KOLORIMETRIJA I

SPEKTROFOTOMETRIJA

Instrumentalna analiza , Profesor Hemije
Dr D. Manojlovi, Hemijski fakultet Beograd
Kolorimetrijskim metodama se odreuju
koncentracije obojenih rastvora koji apsorbuju
u vidljivom ili bliskom UV delu spektra

Boja koju ima rastvor neke supstance
komplementarna je boji koju ta supstanca
apsorbuje

Akva-bakar(II) jon je bledoplave boje, to
znai da apsorbuje u utom delu spektra

U kolorimetriji se uvek radi sa
polihoromatskim zraenjem to iskljuuje
mogunost kvalitativne analize
Da bi se supstanca mogla odrediti
kolorimetrijski mora ispunjavati sledee uslove:

- intenzitet boje mora biti stabilan u duem
vremenskom intervalu

- boja mora biti intenzivna

-apsorpcija zraenja mora da se pokorava
Lambert-Beerovom zakonu


-male promene temeprature, pH i drugih
faktora ne smeju bitno da utiu na intenzitet
boje

Ukoliko je intenzitet neke boje nedovoljan onda
se dodatkom pogodnog reagensa moe prevesti u
intenzivnije obojeno jedinjenje


Reagens u kolorimetriji mora da poseduje
sledee osobine :

-reagens treba da reaguje stehiometrijski sa
ispitivanom supstancom i uvek treba dodati
dovoljnu i istu koliinu reagensa u ispitivane
rastvore i standarde

-reagens ne sme da apsorbuje u vidljivom delu
spektra

-reagens mora biti selektivan u odnosu na
ispitivanu supstancu


-boja nastalog proizvoda mora se brzo razvijati

-reagens ili ispitivana supstanca ne smeju da
stupaju u reakcije sa drugim sastojcima u
rastvoru koji ih mogu prevesti u neaktivne
oblike ili kompleksno jedinjenje zbog ega bi
izostalo razvijanje boje

U kolorimetriji se obino intenzitet boje
nepoznatog rastvora uporeuje sa jednim ili vie
standardnih rastvora poznate koncentracije

Prema tehnici rada kolorimetrijske metode
delimo na:

metode standardne serije
metode balansovanja
metode kolorimetrijske titracije

Aparati koji se koriste u kolorimetriji su
jednostavne konstrukcije i kao izvor svetlosti
koriste belu svetlost

Tipini kolorimetrijski aparati su Helligeov
komparator i Duboscquov kolorimetar.


Fotokolorimetrijske metode
Optika shema fotoelektrinog
kolorimetra
SPEKTROFOTOMETRIJA

Spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja
se zasniva na praenju zavisnosti apsorbance ili
apsortiviteta od talasne duine zraenja koje je
prolo kroz analiziranu supstancu

Apsorpcija se moe pratiti u UV, Vis, IC,
mikrotalasnoj i radiofrekventnoj oblasti.

U analitikoj hemiji su od interesa oblasti od
200-1000 nm, a u organskoj analizi jo i IC
oblast, EPR i NMR spektroskopija

Spektrofotometrija je kvalitativna i
kvantitativna analiza

Kvalitativna analiza se zasniva na injenici da
apsorpcioni spektar supstance zavisi od njenog
sastava i strukture

Na osnovu zavisnosti apsortiviteta od talasne
duine i vrednosti apsortiviteta na odreenoj
talasnoj duini mogue je identifikovati
apsorbujuu supstancu


Kvantitativna analiza sa zasniva na Beerovom
zakonu:

Kod spektrofotometra b je jednako debljini
kivete i konstantno je i onda apsorbanca zavisi
samo od koncentracije i apsortiviteta

Da bi se postigla mogua tanost i osetljivost
apsorbance bitan je izbor talasne duine
merenja

c b a A =
Ona mora da ispuni sledee uslove:

-da se merenjem postie maksimalna osetljivost

-da male promene talasne duine ne utiu na
reproduktivnost

-da vai Beerov zakon

Na osnovu ovih zahteva merenje apsorbance se
izvodi na:

-na talasnoj duini gde je apsorbanca
maksimalna
max

-na taasnoj duini optimalne apsorbance,
opt
i

-na talasnoj duini izobestike take,
izob



izob
kada dva oblika imaju istu apsorbancu
(kiseli i bazni indikator)

Shema spektrofotometra

DERIVATIVNA SPEKTROFOTOMETRIJA

Derivativna spektrofotometrija je relativno nova
metoda ija je primena u poslednje vreme jako
porasla pre svega zahvaljujui razvoju
raunarske tehnike

Primena derivativne spektrofotometrije:

-Pogodna je pri analizi viekomponentnih
sistema

-Kvantitativno odreivanje tragova u
viekomponentnim sistemima
-Karakterizaciju istih supstanci

-Eliminie ili smanjuje apsorbancu pozadine ime
omoguava odreivanja u suspenzijama, mutnim
rastvorima

-Derivatizacijom osnovnog spektra mogue je
tanije odrediti talasne duine maksimuma
irokih apsorpcionih traka
Dobijanje derivativnih spektara:

-Optiki

-Elektronski

-Matematiki
Optiki:

Najmanje se smanjuje odnos signala i uma

Elektronski:

Lo odnos signala i uma, moe se koristiti
samo do etvrtog izvoda

Matematiki:

Koristi se polinomska interpolacija, Furijeva
transformacija
Optika metoda dobijanja derivativnih spektara
se sastoji u modulaciji elektromagnetnog
zraenja u nekoj oblasti talasnih duina ,
koja se naziva interval modulacije

Ispred monohromatora se postavi kvarcna
ploica koja vibrira napred-nazad za nekoliko
stepeni i samim tim izvodi modulaciju talasne
duine upadnog zraenja po sinusoidalnom
zakonu

A
t d tv 2 sin = A
Rezultujui signal se detektuje elektronski,
detektorom koji je podeen na frekvenciju
vibracije ploice .

Amplituda rezultujueg modulisanog snopa bie
proporcionalna nagibu apsorpcione trake unutar
modulacionog intervla, a samim tim i prvom
izvodu spektra, pod uslovom da je modulacioni
interval dovoljno mali u odnosu na irinu trake


v
Elektronska metoda derivacije sastoji se od
povezivanja elektrinog kola sa otpornikom i
kondenzatorom (RC) na analogni izlaz detektora
pomou operacionog amplifikatora

Ovde se dobija izvod u funkciji vremena, ,
ali se na osnovu poznate brzine skeniranja moe
izraunati izvod apsorbance po talasnoj duini;

dt dA/
dt
d
dt
dA
d
dA

=
Kod ovakvog naina dobijanja derivativnih
spektara veliki uticaj imaju instrumentalni
parametri kao to su brzina skeniranja spektra,
irina razreza, veliina pojaanja

Pored toga svaki RC ureaj smanjuje odnos
signala prema umu za 2 to ograniava metodu
do etvrtog izvoda
Matematike metode derivacije se danas
najvie koriste

Diferenciranje osnovnog spektra se izvodi bilo
snimanjem spektra taku po taku
(neregistrujuim ureajem ili ureajem sa
jednim zrakom) i primenom formula za
numeriko diferenciranje tako dobijenih
vrednosti A=f() ili digitalizacijom spektra
snimanjem registrujuim spektrofotometrima i
primenom interpolacije i diferenciranja
Najee se koristi polinomska interpolacija,
Furierova transformacija i interpolacija pomou
splajnova

Nakon toga se, pomou odgovarajuih
numerikih algoritama ovako dobijene
interpolacione formule diferenciraju potreban
broj puta.
Razlika absorbanci za dve bekonano bliske
talasne duine
1
i
2
u osnovnom spektru,
A= f(), podeljena veliinom spektralnog
intervala A=
2
-
1
, predstavlja prvi izvod tog
spektra


Daljim diferenciranjem dobijamo:



Ako ovo primenimo na apsorpcionu traku
gausovog oblika onda dobijam derivativne
spektre
) ( lim

f
A A
=
A
A
=
A
A
) (

n
n
n
f
d
A d
=
Derivativni spektri neparnog rada
imaju malo slinosti sa originalnim
spektrom i sloeniji su od njega

Ono to je bitno za ove izvode je da
prolaze kroz nulu (seku osu talasne
duine) apsorptivnog maksimuma to
daje osnovu za kvalitativnu analizu.

U praksi se od neparnih spektara
koriste samo spektri prvog reda
Derivativni spektri parnog reda imaju centralnu traku (pik)
promenjivog znaka (u drugom izvodu negativan, u etvrtom
pozitivan), praenu sa dve satelitske trake suprotnog
znaka i znatno manjeg intanziteta od centralne trake
Maksimumi apsorpcije u osnovnom spektru
odgovara maksimumu centralne trake parnog
reda

Poluirina te trake znatno je manja nego na
osnovnom spektru i traka je ua ukoliko je red
spektra vei pa parni izvodi imaju veu primenu
od neparnih.

Osnovna osobina izvoda je da su amplitude uih
traka relativno vee od amplituda irokih traka
Za n-ti izvod bilo gausovske ili lorencovske
irine trake amplituda pika je povezana sa
n-tim stepenom reciprone vrednosti irine
trake, u osnovnom spektru, .

Zbog toga za trake istih apsorbanci a razliitih
irina u osnovnom spektru, amplituda ue trake
u derivativnom spektru je vea od amplitude
ire trake za faktor koji raste sa porastom
reda izvoda
) / 1 (
n
n
w D ~
n
w
w
D
D
|
|
.
|

\
|
=
1
2
) 2 (
) 1 (
Nedostatak derivativne tehnike da odnos signala
prema umu postaje loiji progresivno sa
poveavanjem izvoda

Zbog toga se javlja potreba da se izvede
ravnanje spektra kako bi se ovaj odnos
poboljao i um sveo na najmanju meru

U tu svrhu se koriste razliiti numeriki
algoritmi od kojih su najpoznatiji metoda
A. Savitzkog i E. Golaya, metoda Furijerove
transformacije i metoda splajn aproksimacije
Visok odnos signala prema umu mora se postii pri
nekom dozvoljenom nivou deformacije spektra s
obzirom da se pri velikoj filtraciji uma poveavaju
sistematske greke

Drugi izvod spektra metil-digoksima
snimljen na spektrofotometru Cary 3
Varian

Preciznost odreivanja
max

Kada se apsorpcioni spektar sastoji od irokih
traka taan poloaj maksimuma apsorpcije moe
se odrediti samo aproksimativno

Na
max
prvi izvod prolazi kroz nulu tako da se
talasna duina maksimuma apsorpcije moe
odrediti veoma precizno
Poveanje rezolutivnosti
Primenom derivativnih spektara
mogu se razdvojiti trake koje se
preklapaju i ne mogu se
razdvojiti niti razlikovati u
osnovnom spektru
Prvi i drugi izvod dve preklapajue
Gaussovske trake
Spektrofotometrija u suspenzijama i mutnim
rastvorima

Mutni rastvori i suspenzije ili emulzije jako
oteavaju spektrofotometrijsku analizu

Zbog rasipanja zraenja koje raste sa
smanjenjem talasne duine na spektar uzorka se
superponira manji ili vei intenzitet pozadine, a
pored toga se gubi i intenzitet samog spektra
Zbog rasipanja zraenja na nehomogenostima
sredine primena derivativnih spektara
eliminie uticaj fona na spektar analiziranog
uzorka
Apsorpciona traka u rasipajuoj sredini i njen prvi izvod (a) Gaussovska
traka (b) prvi izvod
Spektar uzorka traka (A), Spektar pozadine traka(B), traka
uzorka + pozadina (C) i odgovarajui prvi izvodi
Analiza tragova

Odreivanje tragova supstanci u razliitim uzorcima
izvodi se radi utvrivanja njihove istoe
Odreivanje benzola u etanolu. I etanol, II-etanol +1 ppm
benzola, III-etanol + 10 ppm benzola, IV-4-ti-izvod od II, V-4-ti
izvod od III
U osnovnom spektru prisustvo
benzola se jedva uoava

Tek u spektru 4-tog izvoda benzol
se moe kvantitativno odrediti (AB
je srazmerno koncentraciji
benzola).
Kvantitativna nalaiza

Kod kvantitativne derivativne spektrofotometrije
meri se samo amplituda trake u derivativnom
spektru u zavisnosti od koncentracijie jer je
koncentracija linearno povezana sa amplitudom
n-tog izvoda




Merenja amplitude mogu biti rezultat raunarskog
izraunavanja, ali moe da se izvede i gafiki, a
vaenje Lamber-Beerovog zakona kao i aditivnost
apsorbance se podrazumeva
b c
d
a d
d
A d
n
n
n
n
=


Za odreivanje amplitude koriste se sledee
metode:

-piki-pik maetoda, kod koje se meri rastojanje
izmeu maksimuma i njemu odgovarajueg
minimuma

-metoda tangente kada se povlai tangenta izmeu
dva susedna maksimuma (ili minimuma) i meri
rastojanje izmeu tangente do maksimuma (ili
minimuma) izmeu tih maksimuma paralelno sa
ordinatom

-pik-nula metoda gde se meri rastojanje od
maksimuma ili minimuma do apscise paralelno sa
ordinatom.
Ova metoda se koristi kod spektara vieg rada
koji imaju simetrine pikove u odnosu na
apscisu (spektri prvog reda)
Obrada derivativnog spektra. Metoda tangente (t),
pik-pik metoda (p) i pik-nula metoda (z).
Arsenazo III gradi obojene komplekse sa Th(IV) i U(IV) jonima
sa maksimumima apsorpcije na oko 665 nm.
Drugi izvod kompleksa U pokazuje dve nule na 650 i 684 nm, a
Th na 648 i 680 nm.

Nulte take na 680 i 684 nm mogu se koristiti za simultano
odreivanje metala u smesi.
Na nultoj taki Th (680 nm) meri se amplituda apsorpcije U, a
na nultoj taki apsorpcije U (684 nm) meri se amplituda
kompleksa Th.