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Replicación

• Principio Universal procariotes eucariotes
• Reproducción individuo, preservación especie
• Objetivo: 2 copias exactas para 2 células hijas. De cigoto a
indivíduo (1014) vida (1023).
• Alta fidelidad, verificación y reparación: estabilidad genética
individuo y especie
• Fase S ciclo celular Semiconservativa, bidireccional
• Varias DNA polimerasas (varias: replicación, reparación, ambas)
• Otras proteínas reconocen DNA, estructura, mutaciones, proteínas
entorno celular, etc.)
• Una cadena continua y la otra discontinua (Okazaki en eucariotes
cada tira tiene distinta polimerasas y proteínas)
• Fallas en replicación: enfermedades degenerativas, cáncer
• http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.
htm
Replicación necesita:
• Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP,
dTTP
• Origen de replicación (secuencia específica). Reconocimiento
 200-300 bp una cadena rica en A yTs.
• DNA polimerasa: siempre sintetiza 5’ -> 3’ varias
replicación, reparación. Procariota/eucariota.
Mitocondrial/nuclear.
• Primer (iniciador): necesita 3’OH para iniciar. RNA cebador,
DNA (virus), telomerasa, proteínas (virus).
• Complejo con otras proteínas: ligasas, helicasa, SSB,
primasa, topoisomerasa, etc.
Origen de Replicación
Esquema general de la replicación

Dirección del
desenrrollamiento

topoisomerasas
helicasas
primer RNA

(cadena discontínua)
(cadena contínua)
Esquema de las burbujas de
replicación en eucariotas
(E. coli) 1 sola horquilla de replicación 30’ Genoma 4.5 millones bp (4.5
Mb)
Genoma humano (3, 200 millones de pares de bases), cuanto tiempo?
500 horas (20 días?). Linfocitos en cultivo 20 horas => varios puntos a
la vez,  20,000 puntos,  150 kb c/u
Antibióticos y replicación
• Actúan en precursores o maquinaria
• Sulfonamidas: inhibe ácido fólico bacteriano.
Metotrexato inhibe ácido fólico eucariota
• Hidroxiúrea inhibe ribosa => dribosa
• Arabinósidos: imita ribosa (no tiene 3’OH) en
nucleótido. Citarabina (antileucémicos), ara A
(antiviral). Primasa y DNA Polimerasa afectados
• Modificación: agentes alquilantes (ciclofosfamidas,
mitomicina), rayos X
• Inhibición topoisomerasas: quinolonas bacterianas,
ciprofloxacina, norfloxacina. Irinotecán eucariotas.
• Mitosis: Taxol, vinblastina, vincristina.
Arabinósidos
Irinotecan
Topoisomerasa
Genoma Humano

– 22 pares autosomas + XX/XY
– 20,000 genes traducidos a proteínas; pero > de
300,000 proteínas.
– 3 mil millones de bases (nucleótidos, letras de DNA)
– Desarrollo de databases genómicas y de expresión en
otras especies
– Conservación en secuencias codantes (>>) y no
codantes (<)
Mutaciones
• Cambio permanente en la información genética
• Tamaño:
– Microscópico: a nivel de cromosomas (cientos de genes)–
mínimo 2 Mb
– Submiscroscópico: 1 base a 2 Mb = molecular
• Herencia:
– Somática (no pasa a las siguientes generaciones), cáncer
esporádico.
– Germinal: en gametos, es transmitido a través de
generaciones
• Causa variabilidad, cambios, enfermedades, evolución.
Tipos de mutaciones a nivel de una o
pocas bases
Referencia normal: AACGTTGACCC

Sustituciones: AACGTCGACCC
TG
Deleciones: AACGTACCC

Inserciones: AACGTTAAGTGACCC

Repeticiones: AACGTTGTTGTTGACCC
Algunas mutaciones a nivel de cientos
de bases

• Expansión (Huntington, X-frágil)
• Duplicación de un gen (Charcot Marie Tooth)
• Deleción de varios genes (Síndrome de Williams)
• Transposones y retrovirus: segmentos móviles
inserción/deleción (cientos bases)
• Recombinación desigual (hemofilia)
Recombinación desigual
Normal Secuencias parecidas

Mutación
Causas de Mutaciones
• Internas (espontáneas): depurinación, depirimidinación,
oxidación (H2O2), metilación, desaminación.
Transposones: retrovirus endógenos, retrotransposones
Error mitosis, meiosis

• Externas (inducidas): radiación: X, g, UV, policíclicos
aromáticos (benzopireno, humo, brea, naftalina)
G
Puede convertirse en A
C
T

Puede convertirse en
T o ser eliminada

Bloqueo en
replicación o en
transcripción
Reparación
• Integridad de la información genética
– Funcionamiento normal
– Transmisión de los caracteres
• Chequeo:
– Replicación: DNA polimerasa 3’endonucleassa
– Reparación de daño
• Problemas de reparación: enfermedades
degenerativas (envejecimiento celular) y cáncer
MMR
Sistema de reparación

• Más de 150 genes conocidos
• Varios complejos proteicos en sistema de
recombinación (sensores moleculares)
• Homología de genes de reparación conservada en
evolución
• Pasos: reconocimiento -> endonucleasa ->
exonucleasa/helicasa -> DNA polimerasa-> ligasa
(BER) Escisión de 1 base

-Depurinación (rotura de
enlace glucosídico) espontánea
-Desaminación de A y C y
remoción por N-glucosidadasa

< 2nm
Reparación por desigualdad
MMR (mismatch repair)

Si la nueva hebra está
equivocada, cómo reconocemos
la correcta, (antigua?)

5’ CCATAGATTATT 3’
3’ GGTAGCTAATAA 5’

Defecto de apareamiento

hebra antigua es metilado, nueva
todavía
(NER) Reparación por escisión de nucleótidos

- Daño a varias bases
(hasta ~ 30)
-UV: dímeros de timina, > 2nm
- Daño con distorsión física
- Xeroderma pigmentosa
Síndrome de Cockayne,
tricotiodistrofia
Reparación por recombinación homóloga y NO homóloga

Double strand break

Non homologous Secuencia
End joining idéntica Secuencia
parecida

Traslocación, inversión
Xeroderma
Pigmentosa

Síndrome de Cockayne

Xeroderma pigmentosa

Tricotiodistrofia
Síndromes debidos a fallas en reparación (1)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2288663/pdf/nihms22628.pdf
Síndromes debidos a fallas en reparación (2)

Síndrome Característica clínica Nivel celular Gen

hMSH2, MLH1, PMS1, 2: reconocen mal apareamiento
(mismatch)
BRCA1, 2: reconocimiento mutaciones doble hebra y supresor de
tumor (interrumpe ciclo celular)
Algunos Genes de Reparación y enfermedades
Permanente Programa

Ejecución
Temporal
Diferencia entre transcripción mRNA
eucariote/procariote

Procariotes: colinearidad
3 DNA:RNA:Proteína
1
2 Eucariotes modificación:
1) CAP
2) Empalme (splicing)
3) Cola poli A
RNA polimerasas
• Necesitan señales de reconocimiento (en DNA): inicio, final,
regulación
• Necesitan una plantilla de DNA:

5’ -------------------------------------> 3’ tira codificadora
3’ <------------------------------------- 5’ tira plantilla
5’ -------------------------> 3’ RNA

• NTP (ATP, CTP, GTP, UTP)
• Complejos proteicos: RNA + factores de transcripción
(proteínas activadoras)
Promotor bacteriano

Caja TTGA Caja TATA

(A/G)

La transcripción no se produce en cualquier punto, solo en inicio de
genes
Promotores: secuencias que indican el sitio y la frecuencia de fijación
de la RNA polimerasa en la plantilla DNA
Una forma de terminación de la transcripción
(a)
• Sector del molde rico en A
es transcrito a secuencia
rico en U (a)

• Formación de horquillas
por (b)
la unión de G-C (amarillo)
(b)

c) Enlaces A-U son
inestables
y conllevan a disociación,
liberando transcrito (c)
primario
(c)
Transcripción en eucariotes
• Tres polimerasas principales, muchas
subunidades, factores y elementos reguladores

• RNA pol I: rRNA (28S, 18S y 5.8S)
• RNA pol II: hnRNA/mRNA, snRNA
• RNA pol III: tRNA, 5S rRNA, snRNA
Transcripción y procesamiento de un gen
típico eucariota

Promotor Zona Reguladora Fin
Inicio

Intrón Exón
DNA

transcrito hnRNA
5’UTR mRNA
5’ untranslated region 3’UTR
Transcripción: DNA (ACGT) => RNA (ACGU)
Procesamiento del precursor-mRNA
• En núcleo. Sólo mRNA maduro a citoplasma (R.E.
para proteínas)
• Transcripción primaria: RNA heterogéneo nuclear
(hnRNA): exones + intrones. Varía de <1 Kb a >2
Mb (distrofina)
• Modificaciones para tener mRNA maduro:
– CAP: (5´-m7G) extremo 3’
– Cola Poli A, extremo 5’
– Splicing: empalme de exones, interno
Función del cap

• Proteger 5’-mRNA- de exonucleasas
• Facilitar el transporte del núcleo a citoplasma
• Facilitar el splicing (empalme)
• Reconocimiento por la subunidad 40S rRNA
para síntesis de proteínas
Poliadenilación (cola poli A)
• Final gen RNA secuencia de terminación:
AAUAAA
• Continúa polimerizando varias centenas o kbs
en 3’ (corriente abajo-downstream)
• Corte 15 a 30 nt. después de AAUAAA
• Adición de ~ 200 adeninas por “poli (A)
polimerasa”
Adición de poli A

RNAPol II endonucleasa
señal
Cientos o miles nt

poli(A)
Pol

 200 nt
Posible rol de poli (A)

• Facilitar transporte al citoplasma
• Alargar la vida útil del mRNA (más A’s,
más tiempo)
• Reconocimiento por la maquinaria de
traducción (ribosomas)
Splicing (empalme)

• >> genes eucariotes interrumpidos
– Exón: secuencia codante (80-120 nt)
– Intrón: secuencia interruptora (promedio 10,000
nt)
• Eliminación intrones en núcleo
• Spliceosoma (empalmosoma) complejo de
proteínas y RNAs (mRNA-SnRNAs)
• Transporte al citoplasma solo como mRNA
CPuAPy

Branch site 20-50 nucleòtidos del final 3’ del intrón

Branch site
Mecanismo de Empalme (splicing)
5 CUPuAPy 3´
´ 20-50 nt

U1 U5

U2 3´

U4 snRNP(U1,
U6 3´
U2 U2,U4,
U5,U6)
(proteinas)
Gen RPGR-cromosoma X

Exon 14

Intrón 13

Genómico RT-PCR (mRNA)
Fujita et al., 1997 Am. J Hum Genet 61: 571-580
Mutación IVS 14 -7 RPGR

ttcaaaaaatttacagAAA CAA

ttcaaaaagtttacagAAA CAA
Fujita et al., 1997 Am. J Hum Genet 61: 571-580
Empalme alternativo
• Dogma antiguo: 1 gen (mRNA) = una proteína=> falso
• Ser humano ~ 25,000 genes, Drosophila melanogaster
13,000, Caenorrhabditis elegans 18,000.
• Ser humano más de 300,000 proteínas distintas
• Complejidad?

• 1 gen = diferentes proteínas depende de tejido:
diferente combinación de exones 0
Empalme alternativo del gen Calcitonina

DNA 5’ 3’

hnRNA 5’ A B C D Calcitonina CGRP 3’

AoB C D Calcitonina AoB C D CGRP

Traducción
y procesamiento
Tiroides Hipotálamo

Calcitonina CGRP
32 aa 37 aa
(calcitonin gene related protein)
Alternative splicing results in different mature mRNAs and proteins.
In mammals, the protein tropomyosin is encoded by a gene that has 11 exons.
Tropomyosin pre-mRNA is spliced differently in different tissues, resulting in five
different forms of the protein.
Algunos tipos de empalme alternativo
Especificidad de tejidos en expresión de Genes
• Células del cuerpo humano:
• Genéticamente clones
• Física y funcionalmente distintos

• 2 tipos principales de expresión:
• Genes de mantenimiento (housekeeping):
todas células, genes metabolismo de
azúcares, nucleótidos, aminoácidos,
microtúbulos
• Genes específicos de tejido: solo en
algunas células: insulina, rodopsina,
globinas
Cigoto con Igual info genética
citoplasma, diferente expresión por
proteínas, mRNAs proteínas regulatorias
maternos para
divisiones sucesivas
Procesamiento del precursor-mRNA
• En núcleo. Sólo mRNA maduro a citoplasma (R.E.
para proteínas)
• Transcripción primaria: RNA heterogéneo nuclear
(hnRNA): exones + intrones. Varía de <1 Kb a >2
Mb (distrofina)
• Modificaciones para tener mRNA maduro:
– CAP: (5´-m7G) extremo 3’
– Cola Poli A, extremo 5’
– Splicing: empalme de exones, interno
CAP (capuchón)
Modificación en 5` 3’
dición guanina-metilada de cabeza
5’ G

5’ Pu

3’