Paraclnicos Moleculares y de

Gentica Forense
GISEL GORDILLO GONZLEZ
ESP. GENTICA MDICA
HIBRIDACIN
Unin
complementaria de
cidos nucleicos
Tcnicas:
Detectar una
molcula partiendo de
una sonda
complementaria a ella.
PCR
Arrays
Hibridacin in situ
ELECTROFORESIS

Separa molculas en un
campo elctrico segn
tamao y carga elctrica.
Siembra de la muestra
Gel poroso
Aplicar campo elctrico
Migracin
Tincin (bromuro de etidio)
para visualizacin

PCR
(Reaccin en cadena de la polimerasa)
Tcnica de Biologa Molecular descrita por
Kary Mullis en 1983, bioqumico.





Premio Nobel de Qumica, en 1993 junto
con Michael Smith
PCR
(Reaccin en cadena de la polimerasa)

Objetivo:
Amplificacin directa de un gen o fragmento
de ADN, o indirecta de un RNA

Requisito
Conocer la secuencia de una parte

PCR
(Reaccin en cadena de la polimerasa)

FUNDAMENTO:
Propiedad natural de las ADN
polimerasas para replicar hebras de
ADN, usando ciclos de alta y baja T
para separar las hebras de ADN recin
formadas entre s tras cada fase de
replicacin y, a continuacin, dejar que
vuelvan a unirse a polimerasas para que
vuelvan a duplicarlas.
Aplicaciones de la PCR

Diagnstico clnico
Monitoreo y evaluacin de terapias
Deteccin de cepas resistentes a antibiticos
Deteccin de mutaciones puntuales
Polimorfismos genticos
Medicina forense
Pedigr animal
Control de calidad
Termociclador
Componentes de la PCR
Muestra ADN Primers (cebadores)
dNTPs
Muestra de ADN

No quelantes (EDTA)
[Mg]
Terapia de Quelantes
Muestra de ADN

ADN no puede estar fragmentado en trozos ms
pequeos de lo que queremos amplificar.

Cantidad de la muestra: mnimo 10-100 ng. y
mximo 400-500 ng.

Primers (Cebadores)
El contenido en G + C debe ser aproximadamente
del 50%.
Relacin mx purinas/pirimidinas = 60%/40%.
Tamao: 18-30 pb.
Tm= 4 (G+C) + 2(A+T)



ADN Polimerasa
Termolbiles
Termoestables
Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq
polimerasa.
Termus aquaticus
Otros reactivos

Utilizamos dNTPs (Deoxinucletidos
trifosfato)
dATP, dGTP, dCTP y dTTP
Concentraciones iguales.

[dNTPs] = [Mg++]
Principios (pasos) de la PCR

1. Denaturalizacin reversible del ADN,
por calentamiento
2. Anillamiento del primer
3. Sntesis de la cadena de ADN por
una ADN polimerasa en sentido 5
3

http://www.fitolab.com.mx/fitolabSiteRecs/esquemaPCR.jpg

La deteccin del producto de la PCR, se hace por
electroforesis
Producto
Amplificado
(AMPLICON)
PCR en Tiempo Real

Permite cuantificar adems
de detectar y amplificar
secuencias de ADN
Diferencias:
Uso de Reporteros
fluorescentes (Beacons)
http://www.docstoc.com/docs/108459246/PCR-en-Tiempo-Real

PCR en Tiempo Real
http://www.udg.edu/serveis/STRUBM/Tecniques/PCRquantitativa/tabid/13251/
language/es-ES/Default.aspx

PCR en Tiempo Real
Ventajas Aplicaciones
Anlisis de la cintica de
la reaccin
Deteccin del producto
en cada ciclo
Mayor sensibilidad
(menos falsos negativos)
Ms rpida
Menos contaminacin
(menos falsos positivos)

Cuantificacin expresin
de genes
Control eficacia frmacos
Deteccin agentes
infecciosos
Dx. Tumores
Deteccin polimorfismos

BLOTS
Western Blot
Inmunoblot
Nos permite visualizar anticuerpos (Acs) directos
contra protenas
Prueba confirmatoria para un ELISA de HIV positivo
http://www.pathology.ucla.edu/cirl/pages/publicview/images/autoblot.jpg
Pasos del Western Blot

1. Protenas se separan por gel de
electroforesis, usualmente pgina de SDS
(sodium dodecyl sulfate)
2. Las protenas se transfieren a una hoja de
papel de nitrocelulosa.
3. La mancha se incuba con una protena
(protenas de la leche)
4. Se adiciona un anticuerpo a la solucin que
se une especficamente a la protena.
http://www.virology.ws/wp-content/uploads/2010/07/western_blot.jpg
Pasos del Western Blot
4) El anticuerpo se localiza por tincin de este que lo
hace visible
Southern Blott Northern Blot
Mtodo para localizar
secuencias de ADN
Mtodo para localizar
secuencias de ARN

Ejemplo de Southern. http://es.wikipedia.org/wiki/Southern_blot
SECUENCIACIN
Secuenciacin
Mtodos y
tcnicas bioq.
para determinar
el orden de los
nucletidos de
un fragmento de
ADN.
Utilidad de la Secuenciacin
PROYECTO
GENOMA
HUMANO.
Investigacione
s biolgicas.
Investigacione
s forenses.
Desarrollo de la Secuenciacin.

30 mtodo de terminacin de cadena: Sanger.
70 mtodo de punto corrido: Gilbert y Maxam.
Secuenciacin de ARN.
Secuenciacin de ADN.
Secuenciacin automtica.
MTODO SANGER
(terminacin de la cadena dexosi)
COMPONENTES:
Hebra de ADN.
Cebador primer (marcado)
ADN polimerasa
ADN Pol I bacteriofago T4
Nucletidos trifosfato.
Nucletidos dideoxi

Proceso: Mtodo Sanger
Nucletidos modificados (didesoxi): ddATP, ddGTP,
ddCTP, o ddTTP.
Proceso: Mtodo Sanger
1. 4 tubos:
dNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddATP
dNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddGTP
dNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddCTP
dNTP + ADN polimerasa I + Primer + ddTTP

dNTP ddNTP
Proceso: Mtodo Sanger
Proceso: Mtodo Sanger
50 cm
Secuenciacin Automtica

El mtodo automtico en lugar de
radioactividad utiliza fluorescencia
Cada dNTP con un fluorocromo distinto
Permite leer al mismo tiempo los
ADNs de nueva sntesis producto de
las cuatro mezclas de reaccin.

GENTICA FORENSE
Gentica Forense

Pruebas biolgicas de paternidad
Criminalstica biolgica
Identificacin humana
Investigacin
Gentica Forense
Polimorfismos genticos Marcadores
genticos:
Se transmiten mendelianamente
Diversidad gnica en individuos de la
misma especie
Datos poblacionales de frecuencias allicas
Gentica Forense
Tasa de mutacin baja
Analizable con mtodo rpido
Antgenos eritrocitarios y leucocitarios
Protenas sricas
Enzimas
Regiones hipervariables
Regiones Hipervariables
ADN codificante (30%) protena
No codificante (70%) altamente polimrfico
ADN Microsatlite: tienen un tamao muy pequeo de
hasta 400 pb, por lo que son idneos para la prueba de
PCR usada en forense.
Tambin se conocen como Short Term Tandem Repeat
(STR), ya que la repeticin oscila entre 4 a 7 pb. Se
encuentran en todo el genoma.
Ejemplo: CCTTACTCCTTACTCCTTACTCCTTACTCCTTACT
Algunos marcadores utilizados

D8S1179
D7S820
THO1
D13S317
VWA
TPOX
D18S51
FGA
Amelogenina
Mtodo
Toma de sangre (semen, frotis de
vagina, saliva, pelos, orina)
Extraccin ADN
Secuenciacin
Electroferograma Genotipificacin
Electroferograma
D8S1179
D16S539
D19S433
D18S51
D8S1179
D16S539
D19S433
D18S51
D8S1179
D16S539
D19S433
D18S51
13 14
11 12
14 14
13 14
13
12
14
12
13
18
18
11
18
11
7
14
14
11
14
21
Ncleo Familiar
Mutacin de STRs
Stepping-stone

STR = 11
STR = 12
STR = 10
Resultado Prueba Forense
MINIMO 13 marcadores estudiados confiabilidad
del 99,999%
Menos de 13 marcadores no se da un dictamen
debe repetirse el estudio.
Paternidad/Identidad (con mnimo 13 marcadores):
existe un 0,001% de probabilidad que el seor X no
sea el padre de el individuo Y


EJEMPLO CASO FORENSE
INSTRUCCIONES
El objetivo del ejercicio es responder las preguntas
que van apareciendo; detenerse y pensar antes de
seguir.
Pasar cada diapositiva lentamente para no perder el
objetivo del ejercicio.
Escena del crimen
En el bao de
un Centro
Comercial
Se descubre el
cuerpo de una
joven asitica, con
signos de
violencia..
Observe la escena
detalladamente.
Que le llama la
atencin?
La victima no tiene ropa
Manchas de sangre en
el suelo
Hematomas en
cuello
Como genetista experto en el rea forense,
su primera deduccin es:
1. La joven se suicid
2. Tuvo un Infarto y falleci sbitamente
3. Fue violada y asesinada por desconocido/s
4. Resbal en el bao y cay
RECUERDE LA AUSENCIA DE ROPA, LOS
HEMATOMAS EN CUELLO Y LAS
MANCHAS DE SANGRE EN LA ESCENA.
Cerca de la victima se encontr una
gorra de bisbol abandonada.
Piense un poco
Mx. de la sangre
encontrada en la
escena
Mx. Victima:
-Sangre
- Fondo de saco
de vagina
Mx Gorra
Con los datos anteriores, qu
muestras debe tomar de la escena
del crimen?
Que otras muestras, adems de las anteriores
(obvias) podran recogerse de la escena?

- Del lecho ungueal de la victima. Recordemos que
fue un acto violento; pudo haberse defendido.
Con ayuda de la
polica, se descubre
que la victima fue
trada de Japn por
una banda de trata
de personas.

Se logra encontrar en
Japn, un to quien
acepta donar una Mx
de sangre para
comprobar la identidad
de la victima.
Investigaciones arrojan datos sobre 2 sospechosos
quienes fueron vistos con la victima poco antes de
su muerte:
En que orden de importancia solicitara
estas muestras?
- Sangre
- Semen
- Cabellos
- Saliva
Primero sangre, luego saliva, seguido de
cabello y por ultimo semen.
Finalmente obtenemos la Genotipificacin para 16
marcadores de:
- Sangre de la victima
- Fondo de saco de vagina
- Posible to de la victima
- Sospechoso No 1
- Sospechoso No 2
- Sangre del piso
- Gorra de bisbol
El laboratorio de gentica forense realiz la
genotipificacin de todas las muestras, incluyendo
una separacin diferencial (fraccin masculina y
femenina) de la muestra de fondo de saco vaginal,
la cual se observa en el siguiente cuadro:
Nota: la fraccin masculina no especfica cuantos
individuos aportaron a la muestra. Por eso encontraran 3
STRs en algunos marcadores.
Marcador Sangre
Victima
Fraccin masculina
FSV
Fraccin
femenina
FSV
Mx Posible
To
Sospechoso
No 1
Sospechoso
No 2
Sangre en el
piso
Gorra bisbol
D8S1179
8 , 9 10, 13, 14 8 , 9 8 , 9 10 ,13 8, 12 13, 14 NA
D7S820
11 , 12 11, 13, 14 11 ,12 12 ,14 13 ,14 16 ,17 11, 11 11
THO1
9.3 , 10 7 , 8 9.3 , 10 6 , 6 6, 7 6 , 6 7, 8 6,7,8
D13S317
14 , 15 11 ,15 14 ,15 12 ,14 15, 15 12 ,13 11, 12 NA
VWA
19 , 20 19 ,19 19 , 20 19 ,20 19, 20 7 , 8 18, 19 18,19
TPOX
7 , 9 9 , 9 7 , 9 7 ,8 8, 9 11 ,16 9, 9 9,11,16
D18S51
21 , 22 10,12,14 21 , 22 21 ,20 10, 12 3 , 5 12, 14 12,14
FGA
14 , 16 NA 14 ,16 24 ,28 18, 18.2 23 , 23 23, 24 NA
D21S11
29 , 30 NA 29 ,30 28 ,30 36 , 37 30 ,32 23, 24 34, 35
CSF1PO
10 , 11 7, 8, 9 10 ,11 11 ,11 8, 9 6, 7 34, 35 6,7
D3S1358
15 , 17 15 ,15 15 ,17 16 ,16 15, 15 12,12 7, 7 12, 14,15
D16S539
12 , 13 8 , 10 12 ,13 11 ,12 5, 8 2, 3 14, 15 3
D2S1338
11 , 12 5 , 6 11 ,12 8 , 9 5, 6 13, 14 9, 10 NA
D19S433
19 , 20 21 , 22 19 , 20 18 , 19 21, 22 19, 20 13, 14 5, 7, 20
D5S818
14 , 16 11 , 12 14 , 16 14 , 16 7, 11 5, 6 11, 12 11, 12
Amelogenina
XX XY XX XY XY XY XY XY
NA= No amplifica
FSV= Fondo de Saco de vagina
A partir de los datos, responda:
1. Cuantos marcadores comparten la victima y el
posible to?
Cual es la probabilidad que el seor sea el to de la
victima.

2. Cuantos individuos, aportaron a la fraccin
masculina de la muestra de FSV?
A partir de los datos, responda:
3. Cuantos individuos aportaron a la muestra de la
gorra de beisbol?

4. Cuantos sospechosos cree usted, estuvieron
involucrados en el crimen?

5. A quien corresponde la muestra de sangre en el
suelo (victima-sospechosos-otro) y porqu?

GRACIAS