Trabajo publicado en www.ilustrados.

com

La mayor Comunidad de difusin del conocimiento

Por: M. en C. de Educ. Guadalupe E. Daleth

Guedea Fernndez
daleth.guedea@gmail.com
 Introduccion
En ocasiones al ver una serie en la t.v.; de las policacas o de
mdicos donde se hacen anlisis a pequeas muestras para
averiguar si hay DNA y si este coincide con el de la vctima o con
el malo, o si cierta sustancia puede afectar a la salud, etc..,
entonces uno ve que los investigadores hacen una serie de estudios
con las muestras, que en ocasiones son muy pequeas, y dan
resultados; en la vida real sucede algo similar; cuando se tiene en el
laboratorio, en una solucin, presencia de color, o cuando se sabe
que hay ciertas cantidades de algn elemento pero no se sabe
cuanto, se genera la inquietud de saber que elemento es, en que
cantidad est y es entonces que se producen una serie de
preguntas, tales como: COMO LO MIDO? y otras ms, entre ellas
pueden estar: Qu es la luz?, qu es longitud de onda, cmo se
mide?, que relacin hay entre luz y color?; para que sirve esto?,
de qu manera se mide una solucin coloreada?.
En este trabajo se propone de orientar de manera sencilla, sobre
este tema tratando de dar una idea fundamental de las preguntas
anteriores y otras ms que se hacen en torno al tema que se est
presentando; espero este trabajo sea til tanto a profesores como
alumnos para orientarse y poder entender ms acerca de la
espectrofotometra a nivel laboratorio de ciencias biolgicas.
Espectroscopa
Caractersticas de la Luz
Colores
Qu es longitud de Onda?
Relacin entre frecuencia, velocidad y longitud de onda
Absorcin / Absorbitividad
Las leyes de Lambert y Beer

Espectrofotometra
 Colorimetra y Espectrofotometra como procedimientos
analticos
Fotocolormetro
ESPECROFOTMETRO
Curva Patrn

Referencias e Imgenes
La espectroscopia es el estudio del espectro de la
luz que emiten los cuerpos, sustancias y
elementos.

De este estudio se puede conocer la composicin,

temperatura, densidad, velocidad de
desplazamiento y otros factores que les son
propios y componen a estos cuerpos, sustancias
o elementos
La luz tiene una naturaleza dual:
Como onda
Como una corriente de partculas o paquetes de
energa (fotones)
Albert Einstein desarroll en 1905 la teora de
que la luz estaba compuesta de unas partculas
denominadas fotones, cuya energa era
inversamente proporcional a la longitud de
onda de la luz.
 3
1

Foton

2
La teora electromagntica de la luz propuesta por
Maxwell: La perturbacin que se propaga como ondas de luz
est formada por fuerzas elctricas y magnticas, y la
perturbacin se produce en cargas elctricas en
movimiento.
Efecto de la emisin electromagntica
El efecto fotoelctrico demuestra el comportamiento de la
luz como partcula (grnulos o corpsculos)
La naturaleza corpuscular de la luz se observa
en fotos de objetos iluminados muy dbilmente.
La imagen se forma punto a punto, y muestra
que la luz llega a la pelcula fotogrfica por
unidades separadas que los producen.
 Estos descubrimientos dieron origen a toda la
tecnologa moderna de telecomunicaciones como la
televisin
En estas imgenes
se puede apreciar,
debido a la toma
fotogrfica los
elementos
puntuales que
apoyan a esta
teora
Los seres humanos (y algunos animales) apreciamos una
amplia gama de colores que, por lo general, se deben a la
mezcla de luces de diferentes longitudes de onda. Se
conoce como color puro al color de la luz con una nica
longitud de onda o una banda estrecha de ellas.
Cuanto ms larga la longitud de onda de la luz visible
tanto ms rojo el color.
Asimismo las longitudes de onda corta estn en la zona
violeta del espectro.
As todos los elementos existentes poseen un
espectro ***
Hay varios tipos de espectros, los ms comunes son
los espectros continuos, espectros de emisin y los
espectros de absorcin.
Si es colocado frente al espectroscopio se podr ver, un
elemento:
En situaciones en las que se le somete altas temperaturas y
presiones y no se presentan lneas obscuras se trata de un
espectro continuo.
En situaciones normales y se observan unas lneas de
colores frente a un fondo negro, se trata de un espectro de
emisin.
Y por ltimo si sucede la primer situacin y entre el
elemento afectado y el espectroscopio se coloca un
elemento a menor temperatura que el primero, se obtiene el
espectro de absorcin
La luz blanca produce al descomponerla lo que
se llama un espectro continuo, que contiene el
conjunto de colores que corresponde a la gama
de longitudes de onda que la integran.
 Todos los elementos poseen un espectro propio,
que se puede medir al someterse a temperaturas
elevadas ya que producen espectros discontinuos .

**Para ver espectros de la tabla peridica buscar en esta pgina

http://site.ifrance.com/okapi/quimica.htm **
La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se
llama longitud de onda ( = lambda).

CARACTERSTICAS DE LAS ONDAS

nodo
 La longitud y la frecuencia de onda son
inversamente proporcionales y se
relacionan mediante la siguiente ecuacin
 U.V.
La luz visible es
X
L slo una pequea
GAMMA
u parte del espectro
z
350 nm electromagntico
con longitudes de
v onda que van
i aproximadamente
s de 350 nanmetros
i hasta unos 750
b nanmetros
l 750 nm <nanmetro, nm =
milmillonsimas de metro>.
e Infrarrojo
Microondas
Radio
La luz blanca est compuesta de ondas de diversas
frecuencias. Cuando un rayo de luz blanca pasa por un
prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la
longitud de onda
As la luz blanca es una mezcla de todas las longitudes de
onda visibles.
En el espectro visible, las diferencias en longitud de
onda se manifiestan como diferencias de color.
La distribucin de los colores se determina por la
longitud de onda de cada uno de ellos.
Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les
conoce como infrarrojas y las mas cortas que el violeta,
ultravioletas.

Ultravioleta Luz visible Infrarrojo

102 -104 ~ 104 104-107

UV Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo IR

4000 A Espectro Visible 7500 A
 Relacin entre frecuencia,
velocidad y longitud de onda*
Frecuencia natural
Cualquier objeto oscilante tiene
una 'frecuencia natural', (vibracin
en ausencia de perturbacin).
frecuencia es el Nmero de vibraciones por
segundo

As Frecuencia, es nmero de
veces que la onda se repite por
segundo.

La Frecuencia se mide en Hertz

(Hz)
Quin es HERTZ?

HEINRICH HERTZ (1857-1894), Investigador alemn que

construy un dispositivo para generar y detectar en un
laboratorio ondas electromagnticas, demostrando su
existencia as como, se reflejan estas ondas, se refractan y
se comportan como las ondas de luz

Estim que la frecuencia f de la onda era de alrededor de 3

x 107 Hz. Y determin que su longitud l era de 10 m. Con
estos valores estableci que la velocidad v de la onda es

v = f l = (3 X 107 Hz) X (10 m)

= 3 X 108 m/s = 300 000 km/s

o sea, la velocidad de la luz.

 1 Hz (o hercio) es igual a 1 ciclo u
oscilacin por segundo. (1 Hertz = 1
ciclo/seg)

Un kilohercio (kHz) = mil de ciclos por

segundo

Un megahercio (MHz) = un millon de

ciclos por segundo

Un gigahercio (GHz) = mil millones de

ciclos por segundo
Un pndulo de 1 m de longitud presenta
una frecuencia de 0,5 Hz, es decir que el
pndulo va y vuelve una vez cada 2
segundos.
Longitud de onda = velocidad de propagacin / frecuencia

l c u
l= c / u
Donde c = vel. de la luz en m. por seg.

c = l . u (m-1s-1)
u=c/l
 Frec = Vel / l
Como la luz viaja a una
velocidad de
3 x 108 m/s

Freclimite luz visible = 3x108 (m/s) / 10-6 (m)=

3x1014 Hz
Es decir: 300 000 000 000 ciclos por
segundo
Relacin entre Medidas en valores Hertz y Metros
Las ondas electromagnticas de
frecuencias extremadamente
elevadas, como la luz o los rayos
X, suelen describirse mediante
sus longitudes de onda, que
frecuentemente se expresan en
nanmetros.
Un ejemplo es: Una onda
electromagntica con una
longitud de onda de 1 nm tiene,
aproximadamente una frecuencia
de 300 millones de GHz.
 l= vel / u
El sonido se propaga a una velocidad de
340 m cada segundo

La nota La tiene una frecuencia de 440 Hz

l = 340 (m/s) / 440 Hz (ciclos por seg) = 0.77 m
4 x 10-5 cm = 400 nm (luz violeta)
7 x 10-5 cm = 700 nm (luz roja)
 Algunas equivalencias

1m 0.001 mm 10-6 m

nm = mm 0.001m
10-9 m

1 0.0001m = 0.1 nm
10-10 m
Comparacin de las mediciones de las
longitudes de onda con la luz visible.
El color de un cuerpo depende de la luz que
recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el
color rojo se d cuando absorbe en casi su
totalidad, todas las radiaciones menos las
rojas, las cuales refleja o deja pasar
dependiendo su estructura (slida o
transparente).
La energa UV es mayor que,
cualquier color del espectro
visible. Sin embargo los
rayos X son ms energticos
que la luz UV, como se puede
apreciar por su longitud de
onda.

Con base a lo anterior se

puede entender que
existe una relacin
inversa entre la longitud
de onda y la energa del
fotn correspondiente.
Entonces, las energas en el rango ultravioleta-visible
excitan los electrones a niveles de energa superiores
dentro de las molculas y las energas infrarrojas
provocan solo vibraciones moleculares
El color percibido de una solucin depende de la
combinacin de colores complementarios que la
atraviesan
 Proceso de Absorcin

La energa de excitacin a una molcula

proveniente de un fotn durante el proceso de
absorcin se representa as:

A + hn A* A + calor
donde:
A es el absorbente en su estado de energa bajo,
A* es el absorbente en su nuevo estado de
excitacin energtica
hn representan a la constante de Planck y la
frecuencia respectivamente
 La energa del fotn incidente posee una
longitud de onda (l)

A* es inestable y rpidamente revierte a

su estado energtico ms bajo, perdiendo
as la energa trmica correspondiente.

La absorcin de determinadas longitudes

de onda depende de la estructura de la
molcula absorbente (absortividad, a)
Cuando un rayo de luz monocromtica con una intensidad I0
pasa a travs de una solucin, parte de la luz es absorbida
resultando que la luz emergente I es menor que I0

Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

a a = absortividad

I0
I
c = concentracin.
(nmero de partculas por
cm3)
b
Longitud del medio
absorbente o ancho de la
celda
 Absortividad (a)

a es una constante de proporcionalidad

que comprende las caractersticas
qumicas de cada compuesto, o molcula
y su magnitud depende de las unidades
utilizadas para b y c.
Cuando se expresa la concentracin en moles
por litro y la trayectoria a travs de la celda
en centmetros, la absortividad se denomina
absortividad molar y se representa con el
smbolo e .
En consecuencia cuando b se expresa en
centmetros y c en moles por litro.
A = e bc
Donde A representa la absorbancia del
compuesto
Las leyes de Lambert y Beer *
Ley de Lambert: cuando un rayo de luz
monocromtica (I0) pasa a travs de un medio
absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente (I) a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta
I = I0e-ab

I0 I I0 I I0 I

1 cm. 2 cm. 3 cm.

Ancho de la celda
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a
travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente a medida que la concentracin del medio
absorbente aumenta

I = I0e-ac

I I
I0 I I0 I0
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley
de Beer-Lambert donde la fraccin de luz incidente que es
absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin
de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz.
La relacin entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dar
una idea de la cantidad de radiacin que ha sido absorbida
por la muestra.
 Ley de lambert Beer:

I = I0 e-abc

Si despejamos: I/I0 = e-abc

 Al cociente de las intensidades se denomina
Transmitancia

T = I/I0 = e-abc
Sacando logaritmos:
Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:
Log10 I/I0 = 2.303 abc
Log10 I/I0 = abc

Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

La Transmitancia (T) es la relacin entre la
intensidad de luz transmitida por una
muestra problema (I) con la intensidad de
luz incidente sobre la muestra (Io):

T = I / I0

Se expresa como % T
La absorbancia es directamente proporcional a
la longitud del recorrido b a travs de la
solucin y la concentracin c del color
absorbente. Estas relaciones se dan como:

A = abc

A menudo b es dada en trminos de cm. y c en gramos por litro, entonces la

absortividad tiene unidades de lg1cm1.
 Qu relacin guardan la transmitancia y la
absorbancia?

De acuerdo a las caractersticas de la sustancia

analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solucin
LUZ
A
B
S Luz transmitida
O

I0 R
B
I
I
D T = I/I0
A
 Por lo tanto la absorbancia es reciproca de
la transmitancia
Absorbancia contra concentracin (comportamiento lineal)

Absorbancia

Concentracin

% Transmitancia contra concentracin (pendiente con signo

negativo y comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentracin
 Absorbancia

De loA anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luz

que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo en
base diez del recproco de la transmitancia (T) o bien al -
log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro o
(blanco) es el material de referencia; esto es:

A = log10 1/T = log101- log10 T = 0 log10 T = log10 T

mg
La representacin grfica correspondiente a
absorbancia y transmitancia en un gradiente de
concentraciones es la siguiente:

Concen
tracin
 Obtencin de TRANSMITANCIA utilizando valores de
Absorbancia

Con base en la relacin: T = 10-abc

y considerando que T se menciona en porcentaje (%)
%T = 10-abc x 100.
Aplicando logaritmos a la expresin anterior
log10 %T = -abc log 10 10 + log10 100
Invirtiendo trminos
log %T = log10 100 -abc log 10 10 = 2 abc * 1
log10 %T = 2 abc
Como abc = Absorbancia = A
log10 %T = 2 A.
 log10 %T = 2 A.
Ejemplo:
Una absorbancia de 0.6 a que equivale en % T?

Log10 % T = 2 0.6 = 1.4

Log10 % T = 1.4

%T = 1 / Log10101.4

Aplicando antilog. a

1.4 = 15 % de transmitancia
Obtencin de absorbancia a partir de un valor de
% de transmitancia
RECORDANDO:
A = log10 1/T
Ejemplo de clculo
%T = 30
T = 0.30
Sustituyendo (1/T) 1/0.30 = 3.33
Log10 3.33 = 0.523 de absorbancia
Se le llama espectrofotometra a la medicin
de la cantidad de energa radiante que absorbe
un conjunto de elementos o un elemento en su
estado puro, en funcin de la longitud de onda
de la radiacin lumnica y a las mediciones a
una determinada longitud de onda.

* Arco iris en Marte

Cmo se puede medir la radiacin que emiten o
absorben los cuerpos?.
Un aparato capaz de obtener el espectro de una
radiacin, es decir, de separar la radiacin en
sus componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama
un espectrgrafo, y
Si es capaz de medirla diremos que se trata de
un espectrmetro.
Cuando es capaz de medir tambin la intensidad
de la radiacin, se llama espectrofotmetro.
Espectroscopio 1817

Espectgrafo
 Espectmetro

De fluorescencia Imagen de Marte vista con

ayuda de espectmetro de
rayos Gamma

De Emisin
ptica
Para metales
 Colorimetra y
Espectrofotometra
como procedimientos
analticos *
Las tcnicas colorimtricas se
fundamentan con la medicin de la
absorcin de radiacin visible por
sustancias coloreadas.

Sin embargo, cuando una muestra a

determinar no posee coloracin, es
necesario llevar a cabo un tratamiento de
color empleando substancias que que
reaccionen de forma proporcional con el
compuesto de inters
Las diferentes sustancias se analizan mediante
reacciones coloreadas. Cuanto mayor es la concentracin
de la sustancia a analizar mayor es el color de la
reaccin.
Tambin es posible
leda cuando su
encuentra en las
espectro, como las
UV o infrarroja
que la muestra pueda ser
espectro de absorcin se
regiones no visibles del
referentes a las regiones de

Visn de las abejas

Orbitas de TITAN
Casiopea A: ecos de luz en infrarrojo
La diferencia entre colorimetra y
espectrofotometra consiste en el tipo de
instrumental empleado:

El colormetro es un aparato en los que la longitud de onda

se selecciona por medio de filtros pticos que son
insertados en este.

En el espectrofotmetro la longitud de onda es

seleccionada mediante dispositivos monocromadores los
cuales estn integrados a la mquina.
Algunos de los procedimientos colorimtricos o
espectrofotomtricos con los que se cuenta
para precisar la concentracin de una sustancia
en solucin son los siguientes:

Referencia de color
Colormetro Klett
Espectrofotmetro
 M.C.I/2005

FOTOCOLORMETRO KLETT / SUMMERSON

Fundamento de colormetro Klett
Una solucin que absorbe el rojo pero no el amarillo y
el azul con la combinacin de estos dar un color
verde.

Luz incidente Luz absorbida Luz emergente

Rojo
Verde
Amarillo
Azul
Amarillo
Azul }
Por lo anterior podemos aplicar un sencillo
mtodo para precisar con cual filtro podramos
leer una solucin dependiendo el color de esta

Cuando la solucin sea roja no se deber utilizar

un filtro de color rojo porque justamente ese es el
color que no absorbe.

En relacin a esto, en el manual del

fotocolorimetro Klett aparece la siguiente tabla que
se puede utilizar para determinar que filtro se debe
emplear de acuerdo al color de la solucin a
estudiar:
Color del Rango Soluciones
filtro espectral coloreadas

Azul 400-465 Roja, Naranja,

Amarilla, Verde,
Turbias
Verde 500-570 Roja, Amarilla,
Violeta, Naranja,
Azul

Rojo 640-700 Azul, Verde,

Amarilla
A menudo se hace referencia a la estrella de colores
para facilitar el recordar la eleccin del color de filtro para
lectura colorimtrica. Para soluciones de color azul verde y
amarilla correspondera un filtro rojo. Para soluciones de
color rojo, naranja o amarrillo seleccionaramos un filtro
color azul. Finalmente para soluciones con color verde,
azul o amarilla elegiramos un filtro rojo.
 Manejo del
Fotocolormetro
1. Confirmar, que el filtro (A) adecuado se encuentre dentro del
portafiltros (B) y este en su lugar (C)
2. Compruebe que la aguja indicadora (D) este en el centro, en
cero; si no es as ajuste a cero con la perilla (E) que se
localiza en la parte superior; siempre y cuando la lmpara se
encuentre apagada

C
D E

M.C.I/2005
3. La lmpara (F) se enciende con el apagador (G), deje calentar
entre 5 y 10 minutos.
4. Ajuste la escala del potencimetro (H) con la perilla
correspondiente (I) a cero
5. Coloque la cubeta (limpia) (J) con el blanco, en su sitio (K) y
encienda con el interruptor (L)

F G

H
K

I
L

J
M.C.I/2005
6. Mediante la perilla (M) del galvanmetro , se acopla la lectura
a cero , lo que implica que la aguja (D) y la escala (H) deben
estar en cero.
7. Para leer las soluciones problema : Hay que retirar de la
cubeta el blanco y colocar la solucin problema, la aguja (D)
se desviar de su posicin , es necesario nuevamente ajustar
(con I) a cero, la lectura que proporcione la escala (H) es la
correspondiente al problema

M
D

M.C.I/2005
 Las lecturas se
realizan en U.K. U.K / 500 =
(unidades Klett) Absorbancia
Las lecturas que se
mayores a 500 U.K
y las menores a 25 U.K. X 500 =
U.K., no se usaran Transmitancia
para calcular
concentraciones
CUIDADOS
Las muestras no deben
tener burbujas, No se deben derramar
encontrarse turbias o lquidos, sobre todo
con precipitados. solventes, cidos o
El volumen de la lcalis; dentro del
muestra no debe ser contenedor de la
excesivo para evitar que cubeta, se puede daar
se desborde, en caso de parte del mecanismo
que sucediera, se debe El fotocolormetro nunca
limpiar con un pao se debe encender sin
limpio o papel filtro.
absorbente suave, para
evitar rayarla. No deje que se
sobrecaliente,
La cantidad a adicionar mantenga apagado si
es, mximo, hasta no lo utiliza.
partes de la cubeta
Un espectrofotmetro es un instrumento
que descompone un haz de luz (haz de
radiacin electromagntico), separndolo
en bandas de longitudes de onda
especficas, formando un espectro
atravesado por numerosas lneas oscuras
y claras, semejante a un cdigo de barras
del objeto, con el propsito de identificar,
calificar y cuantificar su energa
Distribucin de la luz en el
espectrofotmetro
Espectrofotmetro Mecanismo Interno
 Met.Cient. I
COLOR LONGITUD DE ONDA (l)
Rojo (R) 700 nm
Verde (G) 546.1 nm
435.8 nm
Azul (B)
Es usual que al seguir una receta para la
determinacin de la concentracin de un compuesto
en particular se indica una longitud de onda (l)
especfica a la que hay que leer con el colormetro o
espectrofotmetro.

Porque leer a diferentes l (longitudes de onda)

compuestos parecidos pero diferentes?

La explicacin radica en el hecho de que cada

producto qumico se caracteriza por zonas del
espectro visible o no visible en el cual absorbe con
mayor o menor intensidad conformando en su
conjunto el espectro de absorcin de tal sustancia.
Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de
absorcin caracterstico

Absorbancia

l
Las longitudes de onda con mayor absorcin (picos) correspondern
de forma general a aquellas con las que se leer la muestra para
determinar su concentracin
Absorbancia

l
La relacin entre la absorbancia por una sustancia a una l
determinada y su concentracin es directamente proporcional es decir:
a mayor concentracin mayor proporcin de luz absorbida.

Absorbancia
Conc.
As, el espectro de absorcin de la clorofila es:
Colorante comn, la Rodamina 6G en Metanol..

Espectro de Absorcin (lnea contnua) y Espectro de

Transmisin (lnea discontnua).
celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de

forma prismtica
Se asume que el tubo, celda o cubeta en la cual
se vierte la solucin a leer no debe desviar la
trayectoria de la luz como requisito para el
cumplimiento de la ley de Beer
Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un
comportamiento constante ante la variacin de la longitud de
onda es comn que las celdas del espectrofotmetro o
colormetro sean de este material .
 Curva Patrn

El razonamiento para el proceso de

determinacin de una concentracin
desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las
cuales tambin se sabe su absorbancia (curva
patrn), es posible interpolar (intercalar) la
concentracin del problema sabiendo su
absorbancia (lnea roja en figura siguiente)
 CURVA PATRN

0.6

0.5

A
Absorbancia del problema
B 0.4
S
0
R 0.3

B
A
0.2
N
C
Interpolacin
I
0.1
A

0
0 2 4 6 8 10 12

Concentracin mg/lt
Con base en que la Absorbancia guarda una relacin lineal con
la concentracin, se comprende la existencia de una relacin de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentracin:

A1 / A2 = C1 / C2
Donde:
A1 = Absorbancia del problema.
A2 = Absorbancia de un estndar de concentracin conocida.
C1 = Concentracin del problema.
C2 = Concentracin del estndar.

Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estndar

Conc. (problema) =
A2 (estndar)
Ejemplo de curva patrn para la determinacin de safranina;
donde se solubiliza este colorante nicamente en agua siendo
por tanto el agua misma el tubo blanco o de referencia para la
calibracin del equipo (colormetro o espectrofotmetro)

TUBO Stock de Safranina Agua Destilada ml

(3 x10 -4 g/ml) ml

1 0 10
2 0.05 9.95
3 0.10 9.9
4 0.20 9.8
5 0.40 9.6
6 0.80 9.2
 En este ejemplo de determinacin de Glucosa, en la
preparacin de los tubos para la lectura de la curva patrn, se
incluyen ms elementos y por lo cual el tubo blanco (0)
contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin
de de poder calibrar la absorbancia del equipo a cero

Compuesto 1 2 3 4 5 6 7
(blanco)

Glucosa 0,1 mg/ml

0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(mL)
Agua destilada
1.0 0.4 0.9 0.8 0.2 0.6 0.0
(mL)
Fenol al 5% (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Acido sulfrico
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
(mL)
RESULTADO de la curva patrn anterior
Absorbancia en el Espectrofotmetro a 490 nm

Tubos Absorbancia Curva de calibracin de glucosa

1 0
1
2 0.135 0.8

Absorbancia
3 0.253 0.6

4 0.417 0.4

0.2
5 0.658
0
6 0.574 1 2 3 4 5 6 7

7 0.768 Tubos
Un aspecto importante de la evaluacin
espectrofotomtrica, es que muchas molculas orgnicas
no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el
rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al
infrarrojo

Por lo que es comn, actualmente, que la mayora de los

espectrofotmetros, actuales, se encuentren provistos
con lo necesario para leer en de tales intervalos

As, los grupos carbonilo presentes en los aldehdos

(RCHO), cetonas (RCOR), cidos carboxlicos (RCOOH),
l steres (RCOOR) y amidas (RCONHR) dan lugar a
absorciones intensas en la regin del espectro de
infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.
Absorciones mximas (picos de absorcin) de algunos
compuestos que absorben en la regin ultravioleta:
Grupos funcionales cuyos picos de absorcin se localizan en la regin
del infrarojo
Tipos de Espectrofotmetro
Existen en la actualidad diversos
tipos de aparatos con los mismos
principios los hay mecnicos y
digitales; unos miden solo la luz
visible, otros son ms precisos y
miden tambin luz U.V. , Infrarroja,
de absorcin atmica (AA),
flurescencia de rayos-X de
emisin de plasma (ICP),,
multipropsitos (para medir
directamente la solucin con
suspensin, muestras slidas y
biolgicas), acoplado a masas,etc..
 MCI MCI
Para medir Luz Visible Para medir Luz Visible y U.V.

MCI
Para medir Luz Visible y U.V.

Diferentes tipos de espectrofotmetros

Spectronic 20 D Spectrnic 20
Partes del Spectronic 20 D
 Manejo de espectrofotmetro

En la siguiente diapositiva se les proporciona el instructivo para el manejo el

espectrofotmetro Modelo Spectronic 20.
Manejo de espectrofotmetro
Prender el aparato (a)10 minutos antes de utilizarse, se
activar la luz roja de encendido (b).
Seleccionar la longitud de onda con el botn (c).
Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y
sin muestra.
Insertar la cubeta con el blanco en su seccin (d).
b

d
c

a
 Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)
Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra
problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa.
La aguja (d) del lector se deslizar sobre la escala (f) , se
lee en % de transmitancia en unidades de absorbancia

e
CUIDADOS
Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse
turbias o con precipitados.
El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser
excesivo para evitar que se desborde, en caso de que
sucediera, se debe limpiar con un pao limpio o
papel absorbente suave, para evitar rayarla.
La cubeta se sujeta por los lados opacos.
La cantidad a adicionar es, mximo, hasta partes
de la cubeta
No se deben derramar lquidos, sobre todo solventes,
cidos o lcalis; dentro del contenedor de la cubeta,
se puede daar parte del mecanismo
Se debe mantener, el espectrofotmetro, limpio y
libre de humedad
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 * Basado en el trabajo de ppw : Arriaga F. Alberto y
Guedea Fdz. Guadalupe., Fundamentos de
colorimetra y espectrometra Julio de 2005, para
Met. Cientfica 1 Biologa , FES Iztacala UNAM. Sin publicar
***Imagenes proporcionadas por Carlos S. Chinea
casanchi@ya.com

Las imgenes sealadas con MCI fueron tomadas en

el 2005 de los aparatos que se encuentran en el
Laboratorio de Metodologa Cientfica I de la Carrera
de Biologa en la Facultad de Estudios Superiores
Iztacaca UNAM Mxico.
AUTOR
Maestra en Ciencias de la Educacin
Guadalupe Eugenia Daleth Guedea
Fernndez. Mxico 2006

Correo: daleth_guede@yahoo.com.mx
dalethguedea@hotmail.com y/o
daleth.guedea@gmail.com