Pruebas serolgicas

ELISA,IFI,HEMOAGLUTINACION

PARA TENER EN CUENTA

ANTGENO (Ag)
ANTICUERPO (Ac)

ELISA

La tcnica de ELISA es un
inmunoenzimtico.
Pasos generales de un ELISA.

procedimiento

de

ensayo

1. Retirar del refrigerador la placa sensibilizada con el antgeno y

dejar que tome la temperatura ambiente.
Lavar los pozos adicionando a cada uno de ellos 300 L de PBS Tween 0,05%. Repetir el lavado por tres veces.
En el ltimo lavado eliminar por completo el lquido residual,
invirtiendo la placa sobre papel absorbente (aplicar golpes firmes).
2. Bloqueo de sitios inespecficos mediante la adicin de 100 L de
PBS - BSA 3% en cada pozo.
Dejar una hora a temperatura ambiente.
Lavar

3. Incubacin de los sueros:

Rotular la placa de acuerdo con el esquema de distribucin de
suero. Se aconseja realizar duplicados.
Incluir en cada ensayo dos controles positivos y tres controles
negativos, un control interno y un blanco de reactivos.
Colocar 100 L por pocillo, de las diluciones de los sueros (1/100).
Mezclar aplicando suaves golpes en las paredes laterales de la
placa.
Incubar 30 minutos en estufa a 37 C, con la placa tapada para
evitar
la evaporacin.
Retirar el lquido de los pozos con la ayuda de una micropipeta y
descartar dicho lquido en un recipiente que contenga hipoclorito de
sodio al 5%.
Lavar los pozos

4. Incubacin del conjugado:

Colocar 100 L por pozo del conjugado preparado de acuerdo con
el ttulo obtenido previamente.
Incubar 30 minutos en estufa a 37 C.
Lavar al igual que en 9.3.1.
5. Reaccin con el sustrato:
Preparar minutos antes de su uso la solucin del sustrato ms cromgeno
(OPD).
Colocar 100 L en cada pozo.
Dejar en oscuridad y a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Detener la reaccin adicionando 100 L de cido sulfrico 2,5 M, por pozo.

 Fundamento.

Interpretacin de resultados

Inmunofluorescencia indirecta
La inmunofluorescencia secundaria, o indirecta hace
uso de dos anticuerpos; el anticuerpo primario es el que
reconoce y se une a al molcula diana, mientras que el
secundario que es el que se encuentra marcado con el
fluorforo, reconoce al primario y se une a l.

Procedimiento
1.Preparar el PBS Buffer
2.Preparar una dilucin 1/5 de los sueros controles y las muestras con el absorbente
(v.g.: 10 ul de muestra + 40 ul del absorbente
3.Sacar los portaobjetos (sustrato), emplear las improntas necesarios
4.Cubrir las reas reactivas con las diluciones del control reactivo, no reactivo y muestras
problemas
5.Incubar en cmara hmeda 30 minutos a temperatura ambiente
6.Lavar rpidamente con PBS, usando pizeta. Luego realizar dos lavados de 5 minutos
cada uno, colocando los portaobjetos en el coplin, conteniendo PBS, agitarlo suavemente
7.Diluir la antigamma (G,A,M) humana FITC en PBS, aprox. 1/100. Tener en cuenta la
dilucin sugerida por el fabricante
8.Sacar las improntas del PBS, sacudir el exceso sobre papel toalla, pero manteniendo
hmeda las reas reactivas
9.Cubrir cada rea reactiva con la dilucin de antigammaglobulina humana, e incubar en
cmara hmeda 30 minutos a temperatura ambiente
10.Lavar como en paso 6. Secar como en paso 8
11.Colocar medio de montaje sobre un cubreobjetos y cubrir las reas reactivas sin
presionar evitando la formacin de burbujas
12.Se recomienda leer inmediatamente en el Microscopio de Fluorescencia o dentro de
las 24 horas conservados entre 2 8C en oscuridad

Fundamento

Hemoaglutinacin
Hemoaglutinacin directa
Hemoaglutinacin indirecta
Pasos

A. Extraer la sangre del paciente (previamente vacunado); y conservarla

en un tubo con anticoagulante.
Centrifugar a 1500 rpm por 5 min.
Eliminamos el sobrenadante (plasma).
Agregar al tubo (Paquete Celular) solucin salina fisiolgica y mezclar.
Volver a centrifugar a 1500 rpm por 5min.
Eliminamos el sobrenadante y volvemos a repetir el proceso de lavado 2
3 veces ms.
Luego, tomamos de 0.7 ml. de glbulos rojos del paquete celular y lo
suspendemos en 100 ml. de SSF, para obtener el 0.7 % de glbulos
rojos lavados.

B. Colocamos 8 tubos en un gradilla, colocndole al primero 0.8 ml. deSSF y del

tubo 2 al 8 aadir 0.5 ml. de Suero Fisiolgico.
Luego, con una pipeta coger 0.2 ml. de cepa de New Castle y depositarla en el
tubo N 01 (dilucin 1/5).
Luego tomamos 0.5 ml. del tubo 1 y lo depositarmos en el tubo N02, (dilucin
1/10). Repetir hasta obtener las diluciones 1/20, 1/40,1/80, 1/160, 1/320, 1/640 (el
tubo N 08 es el control se le aadir 0.5ml. de la cepa New Castle).
Luego, a cada tubo colocamos 0.5 ml. de los glbulos rojos lavadosal 0.7 %
(incluyendo el tubo control)
Luego dejamos reposar al medio ambiente por 15 a 20 minutos.
Pasado el tiempo, colocamos debajo de la gradilla un espejo, para observar si hay
hemoaglutinacin positiva (formacin de una malla delgada, gris) o
hemoaglutinacin negativa (se observa un punto rojo).
La ltima dilucin en la cual aparece HA es el ttulo del parasito(este es el inverso
de dicha dilucin).
En la hemoaglutinacin directa se coloca el microorganismo con los glbulos rojos
(los virus aglutinan al glbulo rojo).
En la hemoaglutinacin indirecta sensibilizamos al glbulo rojo (lasglucoportenas
aglutinan glbulos rojos).
Las pruebas desarrolladas en tubo se conocen como macropruebas y las realizadas
en placas (microplacas) se conocen como microplacas.

Fundamento

Aplicaciones
ELISA
HEMOAGLUTINACION

IFI