Curso de Biologa Molecular Avanzada

Terapia gnica,
inmunizacin con ADN:
conceptos, aplicaciones
y retos

Objetivos
1- Comprender los conceptos esenciales relacionados
con la terapia gnica y la inmunizacin con ADN.
2- Conocer las aplicaciones fundamentales de la
inmunizacin con ADN y la terapia gnica.
3- Lograr un primer acercamiento a las reas en
desarrollo de la inmunizacin con ADN y la terapia
gnica.

Terapia gnica
Administracin de un cido nuclico,
capaz de modificar la expresin en
el hospedero de una protena o
pptido de inters, con el objetivo de
modificar una funcin particular
del organismo que permita la
prevencin o el tratamiento de
determinada enfermedad.

Tipos de terapia gnica

- De lnea germinal
- Somtica
Mtodos
- Un gen normal es insertado en una ubicacin inespecfica del genoma para
asumir la funcin del gen no-funcional.
- Un gen anormal puede ser sustituido por uno normal por recombinacin
homloga.
- El gen anormal puede ser reparado por mutacin reversa selectiva, lo cual
restablece la funcin normal.
- La regulacin de un gen particular puede ser alterada (el grado a travs del
cual el gen es encendido o apagado, o se controla la expresin del mismo).

Vectores en terapia gnica

Virus
Retroviruses
Adenoviruses
Adeno-associated viruses
Envelope protein pseudotyping of viral vectors
No-virales
ADN desnudo
Oligonucletidos
Lipoplexes and polyplexes
Mtodos hbridos
Dendrmeros

ARN de interferencia y las estrategias

de silenciamiento gnico
El futuro ms prometedor?

Inmunizacin con ADN

Administracin de un ADN, capaz de
expresar en el hospedero una
protena o pptido de inters, con el
objetivo de inducir una respuesta
inmune adecuada contra el antgeno
codificado que permita la prevencin
o el tratamiento de determinada
enfermedad.

Inmunizacin con ADN

Induccin de respuesta inmune adecuada
- Tipo: Humoral, celular, o ambas
- Especificidad
- Magnitud
- Sostenibilidad
Factores
- Principio activo
- Adyuvante
- Aditivos, incluyendo preservante
- Mtodo de liberacin
- Esquema de inmunizacin: Cantidad de ADN, va de inmunizacin,
nmero e intervalo entre las dosis

Qu se inocula en la inmunizacin con ADN?

ADN, principalmente plasmidios
Pero tambin
- lpidos, protenas, micropartculas, oro, adyuvantes, facilitadores,
incluso clulas

Mecanismo de accin

Lecciones de la inmunologa de tumores y

virus
Para la presentacin de los antgenos virales o
tumorales a las clulas T:
Presentacin directa
Presentacin cruzada: va CPAs

La presentacin cruzada depende de la

estabilidad de la protena (antgeno del tumor o
del virus)
Antgenos degradados rpidamente no son
presentados de forma cruzada
Wolkers et al., Norbury et al., Science 2004

Principio activo
ORI

promotor CMV
Gen de inters
pcDNA3.1+

Marcador
de seleccin

Cola poli-A

Vectores
Origen de replicacin en bacterias: pUC: 30 mg/L
Sitio mltiple de clonaje
Unidad transcripcional efectiva en el hospedero
Gen de inters, optimizacin de la secuencia y los codones
Marcador de seleccin
Otros: Enhancers (intrn A), secuencia de Kozak, unidad transcripcional
para gen inmunomodulador
Variantes ms reducidas: miniplasmidios

Cmo se inocula en la inmunizacin con

ADN?
Inyeccin
Sistemas de propulsin: BioJector, Accell Gene-gun, PowderJect,
Equidyne, IMULE, INJEX, etc
Sprays
Chips
Supositorios
Parches
Geles
Electroporacin

Vas de inmunizacin
Intramuscular
Intradrmica, intraepidermica
Subcutnea
Intravenosa
Intraperitoneal
Intranasal- instalacin, inhalacin, inyeccin y canulacin
intratraqueal
Intraheptica
Intravaginal

Tejidos y rganos dianas

Piel
Msculo
Sistema respiratorio
Sistema digestivo- yeyuno, placas de Peyer, higado
Sistema circulatorio
Sistema genitourinario
Huevos o embriones

Diferencias entre ellos

- Clulas transfectadas
- Clulas presentadoras de antgenos
- Cantidades de ADN administradas
- Tiempo de expresin del antgeno
- Respuesta inducida ??

Cronologa de eventos ms
relevantes
93 Primera descripcin de proteccin
en un modelo animal
95 Primer ensayo clnico
97 Guas OMS
98 Primer reporte de respuesta inmune
en humanos
01 Primer reporte de eficacia en
humanos
04 Primera solicitud de licencia (USAvet)

Inmunizacin con ADN evaluada en

la bsqueda de soluciones para:
- Agentes infecciosos: HIV, HBV, HCV, HPV, malaria,
influenza, meningitis, dengue, etc
- Cncer: linfomas, melanoma, papiloma, cncer de
ovario, cncer de mama, carcinoma de pulmn y renal
- Enfermedades autoinmunes: Esclerosis mltiple,
diabetes autoinmune, artritis, lupus, alergias, etc

Evidencia de induccin o modulacin de

respuesta inmune en modelos animales y
en humanos

Aplicaciones
Identificacin de dianas relevantes mediante la
inmunizacin con ADN
Facilidad para evaluar
a- Inmunizacin con epitopos individuales o porciones de
antgenos
b- Inmunizacin con libreras de expresin:
- Neisseria meningitidis. Yero y cols. Vaccine 2007.
- Chlamydia pneumoniae. Li y cols. Vaccine 2006.
- Ixodes scapularis. Almazn y cols. Vaccine 2005.
- HIV. Singh y cols. J Immunol 2004.
- Otros: Plasmodium chabaudi, Leishmania major

Soluciones concretas a enfermedades

Veterinaria
Julio del 2005
-Vacuna preventiva para salmn contra el virus de la necrosis
hematopoytica infectiva (VNHI)
- VNHI: ARN negativo simple cadena de la familia Rhabdoviridae
- Anticuerpos neutralizantes contra la glicoprotena G de
superficie
- Plasmidio que expresa la protena G del virus bajo el control de la
unidad transcripcional promotor CMV-seal poli-A de la hormona
bovina del crecimiento
- Inoculacin simple de 10 ug de ADN intramuscular*, segura,
eficaz, con proteccin sostenida hasta 1 ao despus de la
vacunacin frente a reto con VNHI.

Julio 2005
Vacuna de ADN contra el West-Nile virus
en caballo: licenciada
Plasmidio expresa prM y E del West Nile Virus
(flavivirus) administrado con un adyuvante.

Marzo del 2007

Vacuna teraputica para tratar el melanoma de perro
recibi licencia condicionada por el Departamento de
Agricultura USA

Factores relacionados con la eficacia

de las vacunas licenciadas
1- Salmn: Animal de sangre fra: Menos degradacin
potencial
2- Antgenos seleccionados
3- Elementos de respuesta inmune: Por ejemplo:
En salmn: Fuerte inmunidad innata, TLR9, solo IgM (impacto
en la avidez funcional?), carece de IL-4, 5, 9 y 13

Retos de las vacunas de ADN

Seguridad - Eficacia

Miles de individuos
vacunados en estudios
clnicos
Las vacunas de ADN han
demostrado ser seguras
A largo plazo?

Preocupaciones
Integracin del ADN
Inmunopatologas: supresin,
inflamacin, tolerancia?
Autoinmunidad
Efectos txicos de gen expresado
Impacto en la cadena de alimentacin
Impacto ambiental: altas dosis

Reto
Produccin a gran
escala, reproducibles,
con estabilidad y costo
aceptable

 Los requerimientos
evolucionan.

Tendencias:
Mayores dosis (mayores cantidades)
Plasmidios ms grandes
Especificaciones ms rigurosas
Caracterizacin ms fina y durante todo el
proceso
Requerimientos de validacin incrementadoss

El costo sigue siendo una cuestin importante

Eliminacin de impurezas
k

Endotoxin: 107 EU/mL

RNA: 100 mg/mg

< 1 EU/mL
< 0.01 mg/mg

ADN genmico y conformaciones de plasmidios

Igual estructura primaria
Diferentes tamaos y conformaciones
Diferentes cargas superficiales e hidrofobicidad

Reduccin de costo de
purificacin
k

Incremento de capacidad de resinas

Modificadores del tamao aparente del
plasmidio

Reuso de resinas
Validacin

Eliminar cromatografas
Agentes de precipitacin selectiva
Adsorbentes de bajo costo

Principal problema de las

vacunas de ADN
Eficacia limitada en
humanos

Barreras para la liberacin

eficiente in situ

Distribucin limitada del ADN en el tejido inyectado y fuera

de este (Low copies of plasmids at distal sites after
IM, Manam, 2000)
Amplia y rpida degradacin del AND por nucleasas en el
espacio extracelular (95-99 % en 90 minutos) (Barry,
1999)
Captura ineficiente del ADN por las clulas
Musculares
Presentadoras de antgenos
Fagocitosis del ADN en el compartimento degradativo

Strategias:
Incrementar la distribucin y liberacin del ADN en el tejido
Facilitar la presentacin cruzada?
Proteger el ADN y dirigirlo a clulas presentadoras
Facilitar la sensibilizacin directa?

Enfoques para incrementar la

potencia de las vacunas de
ADN
Antigeno

Modificacin del Vector

Alphavirus plasmid DNA replicons

Adyuvante

Adicionado
Codificado
Incorporado

Liberacin del ADN

Incrementar la transfeccin in vivo

Dirigir a clulas especficas

Prime-Boost

- Evaluacin clnica con virus recombinantes

(adenovirus y MVA para malaria y HIV)
- Con protena tambin para HIV

Antgeno
- Dirigir la expresin intracelular, superficial o secretada de
acuerdo a intereses
- Eliminar epitopos inmunosupresores
- Proveer epitopos especficos de linfocitos auxiliadores
- Fijar C-terminal para facilitar la presentacin a HLA clase I.
- Favorecer el procesamiento por ejemplo mediante fusin a
ubiquitina
- Expresin de poliprotenas
- Aumento de la expresin mediante mejora del vector
- Fusin con molculas que direccionen a CPAs o mejoren el
trfico intercelular: C3d, IL-2, RANTES, Hsp, dominios IgFc,
ligando del CTLA-4, VP22 del herpesvirus

Adyuvantes adicionados

Molculas recombinantes (citoquinas)

Convencionales (aluminum salts)
Experimentales (MPL, QS21)
Sintticos (R848, ubenimex)

Problema: Desfasaje espacial y temporal

Adyuvantes proteicos codificados

- Citoquinas
Chemoquinas
Molculas
coestimuladoras
Protenas proapoptticas
Complemento
Toxinas
Heat-shock proteins
PAMPs?

Modo de accin

Receptores de seales de superficie

Activacin, reclutamiento, presentacin cruzada de
clulas presentadoras de antgenos

CpG-DNA-seales celulares mediadas por TLR9

CpG =
hexmeros de
ADN no
metilado
XXCGXX

CpG-ODN

Extracellular

Intracellular
Endosome
P13K
TLR9

AP1

Especificidad
de especie
Humano

GTCGTT

ratn

GACGTT

c-JUN/ATF1
Nucleus

IRAK
TRAF6

MyD88
JNK/p38
JNKK1

NK
IB

Bovino

GTCGTT

cerdo

ATCGAT

NF-B/AP1

NF-B

(Klinmann D., 2004)

Pro-inflammatory
gene expression

 Fsico

Liberacin del ADN

gene gun
needle-free
electroporacin
sonoporacin
microagujas
Presin hidrosttica

Modo de accin
distribucin
Penetrar las
membranas

Formulaciones
nanopartculas
(CaP, chitosan, wax)
micropartculas (PLG)
Liposomas y lpidos
Pptidos o protenas que
unan AND
Clulas dendrticas
Bacterias lisgenas

Modo de accin
Proteger el
ADN
Dirigir a CPAs
liberacin
celular