Cultivo in vitro de vegetales

Zelmira Ilaria Encarnacion Baltazar

 Principales Aplicaciones de la Biotecnologa
Resolucin de problemas productivos

Estudio de procesos fisiolgicos y bioqumicos.

Ingeniera gentica en plantas y animales.
Produccin de inoculantes para leguminosas.
Fermentaciones microbianas.
Produccin de reactivos de diagnstico de enfermedades
de plantas y animales.
Conservacin de germoplasma.
Fertilizacin in vitro
Trasplante de embriones.
Produccin de hormonas.
Produccin de enzimas para la industria lctea
Historia del cultivo de tejidos
 Historia

Dcada del 30. Primer regulador descubierto, la auxina.

1952. Morel y Martin. Primera Aplicacin del Microinjerto.
1955. Miller et al. Descubrieron las citokininas.
1960. Kanta. Propagacin vegetativa de orqudeas por
cultivo de meristemas.
1962. Muirashige y Skoog. Desarrollo del medio MS.
1969. Erickson y Jonasesen. Aislamiento de protoplastos.
1980. Alfermann et al. Utilizaron clulas completas para
biotransformacin.
 Establecimiento y condiciones de crecimiento del el
cultivo in vitro
Para tener xito en los cultivos in vitro es necesario:
1- ASEPSIA Y ESTERILIZACIN
2- ELECCIN DE LOS EXPLANTES
3- ELECCIN DEL MEDIO DE CULTIVO
4- BUENAS CONDICIONES DE CRECIMIENTO
1- Asepsia:
Ausencia de microorganismos patgenos
Es una condicin esencial en el xito del cultivo in vitro

Para trabajar con cultivos aspticos es necesario:

Trabajar en ambientes adecuados.

Esterilizacin de instrumentos y medios de cultivo
Esterilizacin de recipientes de cultivo
Precaucin del operario
 ESTERILIZACIN
Proceso mediante el cual cualquier material, sitio o
superficie se libera de cualquier microorganismo vivo o
espora.
Procedimientos de esterilizacin
1- Calor seco (170C 2 o 3 horas)
2- Vapor bajo presin.
121C, 20 minutos.
Sacarosa Glucosa + Fructosa
Cambio de pH baja 0,3 a 0,5 unidades
Caramelizacin de los azcares (160C) y formacin de
compuestos txicos.
Precipitacin de sales.
Depolimerizacin del agar.
3- Calor hmedo a 100C.
4- Filtracin
2- Preparar y desinfectar los explantos.
Preparacin de los explantos agua, fertilizacin, etiolacin,
sanidad, pulverizaciones peridicas)
Desinfeccin de los explantes (etanol 70%,hipoclorito de sodio
3%,hipoclorito de calcio 6 a 12 %,cloruro de mercurio 0,1 a 1,5 %).
3-Eleccin del medio de cultivo.
Composicin qumica: agua, sales minerales, vitaminas, agar,
carbohidratos, aminocidos, reguladores de crecimiento y otros.
El xito de la utilizacin de un medio es lograr las concentraciones
lo ms cercanas al ptimo de las clulas o plantas para su
crecimiento y diferenciacin.
4- Buenas condiciones de crecimiento.
Para tener xito en los cultivos in vitro es necesario:
cmara de crecimiento (temperatura , luz y humedad).
 Temperatura
1- constante 25, rango 17-32C.
clima tropicales algodn, arroz ,citrus 28C
clima templado 22C
especies bulbosas 18C
2- diferencias de temperatura de la cmara y recipientes
3- Problemas: altas y bajas temp. disminuye el crecimiento
4- tratamientos de frio - bulbillos- dormancia 1-10C.
plantas leosas-dormancia GA3 o fro 2-4C
Luz
Requerimientos in vitro
Fotoperiodo 16hrs luz/8hrs oscuridad
tubos fluorescentes 1000-5000lux (luz blanca fra)
 HUMEDAD RELATIVA
Cantidad de vapor de agua contenida en la
atmsfera gaseosa
Tapado y tipo de los recipientes
Importancia: desecacin e infecciones
Tapones: aluminio, rollo pack, plstico,
algodn.
Tener en cuenta: intercambio gaseoso,
humedad en el recipiente, pasaje de luz
 Cultivo de tejidos
Definicin: Cultivo sobre un medio artificial, en
condiciones estriles de plantas, semillas,
embriones, rganos, tejidos, clulas y
protoplastos de plantas.
Teora de la totipotencia, Schwann & Schleiden,
1938. Habilidad que tienen los organismos para
regenerar otros completos a partir de una parte
de ellos.
Hiptesis del balance hormonal.
 Caractersticas del cultivo in vitro
In vitro proviene de in vidrio.
Se realiza sobre superficies relativamente
pequeas.
Se optimizan las condiciones ambientales:
factores fsicos, nutricionales y hormonales.
Se excluyen todos los microorganismos(
hongos, bacterias y virus), y plagas( insectos
y nematodos).
Principio del cultivo de tejidos in vitro
Aislar una parte de la planta.
Asepsia.
Condiciones adecuadas para el
desarrollo del explante(Medio de
cultivo apropiado, buenas
condiciones del explante).
Principales Existentres conceptos bsicos que
conceptos fundamentan el cultivo in vitro de
fisiolgicos
aplicables a los clulas y tejidos vegetales:
cultivos in vitro

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciacin / Rediferenciacin

- Balance de reguladores del crecimiento

vegetal
Fundamentos
tericos y prcticos La teora de la totipotencialidad celular, enunciada
del cultivo de por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda
tejidos vegetales clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta
entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de
diferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones
especficas referidas al medio del cultivo, relaciones
hormonales, temperatura, fotoperodo, etc.

La desdiferenciacin consiste en la transformacin y

prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo
celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. El
siguiente paso involucrado en la regeneracin de una planta
es la rediferenciacin de las clulas previamente
desdiferenciadas.

Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance

entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento,
fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Tcnicas
del cultivo de Micropropagacin vegetal
clulas y
tejidos vegetales Regeneracin de plantas
(embriognesis y organognesis)
Cultivo de meristemos
Cultivo de suspensiones de clulas vegetales
Cultivo de protoplastos
Cultivo de anteras
Cultivo de vulos y embriones
Micropropagacin vegetal
La La micropropagacin vegetal, o propagacin clonal
micropropagacin masiva de plantas superiores, posibilita la obtencin
constituye la y cultivo de plantas a gran escala.
principal aplicacin
Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en
comercial del un medio sinttico nutritivo y con control de temperatura,
cultivo de tejidos luz y fotoperodo.
vegetales
Consideraciones tcnicas de la propagacin
clonal masiva de plantas
La
micropropagacin Laboratorio
vegetal requiere - Area de preparacin de medios.
disponer de una - Area de lavado y esterilizacin.
infraestructura - Cuarto estril.
mnima - Cmara de cultivo.
especializada - Area de rusticacin.
y de condiciones
controladas Material vegetal
de cultivo
- Plantas madres seleccionadas
(pre-acondicionamiento).
- Explantes (eleccin, diseccin,
esterilizacin, etc.).

Condiciones de cultivo
- Asepsia.
- Recipientes.
- Temperatura.
- Luz y fotoperodo.
Medios de cultivo: composicin general

Compuestos inorgnicos Reguladores del crecimiento

Macronutrientes: NO3- , PO43- , K+, Ca2+, Auxinas
Mg2+, SO42- Citocininas
Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Giberelinas
Mo2+, Co2+, I-
Soporte inerte (medios semislidos)
Carbohidratos Agar (0,7 a 1%)
Sacarosa, glucosa, mio-inositol Gelrite

Vitaminas pH
Tiamina (B1) 5,6 5,8
Piridoxina
Acido nicotnico (C) Esterilizacin
Biotina 1 atmsfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Aminocidos
Glicina
Formulacin
bsica
de un medio
de cultivo Soluciones concentradas de macroelementos (100x)
para tejidos vegetales
Soluciones concentradas de microelementos (100x)

Vitaminas grupo B (500 1000x)

Mio-inositol (100 mg/L)

Azcares: Generalmente sacarosa o glucosa

en concentraciones de aproximadamente 30 g/L.

Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso

molecular extrado a partir de algas. Se usa entre
5 y 10 g/L
Propiedades fsicas
de los medios Semislido
de cultivo Consistencia
del medio
Lquido

El metabolismo de los tejidos puede modificarse

dependiendo de las caractersticas del medio de cultivo
(lquido o semi-slido).

En el caso de un medio slido, la concentracin y calidad

del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo
del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.).

El cultivo en medio lquido resulta imprescindible cuando

la propagacin in vitro es desarrollada a travs
de las siguientes vas:

- Induccin de embriognesis*.
- Cultivo de protoplastos.
- Cultivo de suspensiones celulares.

*tambin en medio semislido

Propiedades fsicas Intercambio gaseoso:
de los medios Los recipientes de cultivo se tapan con una pelcula de
de cultivo polietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambio
de gases. La organognesis puede verse modificada
si el intercambio de gases se ve dificultado.
- La induccin de yemas a partir de callos
de tabaco se reduce si no hay suficiente oxgeno.
- La acumulacin de etileno puede inhibir
la regeneracin de brotes.

pH:
- Constituye un factor crtico.
- Se ajusta en el rango 5,5 5,8.
- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos.
Reguladores del crecimiento comnmente usados
en los medios de cultivos vegetales
Reguladores Grupos bsicos de reguladores del crecimiento:
del crecimiento
- Auxinas
- Citocininas
- Giberelinas
- Acido abscsico
- Etileno

Generalidades:
- Actan a bajas concentraciones

- Interactan unos con otros (los resultados

estn determinados por las concentraciones
relativas entre las diferentes fitohormonas).

- Los reguladores endgenos del crecimiento

estn presentes en la planta durante todo
su ciclo de vida pero su concentracin flucta.
Su concentracin relativa vara en funcin
del estado fisiolgico de la planta y en cada
uno de los rganos de sta.

- Estn involucrados en numerosos procesos

fisiolgicos.
 O
Auxinas: estos
compuestos se Acido indol actico (AIA)
emplean bsicamente OH (auxina endgena)
como promotores de N
la proliferacin celular
y la induccin de la Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir
de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero
morfognesis qumico responsable de la elongacin y de la respuesta
fototrpica del coleptilo de gramneas.
- Alargamiento y divisin celular
- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos
- Formacin de races adventicias
- Dominancia apical
- Accin herbicida
- Estimulacin de la produccin de etileno

Se sintetizan en las yemas, las hojas jvenes, los frutos y

en el embrin. La concentracin endgena en la planta vara
entre 0,001 y 0,1 mgKg-1.

Su transporte es polar

Auxinas sintticas:
- Acido indol butrico (IBA)
- Acido naftalen actico (ANA)
- 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)
Citocininas: en Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias
combinacin con las promotoras de la divisin celular in vitro.
auxinas, determinan
diferentes respuestas Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas:
morfogenticas - Promocin de la divisin celular
- Promocin de la organognesis (relacin
auxinas/citocininas)
- Retardo de la senescencia
- Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos

Citocininas endgenas:
- Zeatina (Zea)
- Isopenteniladenina (2iP)

Citocininas sintticas:
- Cinetina (Kin)
- Benziladenina (BAP)

Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentran

en todos los tejidos. La concentracin endgena en
plantas vara entre 0,1 y 500 gKg-1.

Su transporte es no polar.
Las giberelinas se
utilizan para favorecer Acido giberlico (GA3)
el crecimiento y el
alargamiento de los
entrenudos de los
brotes de novo

Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz

infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos
entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando
extractos solubles del hongo.

El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En

la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.

Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos
o plantas bianuales
- Crecimiento de yemas latentes
- Germinacin de semillas en dormancia
- Floracin
- Movilizacin de reservas en la semilla.

Se sintetizan en hojas jvenes, yemas y en el embrin.

Su transporte no es polar.
Etapas del cultivo in vitro
de plantas superiores
Etapas de la Iniciacin o establecimiento
micropropagacin - Eleccin y fitoacondicionamiento de la planta madre
vegetal - Eleccin del explante inicial y de la formulacin
del medio de cultivo
- Desinfeccin superficial de los explantes
- Establecimiento del cultivo in vitro

Multiplicacin

- Multiplicacin del material stock

Enraizamiento

- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro

Aclimatizacin

- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones

de maceta o a campo
Existen dos posibles
vas morfogenticas
implicadas en la Posibles vas morfogenticas:
diferenciacin de novo
de brotes y/o plantas - Organognesis
completas
- Embriognesis

Diferencias entre las dos posibles vas:

- La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo o
cluster de clulas del explante inicial se desdiferenca
inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un
rgano vegetal. No se obtienen por esta va plantas completas
directamente.

- La embriognesis se presupone de origen unicelular.

Una clula del explante se asla y constituye el punto
de partida para la obtencin de un embrin somtico.
Se diferencian embriones o estructuras bipolares
que completan cada una de las etapas implicadas
en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es
una planta completa.
Etapas implicadas
en el protocolo de Eleccin de una planta
madre selecta
micropropagacin
de una especie
Explantes
vegetal
ETAPA 1
Desinfeccin superficial

Establecimiento en medio
de cultivo apropiado

Transferencia a un
medio de multiplicacin
ETAPA 2
Formacin de
brotes o embrioides

Transferencia a un medio
ETAPA 3 para el enraizamiento de
los brotes

Pasaje a maceta en
ETAPA 4
un invernadero
Eleccin del explante inicial
Los explantes deben
ser esterilizados
antes de ser Protocolo tipo de esterilizacin superficial
establecidos en de material vegetal:
condiciones de
cultivo
- Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos.

- Solucin de hipoclorito de sodio (NaCIO)

al 5 a 20%, entre 5 y 30 min
Este paso puede ser reemplazado por el uso
de soluciones diludas de bicloruro de mercurio
(HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.

- Enjuagues con abundante agua estril

(4 5 veces).

- En el caso del HgCl2, el material se debe

enjuagar sucesivas veces pues es difcil
de eliminar.
Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro
Vas morfogenticas:
organognesis y embriognesis
 La morfognesis
La embriognesis somtica y la organognesis
son dos procesos morfognicos muy
frecuentes
en el cultivo in vitro de especies vegetales.
 Embriognesis somtica
La embriognesis somtica es el proceso por
el cual se obtiene una estructura similar a un
embrin cigtico sin que medie la fertilizacin
de las gametas.
Este embrin o embrioide, son formados a partir
de clulas de la nucela; tiene estructura bipolar,
desarrollndose un meristema de tallo y un
meristema de raz del mismo punto, a diferencia
del embrin normal que tiene polaridad
terminada por un meristema de tallo y otro de
raz. Estas forman plantas normales.
Figura 1: A-F embriognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A-C-E, embriognesis
somtica en diferentes, fases de crecimiento observada en Codiaeum variegatum (L) Blume
cultivado en MS + 1 mg l-1 de BAP. B-D-F, embriognesis somtica obtenida en diversos
cultivares de Prunus sp a partir de embriones., zigticos inmaduros cultivados en MS + 0,1
mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin con una previa induccin en MS + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las
reglillas representan 5 mm.
 Factores que afectan la embriognesis somtica
Explante.- son pocos los explantes que tienen
capacidad para formar callos embriognicos. Los
ms usados son: cotiledones, hipoctilos y
embriones, tambin pices caulinares, segmentos
de tallos, hojas, races e inflorescencias maduras.
La respuesta embriognica del callo depende del
genotipo de la planta.
Medio de cultivo.
Reguladores de crecimiento.
Condiciones del medio ambiente.
Otro factores.
Propagacin vegetativa por embriognesis somtica
Embriognesis: Obtencin de semillas artificiales

Semillas sintticas de
orqudea obtenidas por
encapsulacin en alginato
Sistemas de micropropagacin vegetal
 Organognesis
Por organognesis se pueden obtenerse tallos,
races o flores.
Estos rganos son inducidos a partir de una clula o
de un grupo de clulas que, segn las
condiciones de cultivo, tienen la propiedad de
mantenerse en activa divisin.
La organognesis puede ser directa o indirecta, es
directa cuando se regeneran rganos a partir del
explante sin pasar por una etapa intermedia;
pero si se forman callos y despus rganos,
entonces estamos frente a una organognesis
indirecta.
 Factores que afectan la embriognesis
somtica
Explante.
Medio de cultivo.
Reguladores de crecimiento.
Otro factores.
Figura 2: A-E Organognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A, callo organognico obtenido en Abelia sp. (Andr)
Rehder cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. B, Inicio de brotes (flechas) en hojas crecidas in vitro de Crimson Gold
(Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin. C, Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos
a partir del cultivo de captulos florales en MS 0,05 mg l-1 de IBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3. D, brotes
florecidos in vitro de Abelia sp. (Andr) Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E, races (flechas) crecidas de callo de
Abelia sp. (Andr) Rehder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran.
Las reglillas representan 5 mm
Sistemas de micropropagacin vegetal
Proliferacin de yemas axilares o apicales
Propagacin
vegetativa a partir de Proliferacin de yemas apicales o axilares
yemas preexistentes
- Consiste en la multiplicacin de plantas a partir
de las yemas axilares preexistentes.
Representa la aceleracin in vitro del crecimiento
natural de dichos meristemos.

- La tasa de multiplicacin (t.m.) se calcula con

base en el nmero de brotes o vstagos obtenidos
a partir de un explante inicial, entre una resiembra
y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y 20
brotes por mes, dependiendo de la especie
en cuestin, entre otras variables.

- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podran

obtenerse 10.000.000 plantas en un solo ao,
a partir de una nica yema inicial.

- El cultivo de meristemos es un caso especial

del uso de esta tcnica.
Sistemas de micropropagacin vegetal
Proliferacin de tejidos desdiferenciados
Resulta posible
regenerar brotes o
yemas a partir de
tejidos vegetales Consideraciones generales:
desdiferenciados
in vitro
- Callo: masa de clulas desdiferenciadas
obtenidas a partir de un explante cultivado
in vitro (disco de hoja, meristemo,
clulas en suspensin, etc.)

- Es posible regenerar brotes o vstagos a partir

de estos callos.

- Las plantas diferenciadas pueden

no ser uniformes, debido al posible desarrollo
de variantes somaclonales. Esto debe tenerse
en cuenta, especialmente cuando se trabaja en
propagacin clonal a gran escala.
Sistemas de propagacin vegetativa in vitro
Regeneracin directa e indirecta
Sistemas de
propagacin
vegetativa
in vitro