Lin JH (1997) Variation of heart size and its correlation with
growth performance and vascular space in domestic pigs. Anim Sci
64: 523-528