YZEY BASKILANMI

BAKTERYEL SELLOZ
NANOFBERLER LE
STOKROM C SAFLATIRILMASI
Hacettepe niversitesi
Biyomhendislik A.B.D.
DOKTORA TEZ SUNUMU
Emel TAMAHKAR
Tez Danmanlar: Prof.Dr. Adil DENZL
Prof.Dr. Tlin KUTSAL
19.12.2014

indekiler
Genel Bilgi
Deneysel Yntem
Bulgular ve Tartma
Sonular

Genel Bilgi

Protein saflatrma

Tek bir ilem basama kullanarak

Yksek kapasite ve

Yksek seicilik ile hzl ayrm salayan

Ucuz,

Kararl ve

Tekrar kullanlabilen

malzemelerin gelitirilmesi gereklidir.

Genel Bilgi

Molekler Basklama
Molekler basklama, apraz bal polimerik yaplar iinde ilgilenilen molekle zg
spesifik tanma blgeleri oluturulmas iin kullanlan bir tekniktir.
: Hedef molekl
: Fonksiyonel monomerler

a.) hedef molekl ve fonksiyonel monomerlerin nkompleksi,

b.) apraz balayclar varlnda polimerleme,
c.) hedef molekln uzaklatrlmas.
Ge, Y., Turner, A.P.F. Trends in Biotechnology, 26, 218-224, 2008.

Molekler basklanm
polimerler (MIPs)
Seicilik
Dk maliyet
Salamlk
Kimyasal ve fiziksel
kararllk
gibi stn zelliklere
sahiptir.

Genel Bilgi

Kovalent
etkileimler

Dk non spesifik
balanma
Sznt problemi
olmaz
Dk balanma
kinetii
Hedef molekln
uzaklatrlmas
yetersiz

Non-Kovalent
etkileimler

Birok molekle
uygulanabilir
Kolay ve esnek
Zayf kompleks
oluumu
Heterojen balanma
blgeleri

Metal-elat
etkileimleri

Yksek spesifisite
Yksek kararllk
Sulu ortamda basklama
etkinlii yksek
Etkin hedef molekl
uzaklatrma

Genel Bilgi

Metal-elat etkileimli basklama

Balanma enerjisi nonkovalent etkileimlere
gre yksektir.
Hzl balanma
kinetiine sahiptir.
Yksek spesifisite
Yksek kararllk
Metal iyonu
deitirilebilir.

Kempe, M., Glad, M., Mosbach, K. Journal of Molecular Recognition, 8, 35-39,1995.

Genel Bilgi

Protein basklamadaki zorluklar

Proteinlerin molekler basklanmas kk molekllere gre
daha zordur. Bu durum proteinlerin baz zellikleri ile ilgilidir:
Molekl boyutu: Polimer yapnn iine aktarm kstldr.

Kompleks yaps: Geni yzeyinde ok sayda fonksiyonel

grup ierir.
Konformasyonel esneklik: Doal yapsnn polimerizasyon

srasnda korunmas gereklidir.

Genel Bilgi

Yzey basklama
MIP lerin performansn artrr:
Ktle aktarm kstlamalarn ortadan kaldrr.
Hedef molekl uzaklatrma ilemini kolaylatrr.

nce film
tabakas
He, H., Fu, G., Wang, Y., Chai, Z., Jiang, Y., Chen, Z. Biosensors and Bioelectronics, 26, 760-765, 2010.

Genel Bilgi

Nanomalzemeler
Nano-boyutlu MIP X Yn MIP
Nanoboyutlu MIP lerin
yn MIP lere gre;
balanma kapasitesi,
balanma kinetii
daha yksektir.

Gao, D., Zhang, Z., Wu, M., Xie, C., Guan, G., Wang, D. Journal of American Chemical Society, 129, 7859-7866, 2007.

Genel Bilgi

10

Afinite nanofiberler
Nanofiberler, yksek yzey alan/hacim oranna ve birbiriyle balantl
gzeneklere sahiptirler.
Afinite nanofiberler ounlukla elektroeirme (elektrospinning) yntemi ile
hazrlanrlar.

Elektroeirme deney dzenei

Zhu, J., Yang, J., sun, G., Journal of Membrane Science, 385-386, 269-276, 2011.

10-100 nm fiber apna

sahip elektroerilmi
(electrospun) nanofiberler

Genel Bilgi

11

Bakteriyel selloz nanofiberler

Bakteriyel selloz (BC) nanofiberler:

Hazrlanmas kolay
Yksek saflkta
Dk maliyetli
Biyouyumlu
Yeil kimyasal

Klemm, D., Schumann, D., Udhardt, U., Marsch, S. Progress in Polymer Science, 26, 1561-1603, 2001.

Acetobacter xylinum bakterisi

12

Sitokrom c
Sitokrom c, heme grubundaki merkez demir
atomuyla mitokondriyal solunum zincirinde elektron
tranferinde grevli temel bir proteindir.
Son yllarda yaplan almalar sitokrom c nin
apoptoz baladktan 1 sa iinde hcrenin dna
salndn gstermitir. Bu hzl ve apoptozspesifik ilem, hcre dna salnan sitokrom c iyi
bir apoptoz biyomarker yapar. Kanser hcrelerinde
apoptozu balatmak amacyla sitokrom c nin bu
hcrelere
hedeflendirilmesi
de
bir
dier
yaklamdr.
Ayrca sitokrom c, en dayankl proteinlerden biri
olmas ve kreye yakn ekli nedeniyle birok
bilimsel
almada
model
protein
olarak
kullanlmtr.

13

Tezin Amac

Sitokrom c (Cyt c) saflatrma ilemi iin yksek

kapasite, yksek seicilik ve hzl balanma zellikleri
ile kolay hazrlanr, ucuz ve kararl bir malzeme
retmektir.

Deneysel Yntemler

14

Bakteriyel selloz nanofiberlerin

hazrlanmas
Acetobacter xylinum
(ATCC 10245)

Bakteri stok kltr

@ 28 C

Hestrin-Schramm besi yeri

pH 5.1-5.2

7 gn, @ 28 C

Hestrin-Schramm besi yeri

etin, B.C. Bacterial cellulose, being biodegradable form and examination of interaction with cells

Bakteriyel selloz (BC)

nanofiberler

Deneysel Yntemler

15

Cyt c yzey basklanm nanofiberlerin

(Cyt c-MIP) hazrlanmas

@80C

Deneysel koullar: T: 25 C, pH: 7.0.

NIP nanofiberler de ayn ekilde hazrlanmtr, sadece MAH-Cu(II) kompleksine
hedef molekl olan Cyt c eklenmemitir.
Bodhibukkana, C., Srichana, T., Kaewnopparat, S., Tangthong, N., Bouking, P., Martin, G.P., Suedee, R. Journal of Controlled Release, 113, 43-56, 2006.

Deneysel Yntemler

16

Adsorpsiyon deneyleri
Sulu zeltilerden adsorpsiyon deneyleri yaplmtr.

Q: adsorpsiyon kapasitesi (mg/g),

C0: adsorpsiyon ilemi ncesinde Cyt c deriimi,
C: adsorpsiyon sonunda Cyt c derimi (mg/mL),
V: toplam uygulanan zelti hacmi (mL),
m: kuru nanofiber arl (g).

Seicilik Deneyleri:
BSA (sr serum albumini), Hb (hemoglobin), Myo (miyoglobin) ve Lys (lizozim)
bir veya birden fazla yzey histidini ierdiklerinden seicilik zelliklerinin
belirlenmesinde kullanlmtr.
Analizler UV-vis spektrofotometre ile yaplmtr.

Bulgular ve Tartma

17

Cyt c-MIP nanofiberlerin karakterizasyonu

MAH

Cyt c-MIP

Bulgular ve Tartma

18

SEM

Fiber ap : 50-100 nm
3-D as yap
Bakterilerden
arndrlm nanofiberler

Bulgular ve Tartma

19

Polimerizasyon koullarnn belirlenmesi

Toplam monomer oran:%1

Monomer/Cyt c : 20
Toplam monomer oran: %1
Poli. Sresi: 30 dak.

Deney koullar: T=25C, pH=7.0, t= 1 h.

Bulgular ve Tartma

20

Adsorpsiyona etki eden parametreler

Memory effect

Deney koullar: Ccytc=0.2 mg/mL, t= 1 h.

Bulgular ve Tartma

21

Adsorpsiyon izotermi

Qmaks = 36.4 mg/g

Deney koullar: T=25C, pH=7.0, t= 1 h.

Yntem

Kapasite,
mg/g

IMAC

31.7

IMAC

8.4

IMAC

42

IMAC

20.8

IMAC

40.1

MIP

19.7

Bulgular ve Tartma

22

Langmuir ve Freundlich izotermleri

Langmuir

Freundlich

Qmaks = 48.78 mg/g

KF= 35.50 mg/g

KL = 6.40 mL/mg

n = 3.83

R2= 0.953

R2= 0.724

Yzey

Bulgular ve Tartma

23

Balanma kinetii

Cyt c-MIP nanofiberler

Deney koullar: T=25C, pH=7.0, Ccytc= 0.2 mg/mL, t= 1 h.

24

Balanma kinetii ve termodinamik analiz

First-order

Second-order

Kinetic parameters

MIP

NIP

k1 (x102 min-1)

0.0027

0.010

33.69

6.23

R2

0.500

0.918

k2 (x103 g mg-1min-1)

0.11

0.044

36.63

9.28

0.999

0.994

0.62

0.55

C (mg g-1)

33.26

5.65

R2

0.538

0.886

H (kJ/mol)

S (J/mol)

-12.30

96

Qeq, cal
(mg g-1)

Qeq, cal
(mg g-1)
R2
-1

Intraparticle
diffusion

kp (mg g min

0.5

Temperature, C

G (kJ/mol)

-39.00

15

-40.03

25

-41.02

37

-42.18

Bulgular ve Tartma

25

Seicilik almalar

Metal elat
etkileimlerinin
katks

M(Cyt c) : MAH-Cyt c nkompleksi ile sitokrom c basklanm nanofiberler

Deney koullar: T=25C, pH=7.0, t= 1 h.

Bulgular ve Tartma

26

Seicilik almalar

Deney koullar: T=25C, pH=7.0, Cprotein = 0.2 mg/mL, t= 1 h.

Protein

M.A.,
kDa

pI

Yzey
histidini
says

Cyt c

12.3

10.6

Lys

14.6

10.5

BSA

67.0

4.9

Hb

64.5

6.8

24

Myo

17.0

6.8

Bulgular ve Tartma

Yntemin genellenebilirlii

Lys-MIP: lizozim basklanm nanofiberler

Deney koullar: T=25C, pH=7.0, t= 1 h.

27

Deneysel Yntemler

28

QCM nanosensrlerin hazrlanmas

@ 12000 r/min

AT cut (5.0 MHz)

QCM sensor chip

QCM nanosensor

Sener, G., Ozgur, E., Ylmaz, E., Uzun, L., Say, R., Denizli, A. Biosensors and Bioelectronics, 26, 815-821, 2010.
Hu,W., Chen, S., Liu, L., Ding, B., Wang, H. Sensors and Actuaturs B: Chemical, 157, 554-559, 2011.

Deneysel Yntemler

29

Kinetik ve seicilik almalar

Kinetik almalar: Cyt c-MIP QCM nanosensrler ile pH:7.0 fosfat tamponunda,
1 mL/dak ak hznda allmtr.
Seicilik almalar: Cyt c-MIP ve NIP QCM nanosensrler iin yzey histidini
ieren BSA, Hb, Myo ve Lys proteinleri ile allmtr.

Bulgular ve Tartma

AFM

30

Bulgular ve Tartma

31

Kinetik analizler
15
10
5
0

1 g/mL
5 g/mL
10 g/mL
25 g/mL
50 g/mL
75 g/mL

-5
-10
-15

-20
-25
-30
-35
-40
-45
-50
-55
-60
0

10

20

30

Time,min

40

50

Bulgular ve Tartma

32

Kinetik analizler
1,0

0,8

75 g/mL
50 g/mL
25 g/mL
10 g/mL
5 g/mL
1 g/mL

0,6

0,4

0,2

0,0

-0,2

10

20

30

Time, min

40

50

33

QCM nanosensrlerin dorusall

Bulgular ve Tartma

34

Denge izoterm modelleri ve kinetik analiz

Langmuir

Freundlich

Langmuir-Freundlich

mmaks(g/cm2):102.04

mmaks(g/cm2):14.35

mmaks(g/cm2):23.02

KD(mL/g):0.0119

1/n:0.56

1/n:0.423

KA(g/mL):83.63

R2:0.979

KD(mL/g):1.913
KA(g/mL):0.612

R2: 0.996

R2: 0.979
Scathard

Balanma kinetik analizi

mmaks(g/cm2):125.01

ka(g/cm2):0.0055

KD(mL/g):108.69

kd:0.0251

KA(g/mL):0.0092

KD(mL/g):4.56

R2: 0.958

KA(g/mL):0.219
R2: 0.931

Bulgular ve Tartma

Seicilik

Deneysel koullar: pH: 7.0, T: 25 C, C protein: 25 g/mL

35

Bulgular ve Tartma

Tekrar kullanlabilirlik

Deneysel koullar: pH: 7.0, T: 25 C, C Cytc: 25 g/mL

36

37

Sonular
Uygulanan strateji

Elde edilenler

Yzey basklama
(kat destek malzemesinin
yzeyinde seici balanma
blgeleri)

Sitokrom c saflatrma

Metal-elat etkileimleri
(MAH-Cu(II)-Cyt c;
spesifik ve kararl etkileim)
Bakteriyel selloz
nanofiberler

ilemleri iin bakteriyel

selloz nanofiber
yzeyinde spesifik tanma
blgelerine sahip yksek
kapasiteli, hzl balanma
kinetii gsteren kararl,
dayankl, ucuz ve kolay
hazrlanan evre dostu
malzeme retilmitir.

38

Teekkrler