Tecnologa del ADN recombinante y sus

aplicaciones en la Medicina.
Tecnologa del ADN recombinante y sus
aplicaciones en la Medicina.

Link para bajar las animaciones

http://www.dnalc.org/resources/animations/

Link sobre el tema

http://learn.genetics.utah.edu/
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Corte con enzimas de restriccin- Animacin

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Electroforesis en gel de agarosa-

Animacin
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Blotting
Tipo de blot Southern Northern Western
Analiza: ADN ARN Protenas
Procedimiento
1) Preparacin de la muestra Se corta en fragmentos Nada Nada

2) Sepacin por electroforesis Tamao Tamao Tamao o carga

3) Tratamiento del gel Desnaturalizar el ADN Nada Nada

con lcali
4)Transferir a una membrana Por capilaridad Por capilaridad Campo elctrico

5) Identificar molculas de Sonda de RNA Sonda de RNA Anticuerpos marcados

inters radioactiva o ADN radioactiva o fluorescente o
simple cadena ADNsc radioactivamente
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Mtodo de Sanger
- Animacin
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Mtodo actual de secuenciacin

Secuenciacin-
Animacin
ADN copia (ADNc) y transcripcin reversa
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Se necesita:
-Muestra de ADN
-Primers o cebadores: oligonucletidos
entre 20 y 30 nucletidos
-dNTPs
-Buffer que permita mantener el pH en el
rango de 7,4
-Taq ADN polimerasa estable al calor.

Ciclo de PCR:
1-Desnaturalizacin del ADN: 95C 15 seg.
2-Hibridacin de los cebadores: 50-60C 15 seg.
3-Sntesis de ADN: a 72C 1 min/kb

PCR- Animacin
TERMOCICLADOR
CINTICA CUANTITATIVA DE LA PCR

Hay tres fases:

1. Una lnea de base. No hay bastante

producto formado para ser ledo por el
espectrofotmetro o para aparecer en la
exponencial electroforesis.

Fase exponencial 2. Una fase exponencial. La fase exponencial

puede estar dividida en dos partes. Durante la
primera parte, la cantidad de ADN debera
exponencial
duplicarse en cada ciclo (si el rendimiento de
la reaccin es 100%). Durante la segunda
parte, deja de duplicar en cada ciclo. As
empieza el proceso que llegar al plat.

3. Un plat. El plat es debido a un

agotamiento de los cebadores, un
"agotamiento" de la ADN polimerasa y
posiblemente tambin a la ley de Lambert-
Beer.
Mutaciones GNICAS: Son aquellas que slo afectan a nucletidos aislados,
bien porque se cambia uno por otro, porque se aade o se pierde un
nucletido. El cambio de un nucletido por otro puede dar lugar a que la
protena siga siendo funcional y la mutacin pase desapercibida, pero si se
aade o elimina algn nucletido, la alteracin puede ser tan grande que la
protena no sea funcional, provocando una enfermedad gentica o, incluso, la
muerte.
 Mutacin somtica y mutacin en la lnea germinal

-Mutacin somtica: es la que afecta a las clulas somticas del individuo.

Como consecuencia aparecen individuos mosaico que poseen dos lneas
celulares diferentes con distinto genotipo. Una vez que una clula sufre
una mutacin, todas las clulas que derivan de ella por divisiones
mitticas heredarn la mutacin (herencia celular). Un individuo mosaico
originado por una mutacin somtica posee un grupo de clulas con un
genotipo diferente al resto, cuanto antes se haya dado la mutacin en el
desarrollo del individuo mayor ser la proporcin de clulas con distinto
genotipo.
Las mutaciones que afectan solamente a las clulas de la lnea somtica
no se transmiten a la siguiente generacin.

-Mutaciones en la lnea germinal: son las que afectan a las clulas

productoras de gametos apareciendo, de este modo, gametos con
mutaciones. Estas mutaciones se transmiten a la siguiente generacin y
tienen una mayor importancia en la evolucin biolgica.
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Plsmido portador del gen de la

hormona de crecimiento de rata

Microinyeccin en
el proncleo de
huevos fertilizados
de ratn

Implantacin en madres
ratn adoptivas

Ratones de la descendencia
crecimiento

Ratones transgnicos con unas 800

veces ms hormonas de crecimiento que
sus compaeros de camada
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Ratn Knock out

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Ratn Knock out

para leptina ob-/-
Diferentes animales
transgnicos
fluorescentes
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SNP: Single nucleotide

polimorfism
 POLIMORFISMO GENTICO
-Hace referencia a la existencia en una poblacin de mltiples alelos de
un gen.

-Un polimorfismo es una variacin en la secuencia de un lugar determinado del

ADN entre los individuos de una poblacin.
Aquellos polimorfismos que afectan a la secuencia codificante o reguladora y
que producen cambios importantes en la estructura de la protena o en el
mecanismo de regulacin de la expresin, pueden traducirse en diferentes
fenotipos (por ejemplo, el color de los ojos).
Un polimorfismo puede consistir en la sustitucin de una simple base
nitrogenada (por ejemplo, la sustitucin de una A (adenina) por una C (citosina)
o puede ser ms complicado (por ejemplo, la repeticin de una secuencia
determinada de ADN, donde un porcentaje de individuos tenga un determinado
nmero de copias de una determinada secuencia).
Los cambios poco frecuentes en la secuencia de bases en el ADN no se llaman
polimorfismos, sino ms bien mutaciones.
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Mutaciones GENMICAS: : Son aquellas que afectan al GENOMA, es decir, al
nmero de cromosomas, bien porque se gane alguno o porque se pierda. Suelen
ser debidas a problemas durante la meiosis.

-Aneuploidas: Estos individuos presentan algn cromosoma de ms o de menos

respecto a su dotacin normal.

Nulisomas. Falta una pareja cromosmica (efectos letales)

Monosomas: Falta un cromosoma de una determinada pareja
Trisomas: Un cromosoma se encuentra triplicado. (plantas)
Tetrasomas: 4 ejemplares de un cromosoma.
Segn el efecto que producen existen:

Mutaciones LETALES: Las que provocan la muerte de aqul que las padece.

Mutaciones SILENCIOSAS: Aquellas que afectan a partes del DNA que no

llevan informacin para fabricar protenas.

Mutaciones SIN SENTIDO: Son mutaciones en las que un codn normal se

cambia por un codn de terminacin, con lo que la protena no se termina.

Mutaciones RECESIVAS: Slo se manifiestan si aparecen en homocigosis.

Suelen ser la mayora y slo se manifiestan a partir de cruces consanguneos.
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Farmacogentica
 FARMACOGENTICA
Ciencia que estudia las variaciones heredadas en los genes que dictan el
metabolismo de frmacos y explora las maneras que estas variaciones se
pueden utilizar para predecir si un paciente tendr una buena, mala o
ninguna respuesta a una determinada droga.

Purinethol (6-mercaptopurina): anlogo de las bases prinicas.

El frmaco es incactivado en el organismo por la enzima Tiopurina
Metiltransferasa (TPMT).

Gen que codifica para TPMT: 2 alelos (alta actividad y baja actividad).

Homocigotas para alelo de alta actividad (2 copias): capacidad normal para

degradar Purinethol.
Heterocigotas: capacidad intermedia para degradar Purinethol.
Homocigotas para alelo de baja actividad (2 copias): baja capacidad para
degradar Purinethol.

Dosis del frmaco para el tratamiento de leucemias deben manejarse

de acuerdo a las variables heredadas del gen TPMT.
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Aplicaciones de las tcnicas de secuenciacin en el diagnstico

de enfermedades hereditarias. Gen APC y FAP.
Mutaciones descriptas en el gen APC
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Cncer hereditario Genes secuenciados de rutina

Poliposis adenomatosa familiar APC

Sndrome de Lynch (cncer colon) MLH1, MSH2, MSH6 MSI-IIC

(enzimas reparadoras)

Breast/ovarian cncer BRCA1 y BRCA2

(enzimas reparadoras)

Carcinoma medular de tiroides familiar RET

(protooncogen)
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Algunas enfermedades hereditarias monognicas son:

Anemia falciforme (cromosoma 11) - autosmica recesiva

Fibrosis qustica (cromosoma 7, bsicamente) - autosmica recesiva
Fenilcetonuria (cromosoma 12, bsicamente) - autosmica recesiva
Enfermedad de Batten (cromosoma 16) - autosmica recesiva
Hemocromatosis (cromosoma 6 la forma clsica) - autosmica recesiva
Deficiencia de alfa-1 antitripsina (cromosoma 14) - autosmica recesiva
Enfermedad de Huntington (cromosoma 4) - autosmica dominante
Enfermedad de Marfan (cromosoma 15, bsicamente) - autosmica dominante
Distrofia muscular de Duchenne (cromosoma X)) - ligada al sexo recesiva
Sndrome de cromosoma X frgil (cromosoma X) - ligada al sexo recesiva
Hemofilia A (cromosoma X) - ligada al sexo recesiva
 TIPOS DE POLIMORFISMOS

Polimorfismo de nucletido simple (SNP, del ingls

Single Nucleotide Polymorphism).

Polimorfismos de longitud de fragmentos de

restriccin (RFLP, del ingls Restriction Fragment
Length Polymorphism). En desuso.

Polimorfismos en el nmero de repeticin en

tandem (VNTR, del ingls Variable Number Tandem
Repeats).

STR (Short Tandem Repeats).

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Anlisis de diferentes
VNTR a la vez
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VNTR

1- Corte con enzimas de restriccin del ADN gnomico a analizar.

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2- Electroforesis de las muestras. 3-Transferencia a membrana

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4. Hibridacin con sonda radioactiva

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5- Autorradiografa.
Southern blot de un
VNTR tetra-allico de
una familia
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Evidencia

Sospechosos: 1,2,3,4,5,6

Vctima: 7
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Short Tandem Repeats (STRs)

AATG

7 repeticiones

8 repeticiones
La regin repetida es variable entre muestras mientras
que las regiones laterales donde se unen los cebadores
para la PCR son constantes.
Homocigota = Ambos alelos tienen el mismo nmero de
repeticiones
Heterocigota = Los alelos son distintos y pueden ser diferenciados
 Short Tandem Repeats (STRs) o Microsatlites

Formados por unidades de repeticin cortas 2-7 bases de

longitud.
Tipos genticos se determinan contando el nmero de
repeticiones presentes.
Estas pequeas porciones de ADN se amplifican por PCR.

FBI utiliza un core de 13 STRs (ms 5

ubicados en cromosoma Y, junto con AMEL
para determinar el sexo) para incriminar
sospechosos.
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Primer aminocido de la Codn stop

hGH madura

Remocin de codones Corte con EcoRI

para los aminocidos
1-24

Aislar el fragmento de
ADN que codifica para
los aminocidos 24-191

Oligonucletido sinttico para

los aminocidos 1-24 Ligar

Metionina
iniciadora Corte con
HindIII

Ligar Vector de expresin

Metionina
iniciadora
Secuencia de la hGH

Promotor

E. coli transformada
La hGH se acumula
dentro de la clula
bacteriana

hGH aislada del

extracto bacteriano

Metionina iniciadora
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Productos
Anticoagulantes, TPA
Factores de la coagulacin, Factor VIII
Factores estimulantes de colonias (CSF)
Eritropoyetina
Factores de crecimiento
Hormona de crecimiento humana (hGH)
Insulina humana
Interferones
Interleuquinas
Anticuerpos monoclonales (mAbs)
Superxido dismutasa (SOD)
Vacunas
Usos
Activa plasmina, una enzima involucrada en la disolucin de los trombos,
por lo tanto efectivo en el tratamiento de pacientes con afecciones
cardacas o circulatorias en general.
Promueve la coagulacin deficiente en pacientes hemoflicos; su uso
elimina los riesgos de infeccin generados por mltiples transfusiones.
Son factores de crecimiento del sistema inmune que estimulan la
produccin de leucocitos, usados para tratar deficiencias inmunolgicas y
contra infecciones.
Estimula la produccin de eritrocitos; usado para tratar anemias en
pacientes con enfermedades hepticas.
Estimula la diferenciacin y crecimiento de varios tipos celulares, usado
para promover curacin de heridas.
Usada para tratar el enanismo
Usada para tratar diabetes
Interfieren con la replicacin viral, usados para tratamiento de algunos
tumores.
Activan y estimulan diferentes clases de leucocitos; posibles usos en
infeccin con VIH, cncer y deficiencias inmunolgicas.
Especificidad de unin, usados en: tests diagnsticos, transporte dirigido
de drogas, toxinas o compuestos radioactivos como terapia antitumoral.
Previene dao tisular de las especies reactivas del oxgeno cuando el
tejido brevemente se somete a bajo oxgeno para luego aumentar
abruptamente como en cirugas.
Protenas derivadas de la cpside viral efectivas en alertar al sistema
inmune pero ms seguras que las tradicionales a virus inactivado.
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Plsmidos. Son molculas de ADN circular, con un tamao menor

que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma
bacteriano ya que tienen su propio origen de replicacin.
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Transformacin-
Animacin
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FISH