La diversidad y la especificidad simbitica del

Rhizobium asociado con frjol (Phaseolus

vulgaris L.) en los centros de origen del cultivo:
Ecuador y Mxico.

Bosquejo
* Importancia del frejol (Phaseolus vulgaris)
* Centros de origen
* Diseminacion del cultivo y su Rhizobium
* Objetivos de la investigacion
* Diversidad del Rhizobium asociado con P. vulgaris en Ecuador
y comparaciones con el Rhizobium de Mexico.
* Filogenia del Rhizobium asociado con el frejol en Minnesota
como area secundaria de produccion frejolera.
* Conclusiones
* Agradecimientos

El frejol (P. vulgaris) es la leguminosa mas inportante

en el mundo (www.CIAT.CGIAR.ORG).
Alimento perfecto : proteina, fibra, carbohidratos,
vitaminas, minerales.
En paises en vias de desarrollo: alimentacion prioritaria.
Los rendimientos son bajos (~ 0.50 ton/ha)
Causas: Abastecimiento de agua inadecuado,
enfermedades, condiciones pobres del suelo (ej. bajo
N).

Centros de origen de
P. vulgaris
2500BP

Mesoamerica

Andes (South America)

4400BP

Diseminacin del frjol

700 BP
2000 BP

500 BP

Transporte del frejol desde los centros de origen a otras

regiones del mundo.
Rhizobium transportado como contaminante de semilla.
Rhizobium sobrevive en la semilla de tres a cinco anos
despues de la cosecha. (Perez-Ramirez et al. 1998).

En su nuevo hbitat el Rhizobium

habra sido expuesto a diferentes
condiciones ambientales.
Efectos founder.
Posibilidad de otros Rhizobium de asociarse con Phaseolus.
A parte de implicaciones de la diversidad de Rhizobium los
cambios en microsimbionte podra impactar la eficiencia de
la interaccin hospedero-Rhizobium, nodulacin
y la fijacin de nitrgeno.

Esta investigacin examin:

- Diferencias en la biodiversidad del Rhizobium
asociado con frejol en Ecuador y Mesoamerica.
- La contribucion de otros rhizobios infectivos en frejol
a la nodulacion y fijacion del N2 .
- Las consecuencias del transporte del hospedero
y su Rhizobium sobre la simbiosis con P. vulgaris en
Minnesota como region secundaria de produccion de
frejol.

Diversidad del rhizobio asociado con Phaseolus vulgaris L.

en Ecuador, y comparaciones con el rhizobio.de Mxico.

Loja-Ecuador
Photo CIAT

Diferencias entre los acervos geneticos

de frejol Andino y Mesoamericano

- Morfologicas y agronomicas
(Singh et al. 1991)
- Moleculares (phaseolin)
(Gepts and Bliss, 1996; Koenig et al. 1990)

- Geneticas
(Koinage and Gepts, 1992)

Debilidad del Hibrido F1

genotipos (phaseolin)
S x T or C

Crecimiento reducido
Chlorosis en la hoja
Raices adventicias
Letalidad

- Topografa:
Ambientes unicos y aislados
Aislamiento geografico y genetico
- Co-evolution Frejol-Rhizobium
- Diferencias en la diversidad de Rhizobium

Rhizobium nodulando Phaseolus:

* Rhizobium etli: asociado con frejol
en los centros de origen
(Souza et al. 1994).
* R. tropici
* R. leguminosarum bv. phaseoli
* R. giardinii
* R. gallicum
* Bradyrhizobium spp.
* Dalea sp. Rhizobium

Estudios sobre la diversidad de Rhizobium

asociado con frjol
* Enfasis en R. etli y R. tropici
* Rhizobium del centro de origen Mesoamericano
Diversidad genetica alta
(Pinero et al., 1988; Souza et al., 1994).

Inclusion del Rhizobium de Dalea ?

Dalea spp. son nativas de esta region.
(Barneby, 1981, 1988, 1990)

Rhizobium de Dalea nodula y fija N2 con frejol.

(Graham et al., 1999)

 s t e e s t u d i o:

1. Contrasta Rhizobium de los Andes

(Ecuador) y Mesoamerica usando
mtodos fenotpicos y filogenticos.

2. Examina diferencias en el nmero y

diversidad del Rhizobium de frjol
aislados del suelo usando germoplasma
Andino (Ecuador) y Mesoamericano
como hospederos.

Materiales y Mtodos
Cepas (103) : Ecuador, Mexico, Peru, Argentina.
Cepas control.
Caracterizacion fenotipica:
-

Fuentes de C and N
Antibioticos
Metales pesados
Vitaminas
Tolerancia a NaCl
Crecimiento en pH: 4.5, 5.0 and
8.5
- TY-Ca and LB
Crecimiento (28C): 7 days

Rango hospedero
Phaseolus
Macroptilium
Leucaena
Dalea
Coronilla
Onobrychis
Nodulacion evaluada a los 21 dias

Indices de similaridad: NTSYSpc,UPGMA.

Analisis de clusters

Principio del fingerprint genmico BOX-PCR

1.

2.

3.

Elementos
repetitivos (BOX)
conservados

Gnoma
bacteriano
Amplificacin de las regiones
Genmicas usando el primer BOX

T
Time
35 ciclos PCR

Source: Rademaker et al., 1997

Versalovic et al. 1994

BoxA1R- PCR
Comparar cepas de Ecuador y Mexico (celulas enteras).
Estudiar biodiversidad del Rhizobium aislado del nodulo.

1 Kb DNA
ladder
(bp)
2036
1636
1018

506

220

Anlisis asistido por

computadora

Fingerprint
Captura de la imagen
Conversion
Normalizacion
Curva densitometrica
Correlacion Pearsons
UPGMA
Analisis de clusters
Dendograma
Courtesy: Dr. Mike Sadowsky

Diversidad Gentica (DG):

Shannon-Weaver index
(Goodwin et al., 1995; Mahuku et al., 1998; Coutinho et al., 1999)

H = - pi x ln pi
H = DG
pi = frequencia of aislamientos pertenecientes
a cada clase de bandas.
ln = log natural
aislamientos

Nmero ms probable (Fundas de crecimiento):

Para determinar la influencia del origen del cultivar de

frjol en el nmero (cells/g soil) y diversidad de
Rhizobium.

Suelos:

Poconichim (Chiapas - Mexico)

Cotacachi, Caicapac, Mater (Ecuador).

Cultivares:

Puebla 152 (Mexico)

Bolones: 6, Caicapac, y Mater (Ecuador).
Dalea aurea y D. leporina

- Cuatro reps por cada dilucion 10X del suelo

- Crecimiento de plantas en camaras de crecimiento
(14h fotoperiodo y 25/18 C dia/noche T).
- Cosecha: 5 semanas despues de inoculacion
- NMP (cells /g soil): MPNES (NifTAL,HI)
- Nodulos usados para estudios de diversidad.

Resultados:
Relaciones fenotpicas

Dos principales clusters:

1. Todos los aislamientos de Mxico
pero incluyo cepas nodulando
Dalea leporina y/o Macroptilium
and Leucaena, a mas de P. vulgaris.
2. Rhizobium de losAndes
- Algunos subclusters
- Alta diversidad
- Nodulacin: P. vulgaris

N and
C

P2
M

Cepas de:

M = Mexico
D = Dalea
C = Region Central (Ecuador)
N = Region Norte (Ecuador)
S = Region Sur (Ecuador)

P1

(BOXA1R-PCR) Relaciones genticas entre aislamientos de Ecuador y Mxico

Suelo / Hospedero

NMP
(cells/g soil)

D.G.

1. Poconichim/ Puebla 152

6.09 x 105

3.29

Poconichim/ Bolon 6

3.59 x 105

3.50 ***

Poconichim / Dalea

28

2. Cotacachi / Puebla 152

3.59 x 103

2.56

Cotacachi / Bolon 6

3.36 x 103

2.59

Suelo: Poconichim (Chiapas)

Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]

100

95

90

85

80

BOXA1R

75

70

65

BOXA1R

Hosp: Puebla (local)

Bolon 6 (no local)
Dalea
B22
B4
B24
B1
P14
6917
B3
P22
P24
P13

Phaseolus rhizobia

P16
B11
B17
P4
P21
B21
P7
1632
1899

UMR1632 (R. etli)

D14

Limitada contribucion del Rhizobium de Dalea

D2
D4

D11
D24

- Baja poblacin en el suelo

- Limitada competitividad

D16
D15
D23
6815

Dalea rhizobia

Comparacin del Rhizobium aislado de sitios en

el Sur del Ecuador
Suelo / cultivar

NMP

D.G.

2.30 x 105

3.30

2.30 x 105

3.30 NS

7.81 x 105

2.68

Mater / Machete (local)

3.75 x 106

2.81***

3. Canicapac / Imbabello

3.59 x 105

3.35

5.46 x 105

3.54***

1. Mangucusana / Cargabello
Mangucusana / Bolon (local)

2. Mater / Imbabello

Canicapac / Bolon (local)

BOX A1R-PCR
Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]

BOXA1R

BOXA1R

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

Suelo: Caicapac (C )
1899
6815
CB1-6
CB1-13
CB1-23
6917
CB1-11

- Bolon local (B1)

- Imbabello (I)

CI-13
CI-18
CI-23
CI-16
CI-19
CI-5
CI-20
CB1-10
CB1-22
CB1-12
CB1-18
CB1-8

CB1

CI-8
CI-10
CI-17
CB1-5
CB1-14
CB1-2
CB1-15
CB1-19

CB1

CB1-4
CI-12
CI-2
CB1-1
CI-24
CI-21
CI-15
CI-11
CI-22
CI-1
CI-6
1632
CB1-9
CB1-20
CB1-7
CB1-25
CB1-24
CB1-3
CB1-17
CB1-16
CI-3
CI-25
CI-7

CB1

Suelo Mater (M)

100

95

90

85

80

75

65

60

55

50

45

40

35

30

25

20

BOXA1R

70

BOXA1R-PCR

Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]

6917
MMA-14
MMA-15
MMA-21
MMA-18
MMA-25
MMA-16
MMA-1
MMA-5
MMA-7
MMA-10

Cultivar Machete (MA)

MMA-8
MMA-2
MMA-13
MMA-6

LOCAL

MMA-17
MMA-24
MMA-11
MMA-19
MMA-22
MMA-12
MMA-3
MMA-4
MMA-20

Similaridad con la cepa UMR1632 (R. etli).

MI-15
MI-20
MI-13
MI-10
MI-5

Ningun aislamiento se agrupo con otras

cepas referencia.

MI-3
MI-16
MI-25
MI-19
MI-7
MI-17
MI-22
MI-14
MI-6
MI-23
MI-2
MI-4
MI-18
MI-8
MI-12
MI-11
MI-9
MI-24
MI-21
MMA-23
1632
MMA-9
6815
1899

Cultivar
Imbabello (I)

Aislamientos de los Andes:

- La mayora perteneci a R. etli
- Rango hospedero limitado
- Caracterstica de la reiteracin del gene nifH

Bernal, 1993

Hemos demostrado:
1) Separacion fenotipica y filogenetica
significante.
2) Cultivar puede influenciar la diversidad
genetic de las cepas.
3) Otros rhizobios a mas de R. etli pueden
jugar un rol en la nodulacion del frejol en
Mesoamerica.

- Co-evolucion

Frejol-Rhizobium

- Especificidad
- Factores que contribuyen con las
diferencias en la respuesta simbiotica
(Andes).
- Implicaciones en el campo.
- El frejol: deficiente en nodulacion y
fijacion del N2

Filogenia del Rhizobium asociado con frejol en Minnesota

como una region secundaria de produccion .

Restos de semillas de frjol:

*
*
*
*
*

Mogollons (New Mexico) 300 BC

Hohokam ( Sur de Arizona) 500 AD
Anasazi (Norte de Arizona) 500 AD
Gran Planicies (1070 AD)
Norte-Noreste (1300 A D)

- Minnesota: 5th en la produccion de frejol en los U.S.

- 80000 ha son cultivadas anualmente en MN.
- Simbiosis podria haber resultado del Rhizobium:
* contaminante de la semilla
* Rhizobium de pradera: Dalea spp.
- Dalea y otras leguminosas de pradera han
existido en Minnesota por casi 7000 anos.
- Desde 1800s han sido restringidas a
pequenas areas rodeadas por campos
agricolas.

Frjol en Minnesota es raramente inoculado

- R. etli ?
- Rhizobium (Dalea spp.) ?

Objetivos:
- Examinar el Rhizobium asociado con frjol en
Minnesota.
- Determinar si efectos founder en R. etli o la
introgresion de otros micro-symbionts de leguminosas
de pradera podrian estar afectando la nodulacion y la
fijacion del N en frejol.

Materiales y Mtodos

Suelos:
- Staples (S)
- Verndale (V)
- Park Rapids (PR)
Areno-arcillosos (UdicArgiborolls)
77.3%, 92.7% and 89.4%
arena, respectivamente.

Cepas referencia :
UMR 1632
UMR 1899
UMR 6917
UMR 6918
UMR 6815
Rhizobium )

(
(
(
(
(

R. etli )
R. tropici )
R. giardini )
R. gallicum )
Dalea

Cepas referencia adicionales:

Simbiontes de:
- Oxytropis, Astragalus (Laguerre et al., 1997)
- Medicago (Eardly et al., 1992)
Representantes de:
- R. etli
- R. spp. (Dalea)
- R. gallicum
- R. giardinii
- R. leguminosarum

- Nmero Ms Probable (cells/g soil):

Bean cultivar : Montcalm
- Anlisis de fingerprints
BOX A1R-PCR
(Nodules from plants used in MPN)
- Anlisis cuantitativo (Bio-Numerics)
- Diversidad Gentica (DG)

Cepas representativas:
S34, S20, S3, V34, V33, PR30, PR7.

Fatty Acid-methyl ester (FAME)

(Jarvis and Tighe, 1994). Analytical Service Laboratory (VT-USA)

Anlisis del gene 16S RNA

(van Berkum and Fuhrmann, 2000, USDA-Beltsville )

Comparison fenotpica

Crecimiento en medio BYMA con:

Nalidixate de sodio (40 ugmL-1)
Streptomicina (3-5-10-25-50-100 ugmL-1)
Spectinomicina (5 ugmL-1)
Rifamicina (10 ugmL-1)

LB
PY-Ca
TY-Ca
Medio TY pH 4.5 y 8.5
Eritritol como fuente de C
Produccion de melanina

Rango hospedero
Phaseolus vulgaris (cv Montcalm)
Dalea leporina
Onobrychis viciifolia (sanfoin)
Medicago sativa (cv Saranac)
Macroptilium atropurpureum (siratro)
Coronilla varia (crownvetch)
Leucaena leucocephala

Zona de pelos
radiculares
maduros
Zona de pelos
radiculares en
desarrollo
Zona sin pelos
radiculares
(celulasinfectibles)

Marca del apice

radicular
Source: Bhuvaneswari et al., 1981

Resultados
Relacin filogentica entre aislamientos del ndulo.
Sitios: Staples, Verndale, y Park Rapids (MN).
Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

BOXA1

PR13
PR12
PR17
PR7
PR9
PR18
PR22
PR29
PR35
6815 (Dalea)
S25

Rhizobium sp.(Dalea)

V24
PR32.
V25
V36
V32
V23
V33
V26
6917(H152)R.giardinii
PR30
PR31

R. giardinii

V27
S14
V35
V30
S21
S6
S16
S3
S7
S29
S31
S11
S27
S2
S20
S33
S1
6002Rleguminosarum

R. leguminosarum

6918(R602)R.gallicum
PR3
PR19
V34

R. gallicum

V21
V19
V28
V20
V31.
1632 (R.etli)
1899(R.tropici)
S34
S24.

R. etli
R. tropici

Relacin filogentica entre rizobios del ndulo.

Representativos de Staples, Verndale, y Park Rapids,
y cepas de referencia adicionales.
Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

BOXA1

3121(O.riparia)
USDA1002(S.meliloti)
6815 (Dalea)
6871(Dalea)
PhF29 (R.gallicum)
PhP222 (R. gallicum)
PhI21(R. gallicum)
6918(R602)R.gallicum

Siete clusters mayores

fueron generados.

6002Rleguminosarum
PR30

PR31
V27
S14
V35
V30
S21
S6
S16

S3
S7

V23, V32, V26

(Verndale)
se agruparon con las
cepas de R. etli
UMR1057 y UMR1580.

S29
S31
S11
S27
S2

3
4

S20
S33
S1
V25
V36
V40
V32
V23
V33

1580 R.etli (M)

V26
1057 R. etli (M)
PhF28 (R. giardinii)
Ro17 (R. giardinii)
H241(R. giardinii)
6917(H152)R.giardinii
Ro68 (R. giardinii)

El resto de cepas (42)

no fueron similares a
cualquier otra especie
de Rhizobium usadas
como referencias.

S25
V24
PR3
PR19

V34
V21
V19
V28
V20

1577 R. etli (M)

1632 R. etli (M)
PR13
PR12
PR17
PR7
PR9
PR18

PR22
PR29
PR35
1899(R.tropici)
3135(A.sinicus)
3119 (O. riparia)
S34
3348(A.alpinus)
6803(Dalea)

Cepas
Fatty acid
(acidos grasos)

PR30

S3

S20

V33

(1)

(2)

(3)

(4)

15:0 2OH
16:0
16:0 3OH
17:0
18:0
19:0 cyclo w8c
20:3 w6,9,12c
Unknown 14.952
Unknown 18.080
Sum. feature 3
Sum. feature 4
Sum. feature 7

0.98
1.05 1.17 1.02
1.08
nd
1.07
2.22
2.10 2.68 2.69
2.55
6.49
4.86
0.85
1.09 0.97 0.88
1.06
3.57
0.80
0.44
0.36 0.81 1.23
0.81
1.44
nd
9.53
9.09 10.20 7.87
8.03
3.61 11.47
6.79 11.04 13.72 6.90 10.79 34.94
7.25
0.95 1.73 1.44 1.31
1.37 1.45
1.18
0.83
nd
0.64 1.06
0.61 0.45
0.91
1.88 1.95 5.83
nd
4.81 0.62 5.14
5.97 5.73 5.51 6.29
5.37 1.25
6.67
0.57 0.44 0.45
nd
0.59 0.31
0.83
68.97 64.84 54.97 70.09 62.56 39.42 59.83

Sum. feat.3: 12:0 ALDE and unknown 10.928

Sum. feat.4: 16:1w7c/15 iso 2OH and 15:0 ISO 2OH/16:1w7c
Sum. feat.7: 18:1 w7c/w9t/w12t and 18:1 w9c/w12t/w7c

V34
(5)

PR7

S34

(6)

(7)

46.230

S20

S34
V34
S3

41.100

FAME
(cidos grasos)

PR30
V33

Principal Component 2

35.969

30.839
PR7
25.708
R. gallicum
R. leguminosarum
18
13
R. etli 17
21

15.448

10.317

24
* *
*
11
* *20 22 *
R. giardinii 16* 19
*
*
10
**12
26
25
*9
23
*27
15
*
*
*
14**

20.578

ici
p
o
tr
R.
2

*
-11.759

* *

3.471

**
*
8
**5
6

18.701

33.930

49.160

Principal Component 1

64.390

Cepa BOX-PCR
N0
Grupo
cepas

Cepa de refer.
mas similar

PR30
1
leguminosarum

Ninguna

R. gallicum

R.

S3
2
leguminosarum

11

Ninguna

R. etli

R.

S20
3
leguminosarum

Ninguna

R. leguminosarum

R.

V33

Ninguna

R. gallicum

R. etli

V34
5
leguminosarum

R. etli

R. etli

R.

PR7

Ninguna

S34

Rhizobium sp.
(Dalea)

FAME

16S rRNA

R. rhizogenes

R. tropici

R. leguminosarum

R. leguminosarum

Un numero significante de rizobios de

Staples, Verndale y Park Rapids presentan un
considerable overlap.
R. leguminosarum
R. etli
R. gallicum
Se justifica un analisis mas detallado
de sus diferencias y semejanzas.

Suelo / Hospedero

NMP
(cells/g soil)

Staples / Montcalm

2.30 x 105

2.96

Verndale / Montcalm

3.59 x 105

2.99NS

Park Rapids / Montcalm

6.13 x 104

2.98

Mexico:
Ecuador:

D.G

3.39
3.01

Ni

R. etli
ni

Rhizobium (Dalea)
son contribuyentes mayores a
la
diversidad de Rhizobium en
Staples, Verndale y Park Rapids
en
Minnesota

65

Velocidadad de
Nodulacin.

PR9
PR29
60
V33
6918

55

1899

PR30
V34

PR7

S20

S34
1632

P R N ( %)

50
S25

45

R. giardinii

S3

6917
40
6815

Rhizobium sp. (Dalea)

35

30
3

3.2

3.4

3.6

3.8

4
U M N ( mm )

4.2

4.4

4.6

4.8

Baja poblacin de R. etli ?

- Uso persistente de streptomicina en la semilla.
- Las cepas PR30, S20, PR7, S34 fueron tolerantes
a 5 10 ug/mL streptomicina.
[Ninguna cepa referencia creci en 5 ug/mL,
excepto Ro17 (R. giardini) and UMR1899 (R. tropici)].

- Analoga a la tolerancia de metales en suelos

contaminados. (Giller,1998)

Actividades actuales:
- Fincas comerciales de frejol (adicionales)
- Areas virgenes en villas de Nativos
Americanos.
- Fincas organicas.
Origen de la semilla en la region?

Conclusiones

Significante separacin fenotpica y filogentica.

Efecto del cultivar local o introducido (implicaciones en el
campo).
Otros rizobios diferentes a R. etli pueden jugar un rol en
la nodulacin del frjol en Mesoamerica.
Diferencias marcadas de las cepas de MN comparadas con
las cepas de Mesoamerica y Andes.
Overlap : R. etli, R. leguminosarum, R. gallicum.
Ni Rhizobium. giardinii ni R. de Dalea son competitivos
in nodular frjol.
Efecto de las prcticas agrcolas en la diversidad

Agradecimientos

Peter Graham (Advisor)

Iris Charvat (Thesis reviewer)
Michaell Russellee (Thesis reviewer)
Terry Cooper
Carroll Vance
Christopher Bingham

Rhizobium Research Lab.

Peter
Irene
Becky
Julie

Phillippe Seguin

Catherine Brown

Johanna Keyes

- Microbial Ecology Lab.

- E. coli Lab.
- Crop Physiology Lab.

FUNDACYT (Ecuador)

NSF Biocomplexity

CRSP

Amazon Region-Ecuador