Este documento presenta información sobre citogenética clínica. Explica la definición, partes y obtención de cromosomas, así como la importancia de los sistemas de bandas para la nomenclatura e interpretación de cariotipos. También describe técnicas de bandeo como G, Q, C, NOR y FISH que permiten identificar alteraciones cromosómicas.
Este documento presenta información sobre citogenética clínica. Explica la definición, partes y obtención de cromosomas, así como la importancia de los sistemas de bandas para la nomenclatura e interpretación de cariotipos. También describe técnicas de bandeo como G, Q, C, NOR y FISH que permiten identificar alteraciones cromosómicas.
Este documento presenta información sobre citogenética clínica. Explica la definición, partes y obtención de cromosomas, así como la importancia de los sistemas de bandas para la nomenclatura e interpretación de cariotipos. También describe técnicas de bandeo como G, Q, C, NOR y FISH que permiten identificar alteraciones cromosómicas.
2012 Dra.IsmeniaGamboaOr Especialista en Citogentica Clnica
DEFINICIN PARTES DEL CROMOSOMA OBTENCIN DE CROMOSOMAS SSTEMAS DE BANDAS - IMPORTANCIA NOMENCLATURA E INTERPRETACIN DE CARIOTIPOS Contenido ADN - CROMOSOMA REGIN CORTA DE ADN PAQUETE DE NUCLEOSOMA PAQUETE DE SOLENOIDES PARTES DE UNA SECCIN CROMATINA CONDENSACION DEL CROMOSOMA METAFSICO CROMOSOMA METAFSI CO NUCLEOSOMA 100 A SOLENOIDE Unin de los dominios al armazn a travs de las regiones SAR CROMOSOMAS HUMANOS NMERO DE CROMOSOMAS: CLULA SOMTICA = 2n = 46 cromosomas = Diploide GAMETOS = n = 23 cromosomas = Haploide 22 pares AUTOSMICOS 01 par SEXUAL (X,Y) CLASIFICACIN: (Convencin Denver 1960) TAMAO: ORDEN DECRECIENTE POSICIN DEL CENTROMERO GRUPOS: AUTOSMICOS: A ,B, C, D, E, F, G, SEXUALES: X e Y ESPECIE Nmero de cromosomas Hormiga Myrmecia pilosula 1 Mosca de fruta Drosophila melanogaster 8 Chimpance Pan troglodytes 48 Gallina Gallus gallus 78 Mariposa 380 Helecho Ophioglussum reticulatum 1260 Protozoario Aulacantha scolymantha 1600 NMERO DE CROMOSOMAS EN DIFERENTES ESPECIES SUBMETACNTRICO ACROCNTRICO METACNTRICO 1. POSICIN DEL CENTRMERO 2. MORFOLOGA Y PARTES DE LOS CROMOSOMAS p q Centromero Telmero Secuencias repetidas en tandem (TTAGGG) ACROCNTRICO q Satlite Talo p p q TELOMEROS Estructuras especializadas que forma los extremos de los cromosomas eucariontes. Le dan ESTABILIDAD
Los ADN telomricos son regiones no codificantes.
Estn repetidos (TTAGGG)n en tandem RICAS EN GUANINA: 10 Kb en clulas somticas 20 Kb en clulas de placenta
La longitud de las repeticiones est relacionada con el envejecimiento y dao celular. TELOMEROS Un Telmero normal, no solo es estable, sino que Ancla ese extremo al armazn nuclear.
>Los extremos salientes de las hebras G son importantes para la proteccin de los telmeros mediante la formacin de un bucle de DNA de cadena doble (dplex).
FUNCIONES:
1. Evitar la fusin y degradacin cromosmica.
2. Mantienen la estabilidad cromosmica.
3. Intervienen en el apareamiento de los cromosomas homlogos y el entrecruzamiento durante la profase en la Meiosis I.
4. Sirven como un reloj mittico. TELOMEROS CLASIFICACIN CROMOSOMAS HUMANOS PREPARACIN Y OBTENCIN DE CROMOSOMAS METAFSICOS MUESTRA: Sangre Perifrica: (Cultivo de linfocitos) Mdula Osea Piel Lquido Amnitico Vellosidades Coriales Sangre de Cordn Umbilical Tumores Slidos Jeringa heparinizada PREPARACIN Y OBTENCIN DE CROMOSOMAS METAFSICOS MEDIOS DE CULTIVO: Mc Coys TC 199 F 12 / F 10 RPMI 1640 ADICIONAR: Suero de Bovino Fetal Fitohemaglutinina Antibitico S I E M B R A OBTENCIN DE CROMOSOMAS METAFSICOS SOLUCIN HIPOTNICA (KCl) COLCHICINA CENTRIFUGACIN COSECHA: PREPARACIN Y OBTENCIN DE CROMOSOMAS METAFSICOS Lminas porta objetos heladas Fijador: CARNOY PREPARACIN Y OBTENCIN DE CROMOSOMAS METAFSICOS COLORACIN: CONVENCIONAL: GIEMSA BANDEO: Bandas G Bandas Q Bandas C Bandas R Bandas NOR Bandas G-11 ICH FISH ALTA RESOLUCIN PREPARACIN Y OBTENCIN DE CROMOSOMAS METAFSICOS MICROFOTOGRAFIA Armar Cariogramas REGIONES, BANDAS Y SUB-BANDAS BANDAS G Summer, 1971 UTILIZA: TRIPSINA (desnaturaliza las protenas) Las bandas G (+) corresponden a CROMATNA LIBRE para unirse al colorante. Las bandas G (-) son DNA cubierto o no disponible y en parte extrado. COLORANTE: * GIEMSA derivado TIAZINAS, son molculas planas con carga (+) que, interactan con GRUPOS FOSFATOS ADN por fuerzas inicas BANDEO GTG BANDAS GTG Bandas G- (claras) Bandas G+ (oscuras) DNA rico en GC DNA rico en AT Replicacin temprana GENES ESTRUCTURALES Replicacin tarda GENES DE TEJ. ESPECIFICO
Muchos genes Pocos genes CARACTERSTICAS DE LAS BANDAS G (ej. gen de la -globina),
1 7 6 13 14 15 16 17 18 19 20 22 21 2 3 4 5 8 9 10 11 12 A B C D E F G X Y CARIOGRAMA: BANDEO GTG BANDAS C PARDUE Y GALL, 1970 HETEROCROMATINA EN REGIN CENTRMERICA (Extraccin del ADN no pericentromrica) 20% genoma humano Se trata con : hidrxido de bariode Bario a 65C OBSERVA: HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA de distribucin pericntrica en todos los cromosomas excepto el cromosoma Y (regin distal del brazo largo). Tie: Constricciones secundarias cromosomas: 1, 9, 16, y el brazo largo del cromosoma Y. BANDEO CBG Y CARIOGRAMA BANDEO CBG Y DUTRILLAUX y LEJUENE 1971 Llamadas Bandas REVERSAS G, y Q. Temperatura altas y colorante Giemsa. Detecta: ADN rico en G-C (bandas oscuras). Denatura el ADN rico en A-T Utilidad: Muestra re-arreglos terminales (deleciones, traslocaciones, etc) y polimorfismos de los cromosomas.
BANDEO RHG BANDAS R BANDAS Q CASPERSSON 1971 Colorante: Mostaza de quinacrina dihidroclorato de quinacrina Visualiza: Microscopio de fluorescencia Fluorece: Presencia de ADN rico en A-T (Ellison y Barr 1972) Las bases G-C rompen la fluorescencia (Comings 1975-1978) Las protenas NO HISTONAS limitan el acceso a la zona G-C (Pachmann y Riegler, 1972)
BANDEO Q BANDAS NOR
Ferguson-Smith, 1961. FUNDAMENTO: Emplea plata amoniacal o nitrato de plata para teir regiones de los organizadores nucleolares, que contienen ARNr localizados. Para ver polimorfismo de los satlites. Las regiones NOR se ubican e el tallo del satlite de los cromosomas acrocntricos, correspondiendo a protenas NO HISTONAS que aparecen con la sntesis del ARNr. RESULTADOS: Las constriciones secundarias de los cromosomas acrocntricos con satlite se tien en los tallos con plata amoniacal. Modificacin de la banda G con pH elevado para demostrar variantes normales comunes (polimorfismos).
Se tien: Las constricciones secundarias del cromosoma 9, El segmento distal largo del cromosoma Y, El rea pericntrica del cromosoma 20. BANDAS G-11 DETERMINACIN DEL N DE BANDAS CROMOSMICAS Utiliza Bromo-deoxiuridina que sustituye a la timidina Mediante autoradiografa Se observa el intercambio entre los segmentos de las cromtides hermanas. Normalmente se visualiza de 6-9 intercambios por metafase, y Aumentan cuando se exponen a mutgenos o en algunas enfermedades donde se observan los GAPS sitios frgiles como brechas que no se tien bien. ICH (INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS TCNICA DE BANDEO EN ALTA RESOLUCIN CROMOSOMAS: * PROMETAFASE * RESOLUCIN DE 850 BANDAS ( 850 bandas)
DETECTA ALTERACIONES ESTRUCTURALES SUBMICROSCPICAS: * MICRODELECIONES * MICROINVERSIONES, y * REORDENAMIENTOS CROMOSMICOS Emplean sondas (PROBES) especficas para la coloracin de determinados cromosomas, y diagnostican anomalas cromosmicas.
FUNDAMENTO: A partir del ADNc o ADN genmico. La sonda se marca y se aade por hibridacin, y la seal se identifica por autoradiografa o fluorescencia. Se observan grnulos en la zona que hubo hibridacin FISH (HIBRIDACION IN SITU POR FLORESCENCIA FISH HIBRIDACIN IN SITU POR FLUORESCENCIA COMBINA: CITOGENTICA CLSICA CON LA GENTICA MOLECULAR. Utiliza molculas fluorescentes para localizar genes o fragmentos de DNA, mapea genes o localizar anormalidades cromosmicas. IDENTIFICA: REGIONES COMPLEMENTARIAS DE LOS CROMOSOMAS. UTILIZA: SONDAS (secuencias de ADN conocidas) MARCADAS CON FLUOROCROMOS QUE HIBRIDAN CON EL ADN PROBLEMA. VISUALIZA: CROMOSOMAS METAFASE, PROFASE, e INTERFASE, CLULAS COMPLETAS, TEJIDOS. ANALIZA RAPIDAMENTE: * GENES O REGIONES ESPECIFICAS DEL ADN * CROMOSOMAS INVOLUCRADOS EN DIVERSAS ENFERMED PERMITE REALIZAR ESTUDIOS CITOGENTICOS EN FORMA RETROSPECTIVA EN EMBRIONES O FETOS QUE HAN SIDO FIJADOS Y QUE MUESTRAN ALTERACIONES EN EL FENOTIPO FISH
SONDAS ESPECIFICAS DE UN LOCUS: Hibridan una regin particular del gen. Identifica microdeleciones SPW y SA del(15)(q11q13) S. Wolf-Hirschhom del (4)(p16.3) Retinoblastoma del (13q) S. Cri Du Chat del(5)((p15.3) En ncleos interfsicos (muestras de clulas fijadas) Identifican regiones pericentromricas. Detecta regiones crticas que resultan de una translocacin. Ej. Leucemia Mieloide Crnica t(9;22) Leucemia aguda promieloctica t(15;17)
FISH TIPOS DE SONDAS Sonda: marca los dos cromosomas 22 y un cromosoma marcador derivativo del 22 SONDA ESPECIFICA DE UNL0CUS mar FISH TIPOS DE SONDAS SONDAS ALFOIDES O CENTROMERICAS: Contienen secuencias complementarias de las secuencias repetidas que se encuentran en los centrmeros de los cromosomas.
Utilizan sondas de diferentes colores, para cada cromosoma
Detecta anomalas numricas y estructurales en cromosomas Metafsicos o en Interfase.
SONDAS PARA CROMOSOMAS COMPLETOS:
Cada SONDA se hibrida a una secuencia diferente a lo largo de todo un cromosoma generando un cariotipo espectral.
Se consiguen imgenes de un color diferente para cada cromosoma. Detecta anomalas numricas y estructurales
FISH TIPOS DE SONDAS Mujer con cariotipo y FISH normal, se uso sonda para el locus D22S75 (S. de Di George)
SONDA UNIL0CUS Seal verde: control interno marca el cromosoma 22 en 22q13 Seal Roja: marca la regin DiGeorge, en 22q11.2. Cariotipo normal 46,XX.ish 22(q11.2)(D22S75X2) NIVELES DE RESOLUCIN EN BANDAS 350 bandas. Mdula Osea
450-550 bandas. Lquido Amnitico
550-750 bandas. Sangre Perifrica 750-850 bandas ALTA RESOLUCION (cromosomas en prometafase) ANLISIS CROMOSMICO Conteo de cromosomas: 20 30 clulas en metafase. Sospecha de mosaicismo: Contar por cada metafase alterada 5 metafases ms. El patrn de bandas de cada cromosoma es especfico, se compara con el IDEOGRAMA.
CARIOGRAMA: ordenamiento de los cromosomas por pares del 1 al 23 > Las diferencias interindividuales en el contenido de ADN de los cromosomas se han precisado mediante la CITOMETRIA DE FLUJO O MICRODENSITOMETRIA.
Existen cuatro grupos principales: 1. TAMAO DEL BRAZO q DEL CROMOSOMA Y: FRECUENCIA: 10% de los hombres tienen el cromosoma Y mas largo y mas corto que lo usual. COLORACION: BANDAS Q Y BANCAS C. HETEROMORFISMOS CROMOSMICOS HETEROMORFISMOS CROMOSOMICOS 2. TAMAO DE LA HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA: Variaciones en los cromosomas 1, 9, 16. Tincin: BANDAS C. 3. POLIMORFISMOS DE LOS SATLITES: Variaciones en los cromosomas 13, 14, 15, 21, 22. Tincin: BANDAS Q Y NOR. 4. SITIOS FRGILES: Rasgos estructurales de los cromosomas que se hacen visibles en ciertas condiciones en el cultivo de tejidos. Se heredan en forma codominante, por lo menos existen 20 sitios frgiles comunes y 18 sitios raros. SSTEMA INTERNACIONAL DE NOMENCLATURA CITOGENTICA (ISCN) 2009 RESULTADO DE CONFERENCIAS INTERNACIONALES: DENVER 1960 1 REUNIN LONDRES 1963 CLASIFICACIN CROMOSOMAS GRUPOS A-G CHICAGO 1966 SSTEMA ESTANDAR DE NOMENCLATURA PARIS 1971 DESCRIPCIN DE BANDAS Y REGIONES ISCN 1978 DOCUMENTO ISCN 1981 BANDEO DE ALTA RESOLUCIN ISCN 1985 DOCUMENTO ISCN 1991 NOMENCLATURA CITOGENTICA DEL CANCER ISCN 1995 NOMENCLATURA FISH ISCN 2005 NOMENCLATURA CROMOSOMAS EN MEIOSIS
ISCN 2009 Nomenclatura del MLPA(Amplificacin de sondas mltiples) SMBOLOS Y ABREVIATURAS ace fragmento acntrico Upd disomia uniparental c anomala constitucional rea rearreglo cen centrmero g gap chr cromosoma h heterocromatina del delecin fra fragilidad der cromosoma derivativo i isocromosoma dic dicntrico inc cariotipo incompleto dmin doble minut ins insercin s satlite inv inversin stk talo satelital mar marcador t traslocacin tan tandem pat origen paternal mat origen materna p brazo corto del cromosoma q brazo largo del cromosoma de novo cromosoma anormal el cual no ha sido heredado add material adicional de origen desconocido International System for Human Cytogenetics ISCN (2009) : > En cromosomas normales : Varn normal : 46,XY Mujer normal : 46,XX > Anomalas numricas : S. de Down : 47,XY,+21 S. de Klinefelter : 47,XXY S. Turner : 45,X > Anomalas estructurales : S. Cri-duchat : 46,XY,del(5)(p15) S. de Down : 46,XX, der ( 14;21) (q10;q10),+21 Anomala en cromosoma sexual X : 46,X, r (X) (p13 q26) S. Prader Willy: 46,XY, del(15)(q11q13) MOSAICOS CONSTITUCIONAL: dotacin cromosmica al nacer 45,X 10 / 46,X X 20 45,X 15 / 47, XXX 10 / 46, XX 23 La lnea celular normal se indica al final, independientemente del tamao. En las lneas celulares anormales, el clon mayor se indica en primer lugar. ADQUIRIDAS: aparece en enf. Hematolgicas,tumores,etc 46,XX,t(8;21)(q22;q22) 12 / 45,X,-X,t(8;21)(q22;q22) 19 / 46,X,-X,+8t(8;21)(q22;q22) 5 La lnea celular normal, se indica al final, independiente de su tamao Los clones anormales, se indican en orden creciente de complejidad, independientes a sus tamaos. GRACIAS