REACCIONES

INMUNOENZIMTICAS



REACCIONES INMUNOENZIMTICAS
REACCIONES INMUNOCITOQUMICAS


MARCADOR UTILIZADO

Enzima Sustrato


EQUIPO DE VISUALIZACION

Microscopio ptico
Inmunocitoqumica/ Inmunoenzimticas
Se usan anticuerpos unidos a enzimas que al
actuar sobre un sustrato producen compuestos
coloreados e insolubles que precipitan en la
posicin del Ag. Visibles al microscopio ptico.
Anticuerpo Especfico
(Enzima ligada)


Antgeno


Sustrato de la Enzima


Cromgeno
Precipitado Coloreado

VISUALIZAR LA REACCION
ANTIGENO ANTICUERPO


MICROSCOPIO PTICO

REACCIONES DE INMUNOCITOQUMICA


ENZIMA: PEROXIDASA SUSTRATO: DIAMINOBENCIDINA
Antgeno : Protena p53 (Oncogen)
Linfoma Esplnico
ACCIN DE LAS ENZIMAS

Enzima catlisis Sustrato Producto Transformado

E + S [ E.S ] + Cromgeno P

{ P = Precipitado Coloreado }



Alta Eficiencia : 1 Mol E 1000 1000000 Mol S


Un slo sustrato

Varios sustratos
Enzima
ENZIMAS TILES PARA CONJUGACIN
Accin mantenida al combinarse con otros
reactivos

Enzima conjugada estable en solucin

Productos detectables y estables

Sin interferencia endgena
Actan como un sistema indicador de la presencia
de inmunocomplejos al combinarse con sustratos
de diversos tipos: cromognicos.

El producto de la reaccin enzimtica da lugar a
una emisin de color, fluorescencia o
quimioluminiscencia.

La intensidad de la coloracin o de la
inmunofluorescencia es proporcional a la cantidad
de elemento analizado presente en la muestra.
VENTAJAS
Mtodo sensible.

Bajo costo.

Fcil manejo.

Permite desarrollar un gran nmero de
muestras en un corto perodo de
tiempo.

Buen equilibrio entre sensibilidad y
especificidad.
Factores Accin Cataltica
[C] de Enzima / Sustrato

pH -- T -- Luz

[C] de Sales / Iones

Accin de iones metlicos
( Mg
++
Mn
++
Zn
++
)

Inhibidores
Competitivos - No Competitivos
PEROXIDASA (HRP)

FOSFATASA ALCALINA

GLUCOSA OXIDASA
ENZIMAS MS USADAS EN
LA PRCTICA CLNICA
Peroxidasa HRP

P.M. = 40 kD Sitio Activo Grupo Hem (Fe
++
= Hematina )

ACTUA INICIALMENTE SOBRE AGUA OXIGENADA

Hem Complejo : H
2
O
2
H
2
O y O
2
*


Oxida varios Cromgenos como Polifenoles y Nitratos
(DONANTES DE ELECTRONES)



Inhibida por : Exceso de Perxido
Azida
Cianatos

^^ Peroxidasa Endgena ^^
COLOROGRAFA SEGN EL CROMGENO
PEROXIDASA

Diaminobencidina (DAB) MARRN

3-Amino-9Etilcarbazole (AEC) ROJO

4-Cloro-Naftol (4-CN) AZUL-NEGRO

Alfa-Naftol-Pironina ROJO

= Precipitado soluble en Alcohol
REACCION INMUNOHISTOQUMICA

Antgeno: HMB-45. Marcador Tumoral de Melanoma
Enzima: PEROXIDASA
Cromgeno: Diaminobencidina DAB Cromgeno: AminoetilCarbazol AEC
Fosfatasa Alcalina
P.M. = 100 kD . Hidroliza y Transfiere grupos Fosfato
de Esteres Orgnicos (Fenoles , Naftol)

sales Diazodicas Precip. / Color

Requiere Activadores Metlicos : Mg
++
Mn
++
Ca
++


SU PRINCIPAL USO ES EN FORMA DE
COMPLEJO CON ANTICUERPOS


^^ ACTIVIDAD ENDGENA Hueso / Rion / Hgado ^^


COLOROGRAFA SEGN EL SUSTRATO

FOSFATASA ALCALINA

Fast Blue BB AZUL

Fast Red TR ROJO

New Fuchsin ROJO

= Precipitado soluble en Alcohol
COLOROGRAFA SEGN EL SUSTRATO

GLUCOSA OXIDASA

Tetrazolium AZUL


TetraNitroblueTetrazolio NEGRO
LISTA DE CROMGENOS
ENZIMA
IL - 8 en Macrfagos
H.R.P. (Estrept./Biot.)---DAB

Cyclina D1
Linfomatosis Polipoide
Fosf. Alc. -- FastRed
Atipia clulas escamosas
P16 ink. HRP- DAB
RECONOCIMIENTO DE TEJIDOS Y CLULAS
DETECCIN DE MACROMOLCULAS
ANTIGNICAS MARCADORAS
DIAGNSTICO ESPECFICO
APLICACIONES
Linfoma de Hodgking
CD30
Ca. Colon.
Hent 1 Topoisom. I
Ag. prosttico
Mycobacteria
Ganglio
Ca. mama
TIPOS BSICOS DE MARCAJE
DIRECTOS
INTERACCIN DEL ANTICUERPO PRIMARIO MARCADO

CON EL SUSTRATO ANTIGNICO
INDIRECTOS
ANTICUERPOS SECUNDARIOS MARCADOS SON

AGREGADOS DESPUS DE LA REACCIN INICIAL

DEL ANTICUERPO PRIMARIO NO MARCADO
DOS PASOS
Mtodos de Amplificacin

Mas usado en la actualidad = Complejo Avidina Biotina

Dos protenas que tienen una muy grande afinidad entre ellas,
muy parecida a la de un anticuerpo con su antgeno.

Al complejo de avidina biotina se le anexa el marcador a usar
en la reaccion.

Avidina = Protena extrada del huevo

Biotina = Forma qumica de Vitamina B6

Concentran en los sitios de reaccin, un gran
nmero de molculas de la enzima y su sustrato
cromognico. Esto aumenta muchsimo la
cantidad de precipitado coloreado.
COMPLEJOS AVIDINA - BIOTINA
AVIDINA-BIOTINA MARCADA
(LAB)


[* ESTREPTAVIDINA]
(LSAB)


COMPLEJO AVIDINA BIOTINA
(ABC)


[ * ESTREPTAVIDINA ]
(SABC)
CADENAS POLIMRICAS CONJUGADAS
( EPOS EnVISION ImmPRESS)
SE INCORPORA DESPUS DEL Ac. PRIMARIO UN
POLMERO INERTE (DEXTRAN) QUE TIENE ADOSADAS
VARIAS MOLCULAS DE Ac. SECUNDARIO Y DE LA ENZIMA

AMPLIFICACIN CATALTICA DE LA SEAL
( CSA Technology )
COMPLEMENTA EL PROTOCOLO ABC USANDO UN
REACTIVO AMPLIFICADOR QUE AUMENTA
LA DENSIDAD DE PEROXIDASA QUE ACTUAR
SOBRE EL SUSTRATO
EL MS USADO = TIRAMIDA
TCNICA DE ELISA
El nombre enzymed-linked inmunosorbent assay, luego
abreviado como ELISA, fue acuado por los investigadores
suecos Eva Engvall y Peter Perlman, quienes describieron y
publicaron el procedimiento en 1971.
ELISA INDIRECTO
DETECCIN DE ANTICUERPOS
La reaccin se lleva a cabo en los fositos de la
placa, donde se adsorbe el antgeno conocido,
con el suero problema.

La actividad enzimtica sobre el sustrato
apropiado, aadido al final de la reaccin, se
revela por cambio de color cuantificable por
espectrofotometra, la intensidad es proporcional
a la cantidad de antiinmunoglobulina marcada
captada, que a su vez es proporcional a la
cantidad de anticuerpos presentes en el suero
problema.

ELISA COMPETITIVO
Puede utilizarse para la determinacin de Ac o
de Ag.
Se establece una competencia entre los
anticuerpos del suero problema y UN
ANTICUERPO SECUNDARIO (conjugado).
La muestra se incuba con el antgeno conocido
para la formacin de los inmunocomplejos.
Luego se agrega el conjugado que contiene un
anticuerpo especifico secundario MARCADO
ENZIMATICAMENTE.
Este anticuerpo se unir a el antgeno libre del
fosito. (SUEROS NEGATIVOS). Esta reaccin es
la que se colorea.
POR LO TANTO LAS MUESTRAS
POSITIVAS NO TOMAN NINGN
COLOR PORQUE LA ENZIMA NO SE
LIGA AL COMPLEJO ANTGENO
ANTICUERPO QUE SE FORM.
Cuanta mas inmunoglobulina haya en la muestra
menos antgeno habr quedado disponible para
unirse a los anticuerpos secundarios.
La adicin del anticuerpo marcado especifico y
su reaccin con el sustrato revela la existencia o
no de antgeno libre, en una relacin
inversamente proporcional a la cantidad de
anticuerpos presente en la muestra.
ELISA DIRECTO
En la placa de poliestireno se encuentra el
anticuerpo especifico para detectar el antgeno
en la muestra.
La solucin de conjugado contiene la enzima
ligada con un segundo anticuerpo especifico
conocido que se une por otro eptopo al
antgeno.
El antgeno queda capturado en una especie de
SANDWICH.
El cambio de color al agregar el sustrato
demostrara la presencia del antgeno.
La intensidad de la reaccin cromtica se
relaciona directamente con la cantidad de
antgeno.
DOT ELISA
El complejo antgeno anticuerpo se visualiza
como PUNTOS (DOT) de color sobre una
membrana de nitrocelulosa.
Es una tcnica cualitativa.
Es sencillo.
No necesita de equipo de lectura.
Pueden ser directas o indirectas.
Posee controles positivos y negativos.
Es de un solo paso.
Se puede utilizar diferentes muestras para el
anlisis.