Kü thuËt miÔn dÞch g¾n

enzyme (ELISA)
- ELISA th«ng th­êng
- ELISA tãm b¾t kh¸ng nguyªn
kiÓu b¸nh mú kÑp ch¶
- ELISA c¹nh tranh
ELISA th«ng th­êng
Kh¸ng nguyªn

B­íc 1

Mét trong sè 96 giÕng cña phiÕn nhùa polystyrene

G¾n b¶n nhùa b»ng kh¸ng nguyªn

ELISA th«ng th­êng
Protein che ch¾n
B­íc 2

Che ch¾n phÇn trèng b»ng protein

ELISA th«ng th­êng
Kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu

B­íc 3

Bæ sung kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu

ELISA th«ng th­êng
Céng hîp enzyme

B­íc 4
(kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng thÓ g¾n enzyme:
AP, HRP)

Bæ sung céng hîp enzyme

ELISA th«ng th­êng
C¬ chÊt
B­íc 4

Bæ sung c¬ chÊt
ELISA th«ng th­êng
C¬ chÊt
B­íc 5

Bæ sung c¬ chÊt
ELISA tãm b¾t kh¸ng nguyªn

Kh¸ng thÓ 1
B­íc 1

G¾n b¶n b»ng kh¸ng thÓ 1

ELISA tãm b¾t kh¸ng nguyªn

Protein che ch¾n b¶n

B­íc 2

Che ch¾n b¶n b»ng protein

ELISA tãm b¾t kh¸ng nguyªn

Kh¸ng nguyªn
B­íc 3

Bæ sung bÖnh phÈm cã chøa kh¸ng nguyªn

ELISA tãm b¾t kh¸ng nguyªn

Kh¸ng thÓ 2
B­íc 4

Bæ sung kh¸ng thÓ 2

ELISA tãm b¾t kh¸ng nguyªn
Céng hîp kh¸ng kh¸ng thÓ 2

B­íc 5 g¾n enzyme

Bæ sung céng hîp kh¸ng kh¸ng thÓ 2 g¾n enzyme

ELISA tãm b¾t kh¸ng nguyªn

C¬ chÊt
B­íc 6

Bæ sung c¬ chÊt
ELISA tãm b¾t kh¸ng nguyªn

C¬ chÊt
B­íc 7

Enzyme chuyÓn hãa c¬ chÊt thµnh hîp chÊt cã mµu

 ELISA c¹nh tranh AFB1

BSA

Céng hîp BSA g¾n

B­íc 1 Aflatoxin B1 (AFB1)

G¾n b¶n b»ng céng hîp BSA-Aflatoxin B1

 ELISA c¹nh tranh
Protein che ch¾n b¶n

B­íc 2

Che ch¾n b¶n b»ng protein (BSA, Gelatin hoÆc s÷a t¸ch b¬)
 ELISA c¹nh tranh Kh¸ng thÓ ®¬n dßng
kh¸ng AFB1 g¾n enzyme

Aflatoxin B1 (AFB1)

B­íc 3

Trén kh¸ng thÓ ®¬n dßng kh¸ng AFB1 g¾n enzyme

víi mÉu ®èi chøng vµ mÉu x¸c ®Þnh nghi lµ cã AFB1 råi ®­a vµo giÕng vµ ñ
 ELISA c¹nh tranh

MÉu ®èi chøng kh«ng cã AFB1

Trén kh¸ng thÓ ®¬n dßng kh¸ng AFB1 g¾n enzyme

víi mÉu ®èi chøng vµ mÉu x¸c ®Þnh nghi lµ cã AFB1 råi ®­a vµo giÕng vµ ñ
 ELISA c¹nh tranh

MÉu x¸c ®Þnh cã AFB1

Trén céng hîp kh¸ng thÓ ®¬n dßng kh¸ng AFB1 g¾n enzyme
víi mÉu x¸c ®Þnh cã AFB1 råi ®­a vµo giÕng vµ ñ
 ELISA c¹nh tranh

MÉu x¸c ®Þnh cã AFB1

Céng hîp enzyme-Kh¸ng thÓ ®¬n dßng kh¸ng AFB1 ®· ph¶n øng víi AFB1
cã trong mÉu th× kh«ng thÓ g¾n víi AFB1 trong giÕng vµ bÞ röa tr«i
ELISA c¹nh tranh
C¬ chÊt

MÉu x¸c ®Þnh cã AFB1 MÉu ®èi chøng

Bæ sung c¬ chÊt vµo giÕng

 ELISA c¹nh tranh
C¬ chÊt

MÉu x¸c ®Þnh chøa AFB1 cã OD thÊp h¬n MÉu ®èi chøng cã OD cao h¬n

Enzyme chuyÓn hãa c¬ chÊt thµnh hîp chÊt cã mµu

 ELISA c¹nh tranh

§¸nh gi¸ kÕt qu¶ - ®­îc biÓu thÞ

b»ng % vµ tÝnh theo c«ng thøc:

OD§C _ ODMT
A= X 100
OD§C

NÕu A > 50 % th× mÉu thö

®­îc ®¸nh gi¸ lµ d­¬ng tÝnh
 Ph­¬ng ph¸p n©ng cao ®é nh¹y cña
kü thuËt ELISA
 ¸i lùc Biotin – Avidin vµ øng dông ®Ó
n©ng cao ®é nh¹y cña kü thuËt ELISA
O

HN NH

Biotin
Ph­¬ng ph¸p n©ng cao ®é nh¹y cña
kü thuËt ELISA

HN NH

Avidin

Avidin cã ¸i lùc rÊt m¹nh víi Biotin

Ph­¬ng ph¸p n©ng cao ®é nh¹y cña kü thuËt ELISA

HN O

NH

O
HN NH

NH HN

V× vËy, ng­êi ta g¾n Biotin víi kh¸ng thÓ

Ph­¬ng ph¸p n©ng cao ®é nh¹y cña kü thuËt ELISA

Enzyme

Avidin

Vµ g¾n enzyme víi Avidin

Ph­¬ng ph¸p n©ng cao ®é nh¹y cña kü thuËt ELISA

Sau khi cho kh¸ng thÓ g¾n biotin kÕt

hîp kh¸ng nguyªn
S

S
HN NH

O
HN NH

Kh¸ng thÓ g¾n biotin

S

NH

HN
O

Kh¸ng nguyªn
Ph­¬ng ph¸p n©ng cao ®é nh¹y cña kü thuËt ELISA
Ng­êi ta sÏ bæ sung Avidin g¾n
enzyme

S
HN NH

O
HN NH

Avidin
O

Avidin
Kh¸ng thÓ g¾n biotin S

NH

HN
O

Kh¸ng nguyªn
Ph­¬ng ph¸p n©ng cao ®é nh¹y cña kü thuËt ELISA
Råi bæ sung c¬ chÊt
C¬ chÊt

S
HN NH

O
HN NH

Avidin
O

Avidin
Kh¸ng thÓ g¾n biotin S

NH

HN
O

Kh¸ng nguyªn
 Ph­¬ng ph¸p n©ng cao ®é nh¹y cña kü thuËt ELISA
§é nh¹y cña ph¶n øng sÏ ®­îc t¨ng lªn
rÊt nhiÒu

S
HN NH

O
HN NH

Avidin
O

Avidin
Kh¸ng thÓ g¾n biotin S

NH

HN
O

Kh¸ng nguyªn
Kü thuËt Western blot

Protein träng l­îng ph©n tö cao

Protein träng l­îng ph©n tö thÊp

B­íc 1: T¸ch protein b»ng ®iÖn di

trªn gel polyacrylamide
 Kü thuËt Western blot

B­íc 2: ChuyÓn protein tõ gel sang mµng (PVDF) nhê ®iÖn tr­êng
 Kü thuËt Western blot
Kh¸ng thÓ
®Æc hiÖu

B­íc 3: Nhuém mµng b»ng kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu

 Kü thuËt Western blot
Céng hîp (kh¸ng thÓ
kh¸ng kh¸ng thÓ g¾n
enzyme)

B­íc 4: Nhuém mµng b»ng céng hîp (kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng thÓ g¾n enzyme)
 Kü thuËt Western blot
C¬ chÊt

B­íc 5: Bæ sung c¬ chÊt cho enzyme chuyÓn hãa ®Ó cã thÓ nh×n thÊy
vÖt protein ph¶n øng víi kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu trªn mµng.
 Kü thuËt Western blot

Enzyme sÏ chuyÓn hãa c¬ chÊt thµnh hîp chÊt cã mµu cã thÓ nh×n thÊy trªn mµng.
Nh­vËy chØ vÖt protein nµo ph¶n øng víi kh¸ng thÓ th× míi hiÓn thÞ trªn mµng.
 Kü thuËt Western blot

Ph¶n øng cña c¸c thµnh KN kh¸c nhau cña c¸c chñng vi
khuÈn Pasteurella multocida g©y bÖnh tô huyÕt trïng ë
tr©u bß víi kü thuËt Western blot
 Kü thuËt Western blot

Gp120

Gp41

p24 p24

Kü thuËt Western blot chÈn ®o¸n HIV b»ng viÖc ph¸t hiÖn
kh¸ng thÓ kh¸ng HIV trong huyÕt thanh bÖnh nh©n