Replicacin

Principio Universal procariotes eucariotes

Reproduccin individuo, preservacin especie
Objetivo: 2 copias exactas para 2 clulas hijas. De cigoto a
indivduo (1014) vida (1023).
Alta fidelidad, verificacin y reparacin: estabilidad gentica
individuo y especie
Fase S ciclo celular Semiconservativa, bidireccional
Varias DNA polimerasas (varias: replicacin, reparacin, ambas)
Otras protenas reconocen DNA, estructura, mutaciones, protenas
entorno celular, etc.)
Una cadena continua y la otra discontinua (Okazaki en eucariotes
cada tira tiene distinta polimerasas y protenas)
Fallas en replicacin: enfermedades degenerativas, cncer
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.
htm
 Replicacin necesita:
Deoxinucletidos trifosfato (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP,
dTTP
Origen de replicacin (secuencia especfica). Reconocimiento
200-300 bp una cadena rica en A yTs.
DNA polimerasa: siempre sintetiza 5 -> 3 varias
replicacin, reparacin. Procariota/eucariota.
Mitocondrial/nuclear.
Primer (iniciador): necesita 3OH para iniciar. RNA cebador,
DNA (virus), telomerasa, protenas (virus).
Complejo con otras protenas: ligasas, helicasa, SSB,
primasa, topoisomerasa, etc.
Origen de Replicacin
 Esquema general de la replicacin

Direccin del
desenrrollamiento

topoisomerasas
helicasas
primer RNA

(cadena discontnua)
(cadena contnua)
 Esquema de las burbujas de
replicacin en eucariotas
(E. coli) 1 sola horquilla de replicacin 30 Genoma 4.5 millones bp (4.5
Mb)
Genoma humano (3, 200 millones de pares de bases), cuanto tiempo?
500 horas (20 das?). Linfocitos en cultivo 20 horas => varios puntos a
la vez, 20,000 puntos, 150 kb c/u
 Antibiticos y replicacin
Actan en precursores o maquinaria
Sulfonamidas: inhibe cido flico bacteriano.
Metotrexato inhibe cido flico eucariota
Hidroxirea inhibe ribosa => dribosa
Arabinsidos: imita ribosa (no tiene 3OH) en
nucletido. Citarabina (antileucmicos), ara A
(antiviral). Primasa y DNA Polimerasa afectados
Modificacin: agentes alquilantes (ciclofosfamidas,
mitomicina), rayos X
Inhibicin topoisomerasas: quinolonas bacterianas,
ciprofloxacina, norfloxacina. Irinotecn eucariotas.
Mitosis: Taxol, vinblastina, vincristina.
 Arabinsidos
Irinotecan
Topoisomerasa
 Genoma Humano

22 pares autosomas + XX/XY

20,000 genes traducidos a protenas; pero > de
300,000 protenas.
3 mil millones de bases (nucletidos, letras de DNA)
Desarrollo de databases genmicas y de expresin en
otras especies
Conservacin en secuencias codantes (>>) y no
codantes (<)
 Mutaciones
Cambio permanente en la informacin gentica
Tamao:
Microscpico: a nivel de cromosomas (cientos de genes)
mnimo 2 Mb
Submiscroscpico: 1 base a 2 Mb = molecular
Herencia:
Somtica (no pasa a las siguientes generaciones), cncer
espordico.
Germinal: en gametos, es transmitido a travs de
generaciones
Causa variabilidad, cambios, enfermedades, evolucin.
 Tipos de mutaciones a nivel de una o
pocas bases
Referencia normal: AACGTTGACCC

Sustituciones: AACGTCGACCC
TG
Deleciones: AACGTACCC

Inserciones: AACGTTAAGTGACCC

Repeticiones: AACGTTGTTGTTGACCC
Algunas mutaciones a nivel de cientos
de bases

Expansin (Huntington, X-frgil)

Duplicacin de un gen (Charcot Marie Tooth)
Delecin de varios genes (Sndrome de Williams)
Transposones y retrovirus: segmentos mviles
insercin/delecin (cientos bases)
Recombinacin desigual (hemofilia)
 Recombinacin desigual
Normal Secuencias parecidas

Mutacin
 Causas de Mutaciones
Internas (espontneas): depurinacin, depirimidinacin,
oxidacin (H2O2), metilacin, desaminacin.
Transposones: retrovirus endgenos, retrotransposones
Error mitosis, meiosis

Externas (inducidas): radiacin: X, g, UV, policclicos

aromticos (benzopireno, humo, brea, naftalina)
 G
Puede convertirse en A
C
T

Puede convertirse en
T o ser eliminada

Bloqueo en
replicacin o en
transcripcin
 Reparacin
Integridad de la informacin gentica
Funcionamiento normal
Transmisin de los caracteres
Chequeo:
Replicacin: DNA polimerasa 3endonucleassa
Reparacin de dao
Problemas de reparacin: enfermedades
degenerativas (envejecimiento celular) y cncer
MMR
 Sistema de reparacin

Ms de 150 genes conocidos

Varios complejos proteicos en sistema de
recombinacin (sensores moleculares)
Homologa de genes de reparacin conservada en
evolucin
Pasos: reconocimiento -> endonucleasa ->
exonucleasa/helicasa -> DNA polimerasa-> ligasa
(BER) Escisin de 1 base

-Depurinacin (rotura de
enlace glucosdico) espontnea
-Desaminacin de A y C y
remocin por N-glucosidadasa

< 2nm
Reparacin por desigualdad
MMR (mismatch repair)

Si la nueva hebra est

equivocada, cmo reconocemos
la correcta, (antigua?)

5 CCATAGATTATT 3
3 GGTAGCTAATAA 5

Defecto de apareamiento

hebra antigua es metilado, nueva

todava
 (NER) Reparacin por escisin de nucletidos

- Dao a varias bases

(hasta ~ 30)
-UV: dmeros de timina, > 2nm
- Dao con distorsin fsica
- Xeroderma pigmentosa
Sndrome de Cockayne,
tricotiodistrofia
 Reparacin por recombinacin homloga y NO homloga

Double strand break

Non homologous Secuencia

End joining idntica Secuencia
parecida

Traslocacin, inversin
Xeroderma
Pigmentosa

Sndrome de Cockayne

Xeroderma pigmentosa

Tricotiodistrofia
 Sndromes debidos a fallas en reparacin (1)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2288663/pdf/nihms22628.pdf
 Sndromes debidos a fallas en reparacin (2)

Sndrome Caracterstica clnica Nivel celular Gen

hMSH2, MLH1, PMS1, 2: reconocen mal apareamiento

(mismatch)
BRCA1, 2: reconocimiento mutaciones doble hebra y supresor de
tumor (interrumpe ciclo celular)
Algunos Genes de Reparacin y enfermedades
 Permanente Programa

Ejecucin
Temporal
 Diferencia entre transcripcin mRNA
eucariote/procariote

Procariotes: colinearidad
3 DNA:RNA:Protena
1
2 Eucariotes modificacin:
1) CAP
2) Empalme (splicing)
3) Cola poli A
 RNA polimerasas
Necesitan seales de reconocimiento (en DNA): inicio, final,
regulacin
Necesitan una plantilla de DNA:

5 -------------------------------------> 3 tira codificadora

3 <------------------------------------- 5 tira plantilla
5 -------------------------> 3 RNA

NTP (ATP, CTP, GTP, UTP)

Complejos proteicos: RNA + factores de transcripcin
(protenas activadoras)
 Promotor bacteriano

Caja TTGA Caja TATA

(A/G)

La transcripcin no se produce en cualquier punto, solo en inicio de

genes
Promotores: secuencias que indican el sitio y la frecuencia de fijacin
de la RNA polimerasa en la plantilla DNA
 Una forma de terminacin de la transcripcin
(a)
Sector del molde rico en A
es transcrito a secuencia
rico en U (a)

Formacin de horquillas
por (b)
la unin de G-C (amarillo)
(b)

c) Enlaces A-U son

inestables
y conllevan a disociacin,
liberando transcrito (c)
primario
(c)
 Transcripcin en eucariotes
Tres polimerasas principales, muchas
subunidades, factores y elementos reguladores

RNA pol I: rRNA (28S, 18S y 5.8S)

RNA pol II: hnRNA/mRNA, snRNA
RNA pol III: tRNA, 5S rRNA, snRNA
 Transcripcin y procesamiento de un gen
tpico eucariota

Promotor Zona Reguladora Fin

Inicio

Intrn Exn
DNA

transcrito hnRNA
5UTR mRNA
5 untranslated region 3UTR
Transcripcin: DNA (ACGT) => RNA (ACGU)
Procesamiento del precursor-mRNA
En ncleo. Slo mRNA maduro a citoplasma (R.E.
para protenas)
Transcripcin primaria: RNA heterogneo nuclear
(hnRNA): exones + intrones. Vara de <1 Kb a >2
Mb (distrofina)
Modificaciones para tener mRNA maduro:
CAP: (5-m7G) extremo 3
Cola Poli A, extremo 5
Splicing: empalme de exones, interno
 Funcin del cap

Proteger 5-mRNA- de exonucleasas

Facilitar el transporte del ncleo a citoplasma
Facilitar el splicing (empalme)
Reconocimiento por la subunidad 40S rRNA
para sntesis de protenas
 Poliadenilacin (cola poli A)
Final gen RNA secuencia de terminacin:
AAUAAA
Contina polimerizando varias centenas o kbs
en 3 (corriente abajo-downstream)
Corte 15 a 30 nt. despus de AAUAAA
Adicin de ~ 200 adeninas por poli (A)
polimerasa
Adicin de poli A

RNAPol II endonucleasa
seal
Cientos o miles nt

poli(A)
Pol

200 nt
 Posible rol de poli (A)

Facilitar transporte al citoplasma

Alargar la vida til del mRNA (ms As,
ms tiempo)
Reconocimiento por la maquinaria de
traduccin (ribosomas)
 Splicing (empalme)

>> genes eucariotes interrumpidos

Exn: secuencia codante (80-120 nt)
Intrn: secuencia interruptora (promedio 10,000
nt)
Eliminacin intrones en ncleo
Spliceosoma (empalmosoma) complejo de
protenas y RNAs (mRNA-SnRNAs)
Transporte al citoplasma solo como mRNA
 CPuAPy

Branch site 20-50 nucletidos del final 3 del intrn

Branch site
 Mecanismo de Empalme (splicing)
5 CUPuAPy 3
20-50 nt

U1 U5

U2 3

U4 snRNP(U1,
U6 3
U2 U2,U4,
U5,U6)
(proteinas)
 Gen RPGR-cromosoma X

Exon 14

Intrn 13

Genmico RT-PCR (mRNA)

Fujita et al., 1997 Am. J Hum Genet 61: 571-580
 Mutacin IVS 14 -7 RPGR

ttcaaaaaatttacagAAA CAA

ttcaaaaagtttacagAAA CAA
Fujita et al., 1997 Am. J Hum Genet 61: 571-580
 Empalme alternativo
Dogma antiguo: 1 gen (mRNA) = una protena=> falso
Ser humano ~ 25,000 genes, Drosophila melanogaster
13,000, Caenorrhabditis elegans 18,000.
Ser humano ms de 300,000 protenas distintas
Complejidad?

1 gen = diferentes protenas depende de tejido:

diferente combinacin de exones 0
 Empalme alternativo del gen Calcitonina

DNA 5 3

hnRNA 5 A B C D Calcitonina CGRP 3

AoB C D Calcitonina AoB C D CGRP

Traduccin
y procesamiento
Tiroides Hipotlamo

Calcitonina CGRP
32 aa 37 aa
(calcitonin gene related protein)
Alternative splicing results in different mature mRNAs and proteins.
In mammals, the protein tropomyosin is encoded by a gene that has 11 exons.
Tropomyosin pre-mRNA is spliced differently in different tissues, resulting in five
different forms of the protein.
Algunos tipos de empalme alternativo
Especificidad de tejidos en expresin de Genes
Clulas del cuerpo humano:
Genticamente clones
Fsica y funcionalmente distintos

2 tipos principales de expresin:

Genes de mantenimiento (housekeeping):
todas clulas, genes metabolismo de
azcares, nucletidos, aminocidos,
microtbulos
Genes especficos de tejido: solo en
algunas clulas: insulina, rodopsina,
globinas
Cigoto con Igual info gentica
citoplasma, diferente expresin por
protenas, mRNAs protenas regulatorias
maternos para
divisiones sucesivas
Procesamiento del precursor-mRNA
En ncleo. Slo mRNA maduro a citoplasma (R.E.
para protenas)
Transcripcin primaria: RNA heterogneo nuclear
(hnRNA): exones + intrones. Vara de <1 Kb a >2
Mb (distrofina)
Modificaciones para tener mRNA maduro:
CAP: (5-m7G) extremo 3
Cola Poli A, extremo 5
Splicing: empalme de exones, interno
 CAP (capuchn)
Modificacin en 5` 3
dicin guanina-metilada de cabeza
5 G

5 Pu