Universidad de Carabobo

Facultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Medicina Dr. Witremundo Torrealba
Campus La Morita

Tcnicas en
Bioqumica
Profa. Fabiola Sarco Lira.

Abril, 2013

Univ. Ismar Romero.

Univ. Jos Rojas.
Univ. Kelvin Rojas.
Univ. Victor Rojas.
Grupo #03

Electroforesis
Es una tcnica para la separacin de molculas
que se basa en la migracin de solutos inicos
bajo la influencia de un campo elctrico; estas
partculas migran hacia el ctodo o nodo, en
dependencia de una combinacin de su carga,
peso molecular y estructura tridimensional.

Ventajas

Desventajas

Separacin, visualizacin y
cuantificacin del numero de
protenas de una solucin.
Afecta la estructura de las
protenas por lo tanto, tambin
afecta a la funcin de la misma.

Movimiento inico en
un campo elctrico
Durante el proceso de migracin de una partcula cargada en un
campo elctrico, dependiendo de la carga neta ocurrir lo siguiente:
a. Si la partcula posee carga + se mover hacia el ctodo.
b. Si la partcula posee carga se mover hacia el nodo.
c. Si la partcula no posee carga no se mover

Electroqumica moderna, Volumen 1.

John O'Mara Bockris

En la electroforesis, la fuerza
que mueve la macromolcula
es el potencial elctrico, E,
expresada en voltios/cm.
La movilidad electrofortica
de la molcula, , es el
cociente entre la velocidad de
la partcula, V, expresada en
cm/seg,
y
el
potencial
elctrico.
La movilidad electrofortica
esta expresada en cm2 /(V)(s)
La movilidad depende de la
carga de la partcula que, a su
vez, depende del pH del medio
en el que se encuentre.

Principios de
Bioqumica
Lehninger

Proceso Electrofortico
Electroforesis libre:
Una disolucin tamponada
de la mezcla de protenas
se coloca en una clula de
observacin en forma de U.

Electrod
os
Buffe
r

Protenas
disueltas en
el buffer
http://pt7mdv.ceingebi.unam.mx/computo/pdfs/met/Electroforesis/Electroforesis/Introduccion
/BoundaryElectr.jpg

Electroforesis de zonaLa disolucin a tratar se

aplica como una mancha , o
:

como una banda, y las

partculas migran a travs
del disolvente, utilizando
adems
un
medio
de
soporte
inerte
y
homogneo,
tal como el
papel o ciertos tipos de
geles.

Bioqumica
Christopher K.
Mathews

Cmaras Electroforticas
Cmaras
horizontales
En la electroforesis de
tipo
horizontal
generalmente,
se
trabaja con ADN o ARN.

Cmaras verticales

En la electroforesis de
tipo
vertical,
se
analizan
tanto
molculas
de
ADN
como protenas.

Medios de Soporte
Mtodo sencillo y rpido

Pape
l

Protenas
Oligonucletido
Separacin de:
s
Carbohidratos
Lpidos

Desventaja
s

Se desgarra fcilmente
Distorsiona las bandas
Se produce interaccin
entre las protenas y los
grupos hidroxilo de la
celulosa, por lo tanto la
migracin se frena

Se usa en el anlisis de fluidos

biolgicos
Acetato de
Celulosa

Tiempo de anlisis corto

Sencillez de la tcnica
Desventaja: Su dbil resolucin

Gran parte de los grupos hidroxilo de la celulosa se

han esterificado por acetilacin, por lo que no hay
interaccin con las protenas.

Almidn
rpida

Gel

Tcnica barata, fcil y

Poliacrilamida

Agarosa

Soporte mas
usado en
electroforesis
De alta resolucin
Sus componentes
son txicos

Buena resolucin
Separacin de
molculas grandes
con radio mayor a
5-10nm (virus,
cidos nucleicos)

Factores que afectan la

Electroforesis
Carga neta
Tamao
Intensidad del campo elctrica
Temperatura
Medio de soporte
Buffer

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Qu es la poliacrilamida?

Polmero generado a partir de acrilamida y

bisacrilamida. Forma un gel con poros y se usa
para realizar electroforesis de macromolculas,
en especial protenas y fragmentos de cidos
nucleicos.

http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/electro_def.html

Como se realiza la electroforesis

en gel de poliacrilamida?

Primeramente se necesita el gel de

poliacrilamida, quien funciona como filtro gracias
a su estructura porosa.

http://www.esacademic.com/dic.n
sf/eswiki/943905

http://clinicalmedicine.blogfa.com/post-544.aspx

Como se realiza la electroforesis

en gel de poliacrilamida?

Colocar las muestras en los

pocillos.
Se aplican cargas elctricas

http://biomodel.uah.es/biomo
delmisc/anim/elfo/electrof.html

http://preguntassobrecienciaymas.blogspot.com/2012/03/electro
foresis-monografia.html

Como se realiza la electroforesis

en gel de poliacrilamida?
Aplicar un colorante tal como el azul de
Coomassie.

http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo14.htm

Electroforesis en gel de
poliacrilamida en SDS
Es otra tcnica electrofortica tambin aplicada en
protenas en la que las mismas sufren
desnaturalizacin.

SDS?
De que habla?

El SDS (Dodecilsulfato sdico) es un compuesto

desnaturalizante con una carga fuertemente negativo.

Como se realiza la electroforesis

en gel de poliacrilamida SDS?

Primero deben
desnaturalizarse las
protenas.
http://ahorrarnoshacebien.com/articulos/agua-mitorealidad.html

En presencia de SDS la
protena:

http://mariajosevegamiranda.blogspot.com/2012
/11/proteinas.html

http://cvclavoz.com/blog/para
lelo/page/6/

http://bioquimica6ce.wikispaces.c
om/Proteinas

Como se realiza la electroforesis

en gel de poliacrilamida SDS?

Se colocan las
muestras en los
pocillos y se aplican
las cargas elctricas.
http://farmacologiabasica.blogspot.com/2008/08/elec
troforesis-en-gel.html

Se visualizan
aadiendo un
colorante como el azul
de Coomassie
http://coleccion.educ.ar/coleccion/CD17/contenidos/mt/biolo
gia/tecnologiaadn/estudiar_expresion_gen.html

Electroforesis bidimensional
Qu es?
Es una tcnica para la separacin de
mezclas complejas de protenas, ya que la
misma
permite
la
separacin
y
visualizacin de hasta 1.000 protenas
diferentes en un solo gel.

Cul es el procedimiento para la

electroforesis bidimensional?
Punto Isoelectrico
Se establece un gradiente de pH.

Se incorpora una
mezcla de
anfolitos.

Lehninger 5ta edicin

Cul es el procedimiento para

la electroforesis bidimensional?
Primera dimensin

. pI decreciente

El gel se coloca sobre un

gel de poliacrilamida SDS

Segunda dimensin
Electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS

Peso molecular
decreciente
pI
decreciente

Lehninger 5ta edicin

Electroforesis en gel de
agarosa
o Es una tcnica utilizada para fragmentos grandes
de ADN.
Agarosa?
La agarosa es un polmero de galactosa

http://www.ecogen.com/producto.asp?id=196

Cmo se lleva a cabo la

electroforesis en gel de agarosa?

Primero se debe mezclar el polvo de agarosa con

un buffer.

http://www.ugr.es/~mgarrido/Protocolos.html

Cmo se lleva a cabo la

electroforesis en gel de agarosa?

http://html.rincondelvago.com/electroforesis-de-acidosnucleicos.html

Cmo se lleva a cabo la

electroforesis en gel de agarosa?

http://oldearth.wordpress.com/2008/10/16/experimentos-debiologia-molecular-1-electroforesis/

La Espectrofotometra
Es una de las tcnicas experimentales
ms utilizadas para la deteccin
especfica de molculas. Se caracteriza
por su precisin, sensibilidad y su
aplicabilidad a molculas de distinta
naturaleza
(contaminantes,
biomoleculas,
etc)
y
estado
de
agregacin (slido, lquido, gas)

Principios de la
Espectrofotometra

Todas las sustancias pueden absorber energa

radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe radiacin
de longitudes de ondas que no pertenecen al
espectro visible; el agua absorbe fuertemente en
la regin del infrarrojo.

 La absorcin de las radiaciones ultravioletas,

visibles e infrarrojas depende de la estructura de
las molculas, y es caracterstica para cada
sustancia qumica. En el proceso de absorcin de
la radiacin, un fotn incidente cede su energa a
una molcula, lo que da lugar a la excitacin de la
misma que pasa a un nivel de energa superior.

 Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la

energa es absorbida; la energa radiante no puede
producir ningn efecto sin ser absorbida. La
frecuencia
de
la
radiacin
absorbida
es
proporcional a la diferencia de energa entre ambos
niveles.

 El color de las sustancias se debe a que stas

absorben ciertas longitudes de onda de la luz
blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar
a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no
absorbidas.

 La espectrofotometra se basa en dos leyes que

relacionan la absorcin de luz a una determinada
longitud de onda con la concentracin del material
absorbente y la longitud del camino que debe
atravesar. Estas dos leyes, que combinadas
resultan en la ley de Lambert-Beer

Espectro de absorcin
Representacin grfica de la absorbancia de un
analito (o de otra magnitud equivalente) en funcin
de la longitud de onda de la radiacin, l, (o de otro
parmetro relacionado con la energa de la radiacin
utilizada).

Ley de Lambert Beer

ASPECTOS TERICOS
La fotometra

Medicin
de luz

La espectrofotometra
La colorimetra

Luz
monocromtica

Leyes de
Lambert y Beer

Lambert y
Beer
relacionan

La medida de la absorcin

El espesor de la sustancia absorbente

La cantidad de sustancia que absorbe

observando
crecimiento exponencial de la absorcin
de radiacin
En Funcin de

espesor de la regin absorbente

la cantidad de esa especie

Ley de Lambert Beer

Ley de Lambert:
Medio absorbente

la cantidad de luz absorbida por

un cuerpo depende de la
concentracin en la solucin

Intensidad transm.

1. Agua con azcar disuelta.

2. Agua con mayor cantidad de azcar.

Ley de Lambert Beer

Ley de Beer:

La cantidad de luz absorbida por

un objeto depende de la distancia
recorrida por la luz

Sustancia absorbente

Intensidad trans.

1. Agua con azcar disuelta.

2. Agua con azcar disuelta
en un vaso con mayor
dimetro.

Ley de Lambert Beer

Estas dos leyes se combinan en la ley de
Lambert-Beer:

Relaciona la absorcin de luz con las

propiedades del material atravesado,
relaciona la intensidad de luz entrante en
un medio con la intensidad saliente
despus de que en dicho medio se
produzca absorcin

http://absorcion-atomica.blogspot.com/2009/08/la-absorbancia-de-

Ley de Lambert Beer

Transmitancia (T)
Es la fraccin de radiacin incidente transmitida por la solucin
Si T se expresa en %,
T % = 100 I/I0

T: I/I0

Absorbancia (A)
Es la fraccin de radiacin incidente absorbida por la solucin, expresada
como

A = -log T = -log (I/I0) = log (P0/P) = log 1/T

Si T se expresa en %

A = log100/T% = 2 -logT%

Ley de Lambert Beer

A = C . . L

La ley de Lambert-Beer establece que la

absorbancia est directamente relacionada
con las propiedades intrnsecas del analito,
con su concentracin y con la longitud de
la trayectoria del haz de radiacin al
atravesar la muestra

: Absortividad molar
Es una propiedad de la materia relacionada
nicamente con la naturaleza de la misma.
a cuando la concentracin est en mg/L
cuando la concentracin est en mol/L
L: Trayectoria de la radiacin a travs de la
muestra (cm)
C: Concentracin (mg/L mol/L)

expbasquimica-g1-zb-09-10.wikispaces.com

Skoog, D. A.; West, D. M.;Holler, F. J.;

Crouch,S. R. FUNDAMENTOS DE
QUMICA ANALTICA. Absorcin dela
luz.MacGraw Hill: Mxico.

Skoog, D. A.; West, D. M.;Holler, F. J.;

Crouch,S. R. FUNDAMENTOS DE
QUMICA ANALTICA. Absorcin dela
luz.MacGraw Hill: Mxico.

Ley de Lambert Beer

1) Una disolucin 100 M de un determinado cromforo tuvo una
transmitancia a 525 nm de 0.5 cuando se midi en una celda 1.5 cm de
longitud. Calcular: a) la absorbancia de la disolucin; b) la
absorptividad molar del cromforo.
a) A = -log T = - log 0.5 = 0.301

% Transmitancia

b) A = C . . L Reordenando la ecuacin obtendremos:

= A/(C . L) = 0.301 /(10-4M x 1.5 cm) = 2 x 103M-1cm-1

0,5

0,01

% Concentracin

Nadie puede volver atrs y

comenzar
de
nuevo.
Pero
cualquiera puede comenzar hoy
mismo y hacer un nuevo final, no te
rindas.
Annimo