Replicacin del DNA La conservacin del genoma en cada especie esta dado por el alto grado de fidelidad del

proceso de replicacin del DNA. Este proceso asegura que a partir de una molcula de DNA se obtengan dos molculas hijas con idntica secuencia, asegurando de esta manera, el paso de la informacin gentica de una clula a otra. Veamos algunas caractersticas generales de la replicacin:

La replicacin del DNA es semiconservativa: En el estudio de la estructura del DNA, Watson y Crick intuyeron, dada la especificidad de apareamiento de bases, un posible mecanismo de reproduccin del material gentico donde una de las hebras podra servir como molde para la sntesis de la hebra complementaria.

El DNA se replica de manera ordenada y secuencial: La replicacin se inicia en puntos fijos del cromosoma y transcurre de forma bidireccional (Fig. 2). El crecimiento de la cadena de DNA se produce de manera simultnea al desenrollamiento de las hebras de la doble hlice parental. Ocurre en direccin 5---3, o sea, la nueva cadena se extiende por adicin de nucletidos, (utilizando como sustratos activados los desoxirribonucletidos 5trifosfatos (dNTP)) al extremo 3OH en dependencia del nucletido correspondiente segn el apareamiento de bases con la cadena molde (Fig.3).

La replicacin es un proceso controlado: Las clulas antes de dividirse deben duplicar su genoma, por lo que el proceso de replicacin debe estar controlado y acoplado a la divisin celular asegurando que el material gentico se replique solo una vez durante el ciclo celular. El control de la replicacin se efecta a dos niveles: En la iniciacin donde el DNA se replica en un momento determinado. En el bloqueo de la reiniciacin lo que impide que una vez iniciada una ronda de replicacin no comience otra.

La replicacin ocurre de manera semidiscontnua: Debido a que la sntesis de las nuevas cadenas de DNA ocurre en direccin 5--- 3 y a que se disponen de manera antiparalela la sntesis de una de las cadenas ha de ser discontinua (por fragmentos). A la cadena que se sintetiza en el sentido del avance de la horquilla de replicacin se denomina cadena lder (en direccin 5--- 3). Aquella que es sintetizada por fragmentos, en sentido contrario al avance de la horquilla se nombra cadena retardada. Estos fragmentos se denominan fragmentos de Okazaki, en honor al investigador que demostr la existencia de los
mismos (Fig.4).

Etapas de la replicacin Iniciacin: involucra el reconocimiento del origen de replicacin para un complejo de protenas. En el origen de replicacin tienen lugar varios eventos. Antes que la sntesis del DNA comience las cadenas parentales deben separarse y estabilizarse transientemente en un estado de simple cadena. El acto de iniciacin va acompaado por un complejo de protenas llamado primosoma en E.coli. Alargamiento: en esta etapa se comienza a sintetizar el nuevo DNA tomando como molde las cadenas parentales. Esta es llevada a cabo por otro conjunto de protenas llamado replisoma. Este replisoma no existe como una unidad independiente (como el ribosoma por ejemplo), solo aparece como complejo asociado a la horquilla de replicacin Terminacin: al final del replicn es necesaria una reaccin de unin y/o terminacin. La DNA polimerasa no puede iniciar la sntesis de las nuevas cadenas a partir de nucletidos libres. Esta enzima requiere de un cebador (en ingles, primer) que provea el extremo 3` OH libre que pueda ser extendido por adicin de nucletidos.

Replicacin en procariotas Enzimas que participan en la iniciacin La doble cadena debe ser preparada en una estructura apropiada para que la replicacin tenga lugar. Debido a que la sntesis ocurre utilizando cada hebra del DNA como molde, estas deben ser separadas y estabilizadas en estados transcientes de simple cadena. Dos protenas estn relacionadas con estas funciones, la Dna B y la SSB. Estas protenas adems de participar en la iniciacin son requeridas tambin en el alargamiento. DnaB: esta protena es presenta una actividad helicasa con polaridad 5 3. Constituye un componente central en el replicn Ori C. Esta provee la actividad helicasa necesaria para desenrollar el DNA. Tambin es responsable de la activacin de otra protena, la DnaG. SSB: esta protena se une al DNA simple cadena para evitar el reensamblaje del duplex y mantenerlo en un estado adecuado para que funja como molde. La unin de esta protena es cooperativa, o sea, la unin de una molcula favorece la unin de las siguientes. Esta adems de estabilizar la estructura protege al DNA de simple cadena del ataque de nucleasas. Dna C: acta conjuntamente con la Dna B. Dna G: esta protena provee la actividad primasa requerida para la sntesis del cebador. Es una RNA polimerasa que sintetiza cortos segmentos de RNA. Esta enzima se une de manera transiente al primosoma y es activada por la DnaB para iniciar la sntesis del primer. Dna A: en presencia de ATP esta protena separa las hebras de la doble hlice. RNA polimerasa: acta conjuntamente con la DnaA en la separacin de las cadenas para la formacin de la horquilla de replicacin. Un evento de trascripcin llevado a cabo por esta enzima puede entonces influir en la topologa local del DNA ayudando a la separacin de las cadenas en la iniciacin. Girasa: libera estrs torcional generada por el desenrollamiento del DNA al introducir superenrollamientos negativos.

Protenas implicadas en el alargamiento DNA polimerasa: esta es la enzima protagonista del evento de replicacin. Sintetiza una nueva cadena de DNA a partir de la hebra molde. Esta protena, tanto en procariotas como en eucariotas, presenta una actividad enzimtica mltiple. La DNA polimerasa que realmente lleva a cabo el proceso de replicacin es tambin llamada replicasa. Las otras actividades estn involucradas en eventos auxiliares de la replicacin y/o en eventos de reparacin del DNA. DNA polimerasa I: monmero de 109 kDa. Participa en la alargamiento de la cadena en direccin 5--- 3. Tiene actividad exonucleasa 5--- 3 (escinde ~ 10 bp) y exonucleasa 3 5, esta ultima involucrada en eventos de reparacin y juega un papel secundario en la replicacin.

DNA polimerasa II: monmero de 90 kDa. Tiene una actividad polimerasa 5 3y exonucleasa 3 5. Esta involucrada en la reparacin del DNA. Esta enzima es requerida para reiniciar el proceso de replicacin cuando la burbuja de replicacin se ha detenido por daos en el DNA.

DNA polimerasa III: Replicasa encargada de elongar las nuevas cadenas en direccin 5 3. Esta holoenzima o protena multimrica de 900 kDa esta formada por 10 subunidades organizadas en 4 subcomplejos que se muestran en la Tabla 1 DNA polimerasa IV y V: estas enzimas estan involucradas en permitir la replicacin por desvios de algunos tipos de daos en el DNA. DNA ligasa: esta enzima realiza un enlace covalente entre un extremo 3OH y un 5 fosfato adyacentes donde exista una mella en la doble cadena de DNA. Es por tanto requerida para unir los fragmentos de Okazaki.

Enzimas que participan en la terminacin

Tus: esta protena promueve la detencin de la horquilla de replicacin al proveer una actividad contra-helicasa.

Iniciacin de la replicacin en E. coli.. La replicacin del nico cromosoma de E.coli es bidireccional y se inicia en un nico punto. Este origen de replicacin es llamado Ori C. Tiene una longitud de 245 bp el cual esta compuesto por dos tipos de secuencias consenso: una de 9 bp y otra de 13 bp.

En el extremo derecho de Ori C se localizan cuatro repeticiones de la secuencia de 9 bp y es la que provee el sitio de unin de la DnaA. Esta unin es cooperativa y forman un ncleo central alrededor del cual el DNA se enrolla. El Dna A acta a nivel de las tres repeticiones en tandem de la secuencia de 13 bp, rica en A-T, separando las cadenas en presencia de ATP. Esta separacin puede estar ayudada por la RNA polimerasa la cual puede reconocer una unidad de transcripcin adyacente al origen, este evento de transcripcin puede cambiar la estructura local y asistir as la separacin de las hebras. Entre dos y cuatro monmeros de Dna A se unen al origen y reclutan dos complejos de preiniciacin formado por DnaB-DnaC (uno para cada horquilla de replicacin). Cada complejo DnaB-DnaC esta formado por 6 monmeros de DnaC unido a un hexmero de DnaB. Cada complejo transfiere el hexmero de DnaB a la hebra opuesta mediante la hidrlisis de ATP por la DnaC segn libera DnaB (Fig. 6). La regin donde las cadenas estn separadas en el complejo abierto es lo suficientemente larga para la unin de ambos hexmeros de DnaB y as comience a formarse la horquilla de replicacin. Segn se une el DnaB este desplaza a la DnaA de la secuencia de 13 bp y extiende la longitud de la regin abierta usando su actividad helicasa. Para la sntesis del cebador que luego ser alargado por la polimerasa, es necesaria la presencia de la DnaG la cual se une al DnaB y es activada por este, formndose as el primosoma, conjunto de protenas que dara lugar a la sntesis del cebador.

En la sntesis de los fragmentos de Okazaki no se necesita de un primosoma para cada fragmento. La interaccin peridica de DnaB con DnaG puede ser suficiente para cebar los fragmentos de Okazaki, o sea, que para un replicn OriC el primosoma consiste en un DnaB interactuando peridicamente con la primasa. Alargamiento del cromosoma de E.coli El alargamiento tiene lugar cuando la DNA polimerasa III se incorpora al complejo de iniciacin, formndose el replisoma, ya que esta enzima es la encargada de incorporar nucletidos durante la replicacin del DNA. El mayor problema del proceso de replicacin semidiscontinuo es coordinar la sntesis de ambas cadenas.

Terminacion de la replicacin

Una vez que ha comenzado la replicacin, las dos horquillas de replicacin avanzan en sentidos opuestos y con una misma velocidad, hasta encontrarse en un punto diametralmente opuesto a OriC (de donde partieron) donde se desensambla el complejo de replicacin. Existen adems sitios especficos de terminacin, los llamados sitios Ter que garantizan que ambas horquillas se encuentren si ocurre algn retraso de una con respecto a la otra. En E.coli se han encontrado 6 sitios Ter, secuencias consenso de 23 bp que son reconocidas por la protena Tus (Terminus Utilization Substance). Esta secuencia no es simtrica por lo que la protena se ubica
en determinada orientacin (Fig.9.).

Replicacin en eucariotas A pesar de que el mecanismo de replicacin, hablando en trminos generales, ocurre de manera similar en organismos procariotas y eucariotas, existen algunas diferencias, dada la mayor complejidad y tamao del genoma eucaritico.

Velocidad de alargamiento: En el cromosoma de E.coli la velocidad de alargamiento es de 1000 nt/sg, en eucariotas como levaduras es de aproximadamente 60 nt/sg, en Drosophila de 40 nt/sg y en ratn de 30 nt/sg.
Origen de replicacin: Debido a la existencia de mltiples replicones en el genoma eucaritico existen tantos orgenes como replicones hay. Por ejemplo, en levadura existen 500 replicones, en Drosophila 3500, en ratn 25000 y en plantas 35000. No existen rondas de replicacin solapadas: En E.coli debido al solapamiento de las rondas de replicacin se generaban tiempos de generacin muy cortos. Esto en eucariotas NO ocurre, la divisin celular tiene lugar una vez que el DNA se ha replicado, dicha replicacin tiene lugar durante la fase S del ciclo celular. Los fragmentos de Okazaki son mas cortos. El control es mucho ms complejo. Los cebadores estn compuestos por RNA (aproximadamente 10 bases) y DNA (iDNA, aproximadamente 20-30 bases).

Enzimas involucradas en el proceso

En eucariotas se han encontrado diez clases de polimerasas, algunas participan en la replicacin del DNA (las polimerasas a, d, e nucleares, g mitocondrial) y otras estn involucradas en mecanismos de reparacin del material gentico (polimerasas b, h,i,z y k)
La DNA polimerasa a (llamada I en levadura) es considerada una replicasa, encargada de iniciar la sntesis de las dos nuevas cadenas. Esta enzima existe como complejo asociada a otra subunidad B que parece ser necesaria para el ensamblaje y otras dos protenas pequeas que proveen la actividad primasa. Este complejo es llamado tambin pol a/ primasa. La DNA polimerasa d (III en levadura) esta involucrada en la sntesis de la cadena lder. Esta enzima es altamente procesativa de manera que lleva a cabo la sntesis de la cadena lder de manera continua. Esta procesatividad es consecuencia de la presencia de otras dos protenas, PCNA y RF-C. El papel de RF-C y PCNA son anlogos a los de b y g en E.coli, RF-C posiciona a la abrazadera (PCNA) en el DNA, esta ltima mantiene a la polimerasa d unida al molde aumentando de esta manera la procesatividad.

La DNA polimerasa e esta involucrada en la sntesis de la cadena seguidora. Las hebras de DNA son separadas mediante la accin de dos helicasas de distinta polaridad, una 3---5 y otra 5---3. Los cebadores son removidos mediante la accin de dos enzimas: una endonucleasa, la RNAasaHI (reconoce hbridos DNA-RNA) y la exonucleasa FEN-1.
Una ligasa une covalentemente los fragmentos de Okazaki.

Los telmeros Los cromosomas eucariticos son, como ya se conoce, molculas de DNA lineales, con extremos especializados llamados telmeros, estructuras que confieren estabilidad al cromosoma. Los telomeros estan formados por secuencias repetidas en tandem (una de las cadenas contiene la secuencia Cn(A/T)m donde n>1 y m=1-4, la otra tiene un extremo protuberante en 3Gn(T/A)m).

Todas las polimerasas conocidas extienden la cadena de DNA en direccin 5---3 y para iniciar la sntesis se requiere un cebador. La sntesis de la cadena lder se completa hasta el final, PERO, la cadena discontinua se ira acortando en cada ronda de replicacin debido la discontinuidad de su sntesis. Por todas estas razones, los organismos eucariotas han desarrollado mecanismos para evitar el acortamiento de las cromtidas hijas en cada ciclo celular. La enzima que evita este acortamiento es una transcriptasa reversa modificada llamada telomerasa.
En las clulas germinales la telomerasa esta activa por lo que la longitud del telmero permanece constante en cada divisin celular. En clulas somticas la longitud de los telomeros disminuye y cuando se llega a una longitud mnima la clula entra en crisis y muere. La mayora de las clulas tumorales escapan a esta regulacin, de manera que al tener la telomerasa activa la longitud de los telmeros se mantiene constante. No obstante, cuando es inhibida la actividad de esta enzima, el desarrollo del tumor tiene lugar. La actividad de la telomerasa puede tener un uso prctico como diagnostico precoz de algunos tumores de colon, vejiga y tiroides donde la actividad de esta enzima se puede medir y relacionar con el grado de avance de la enfermedad. Los mecanismos que regulan la actividad de la telomerasa permanecen desconocidos.