BIOLOGIA MOLECULAR

APLICADA AL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGIA

Dra Daniela Centrón

Depto de Microbiología, Parasitología e Inmunología
de la Facultad de Medicina
de la Universidad de Buenos Aires
CONICET
 Que es la biología molecular?
• Estudio de la biología a nivel molecular

Se superpone con áreas de

la biología y la química, en
particular genética y
bioquímica

• Estudio de los procesos celulares

De la genética clásica a la biología molecular

al diagnóstico especializado……
CONTENIDOS

I. CONCEPTOS BASICOS INTRODUCTORIOS

A. Biosíntesis de ácidos nucleicos: replicación, transcripción.

B. Biosíntesis de proteínas: traducción.
C. Marcos de lectura abiertos. Operones y regulones.

II. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE

A. Enzimas utilizadas en biología molecular.

B. Vectores de clonado y de expresión.
C. Construcción de bibliotecas genómicas.

III. CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA

A. Mutaciones y mutantes.
B. Elementos extracromosómicos. Plásmidos.
C. Adquisición de material genético exógeno.
 IV. METODOLOGIAS BASADAS EN LA IDENTIFICACION
DE SECUENCIAS DE A. NUCLEICOS

A. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

B. Hibridización de ácidos nucleicos.
C. Epidemiología molecular bacteriana.
D. ADN ramificado (branched DNA).
E. Secuenciación de ácidos nucleicos.

V. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE AGENTES

ETIOLOGICOS MICROBIANOS

A. Bacterias
B. Virus
C. Hongos
D. Mecanismos de resistencia a antibióticos

VI. SEMINARIOS DE INTEGRACION

 CRONOLOGÍA

Genética AM y DM

Mendel 1866
 GENÉTICA AM

 Las partículas de la herencia se

mezclaban

 Un parental aporta más que el otro

 Herencia de caracteres adquiridos
MENDEL Y LOS “FACTORES”
DE LA HERENCIA
 GENÉTICA DM

LA GENÉTICA Y

LOS GENES......
ADN o PROTEÍNAS?

….en busca del material hereditario….

Que características debería presentar
el material hereditario?

 Perpetuarse (replicarse)
 Manifestarse (expresarse)
 Cambiar (mutar)
 Combinarse (recombinarse)
 1902-Theodore Boveri- William Sutton
1865

Establecen la hipótesis según la cual los cromosomas,

segregados de modo mendeliano,
son unidades hereditarias.
1865 1915 - T.H. Morgan

Los genes se
disponían
linealmente en el
cromosoma

Se comienza a hablar de genética.....

 1865 1928 - Frederick Griffith
Colonias “Rugosas” Colonias “Lisas”

Transformación de
Streptococcus pneumoniae
Células L Células L muertas por
Células L Células R muertas por
calor junto a celular R
vivas vivas calor vivas
cápsula
Bacteria

“factor de
Inyección
transformación”
Resultados
 1865 1944 - Avery, MacLeod & McCarty

El ADN purificado es “el factor de transformación”

El ADN de las células lisas

transformaba a las rugosas

Oswald Avery Colin MacLeod Maclyn McCarty

Su teoría fue rechazada por dos razones:

De ser así cada especie debería tener un tipo diferente de ADN

La composición química del ADN era demasiado simple para

contener toda la información para la vida
1865 1952 - Hershey & Chase
El ADN viral (no las proteínas) programa
las células

Martha Chase & Alfred Hershey Bacteriófagos

… “los genes se componen de ADN, base

química de la herencia”…
LA ESTRUCTURA DEL ADN...
 1865 1947 - Erwin Chargoff

Las bases de ADN siguen

ciertas reglas
 La composición es especie
específica
 A = T, C = G en todas las especies

AT GC
1865 1953 - Franklin & Wilkins
La naturaleza helicoidal del ADN

Rosalind Franklin Film

fotográfico
Fuente de rayos X

DNA cristalizado

Maurice Wilkins
 1865 1953 - Watson & Crick
Descripción de la estructura tridimensional
del ADN

Francis Crick & James Watson

1865 1953 - Watson & Crick
Que dedujeron de:
Datos de R. Franklin
• hélice doble
• ancho uniforme de 2 nm
• bases separadas por 0.34 nm

Chargoff
• la adenina se aparea con la
timina
• la citocina se aparea con la
guanina
 1865 1953 - Watson & Crick

Que dedujeron ellos

mismos?
• Las bases están hacia adentro,
y los fosfatos y las azúcares
hacia afuera
• Enlaces de hidrógeno
• Hebras antiparalelas
• Sugirieron un modo semi-
conservativo de replicación
 ESTRUCTURA DEL ADN

... 2 de abril de 1953,

Molecular Structure
of Nucleic Acids.
A Structure for Deoxyribose
Nucleic Acid.
Nature 171: 737.
No más de 900 palabras…..

J. D. WATSON and F. H. C. CRICK

 QUE ES EL ADN???

POLÍMERO LARGO,

NO RAMIFICADO,

COMPUESTO POR
CUATRO TIPOS
DE SUBUNIDADES

Bases nitrogenadas
Se combinan con
azúcares y fosfatos
 DESOXIRIBONUCLEÓTIDOS
Nucleótido=base+azúcar+fosfato MONÓMERO
Nucleósido=base+azúcar
Del nucleótido al ADN
ENLACE FOSFODIESTER ENTRE
EL CARBONO 5´ DE UNA
DESOXIRRIBOSA CON EL GRUPO
FOSFATO DEL SIGUIENTE
NUCLEÓTIDO FORMANDO UN
5´ NUCLEÓTIDO MONOFOSFATO.

EL POLÍMERO SE FORMA AL
ENLAZAR LOS FOSFATOS AL 3´
DEL OTRO NUCLEÓTIDO

DIRECCIÓN
(5´a 3´)
5´
 Estructura estabilizada por
puentes hidrógeno •Doble hebra

3´ 5´ •Antiparalela

5´ 3´
ESTRUCTURA PRIMARIA
 Apareamiento:
A-T
G-C

Polímero uniforme
10 bases por Surco menor
vuelta

Surco mayor

ESTRUCTURA SECUNDARIA
 REGION
REGULATORIA

Codón de iniciación Codón de terminación

1865
ADN en Procariotas

ESTRUCTURA
TERCIARIA

Cromosoma bacteriano
ADN doble cadena (1mm long)
circular
cerrado
Condensado y ordenado (“supercoiled” o superenrollado)
1865 Plásmidos en Procariotas

• Tamaño de 1 a 400Kb
• Cantidad variable de copias en una célula
• Origen de replicación propio
• Pueden movilizarse a otros genomas
• Puede integrarse al cromosoma bacteriano
1865
ADN en Eucariotas

•1 o más cromosomas de ADN (hasta 1200 en helechos)

•Localizado en núcleo
•Empaquetado por histonas y otras proteínas cromatina

Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos

 1865 Replicación del ADN

Semiconservativa:
dos hebras generan una copia cada
una
 Iniciación
1865

comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos

conocida como origen de replicación,
en el que hay un gran contenido de adenina y timina.
 Iniciación
1865

iniciador
Síntesis de primers
de ARN
Iniciación de la
Unión de replicación
iniciador

Horquillas se mueven en
dirección opuesta

Formación de
dos hebras de
replicación

ADN lineales
(Eucariotas)
ADN circulares Varios replicones
(Procariotas)
Origen de replicación (oriC)
 Elongación
1865

ADN primasa
ARN primer
ADN polimerasa
ADN ligasa
III

Hebra
retrasada

Frag. de Okazaki

Hebra líder
Topoisomerasa

ADN polimerasa III

Helicasa
Proteínas de unión al ADNss
La ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas, complementarias a cada
una de las cadenas primitivas, en sentido 5´ → 3´ partiendo de un ARN corto
específico llamado ARN cebador –molécula formada por nucleótidos de ARN
catalizados por ARN primasas- que determina el punto por donde la ADN polimerasa
comienza a añadir nucleótidos.
 “Proof-reading”
DNA polimerasa comete un error cada 108 – 1010 bases

Incorporación de G X A Incorporación de A

Pol III escinde G con actividad

exonucleasa 3´ a 5´
 Terminación
1865

Fragmentos de Okazaki

Ligasa

Cuando una ADN polimerasa hace contacto con el extremo de otro fragmento
de Okazaki contiguo, el ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la ADN ligasa,
conecta los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado, catalizando
las reacciones de condensación que unen los grupos fosfato y azúcar de los
nucleótidos contiguos y así, una vez unidos todos los fragmentos de Okazaki
se completa la doble hélice de ADN.
1865 1957 - Francis Crick
Propuso el dogma central
ADN

ARN

PROTEINAS

Transferencia de información
biológica
1865
El ADN y el ARN

•Ácidos nucleicos
•Macromoléculas
•Polímeros (monómero de nucleótidos)
•Uniones fosfodiéster
•Moléculas más grandes que se conocen.
 Diferencias entre la química del ADN y el ARN
1865

 El ARN tiene como carbohidrato a la ribosa

en lugar de la desoxirribosa.

 El ARN tiene como base el uracilo en lugar

de la timina.

Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN.

 El ARN no es una doble cadena excepto en algunos virus.

1865 Estructura del ARN
 1865
Tipos de ARN según sus funciones

Componente principal del ribosoma

ARNr
(ribosomal)

•Decodifica el ARNm para sintetizar las proteínas

•Interacciona con ARNt durante la traducción
•En Procariotas, dos subunidades principales 30Sy 50S
•En Eucariotas, 40S y 60
 1865
Tipos de ARN según sus funciones

ARNt
(de transferencia)
aa

•Encargados de transportar los aminoácidos a los ribosomas

para incorporarlos a las proteínas, durante el proceso de
síntesis proteica.
•Decodificación mediante apareamiento con el codón del
ARNm

anticodón
1865
Tipos de ARN según sus funciones

ARNnc o ARN no codificante: ARN funcional que no codifica para síntesis proteica
(ARNr y ARNt)

ARN corto de interferencia (siARN: del inglés: small interfering RNA ): son
componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN
involucrados en la regulación.

Ribo-llaves (ribo-switches): son formas de ARN que actúan como llaves "encendido-
apagado" de gran precisión.
ARN catalíticos o ribozimas: ARN con estructura secundaria que le confiere a la
molécula propiedades catalíticas como corte de ARN o ADN y ligación.

El ARN posiblemente
fue el primer biopolímero
que apareció en la corteza terrestre
durante el transcurso de la evolución.
Como se leen los ARNm??
 1961- Nirenberg y Ochoa
1865

Sistema libre de células

UUUUUUUU fenilalanina
AAAAAAAA lisina
CCCCCCCC prolina
GGGGGGG glicina
El código genético

43=64
ARNm
 Demostraron que hay 61 tripletes -o codones-
que codifican aminoácidos,
muchos de los cuales son codificados por más de un codón,
por lo que se dice que el código está degenerado.
y los tres restantes no son codificantes sino que son utilizados
como señales de terminación.
1865
TRANSCRIPCIÓN

ADN Requerimientos:
 Cadena de ADN
como matriz
 ARN polimerasa
ARN  Ribonucleósidos
trifosfatos
 Región promotora
PROTEINAS
 TRANSCRIPCION
ARN polimerasa

ADN
Principio de un gen

Iniciación
La ARN polimerasa junto a factores de transcripción se une a sitio donde
va a iniciar la transcripción
 Promotor

En bacterias
•Dos regiones conservadas en el ADN (-10 y -35) que son
reconocidas por factor sigma.
•ARN polimerasa luego se une y sintetiza ARN de 5´ a 3´
•Un promotor expresa varios genes (OPERÓN)
 Promotor en Eucariotas

•Región promotora

•Involucra varios
factores de
transcripción
(proteínas)

•Cada gen tiene su

promotor
 TRANSCRIPCION
Hebra antisentido
Dirección de la transcripción
3´del gen
5´del gen
5´del ARNm

3´ del ARNm
Hebra sentido: ARNm
contiene la información
genética
Hebra antisentido:
provee el molde para
la síntesis del ARNm
Elongación
Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN
y la ARN polimerasa es la encargada del enlace fosfodiéster.
 TRANSCRIPCIÓN
La ARN polimerasa
deja el ADN

ARN mensajero liberado

El ADN se aparea nuevamente

Terminación
Desestabilización del •Rho-independiente (Secuencias palindrómicas del ADN que en
complejo estadio de ARN adopta una estructura en horquilla)
ARN-ADN •Rho-dependiente (mediada por la proteína)
1865
TRANSDUCCIÓN

El nombre proteína proviene

de la palabra griega proteios,
que significa lo primero.
ADN

ARN

PROTEÍNAS

Las proteínas son macromoléculas

formadas por aminoácidos
 TRADUCCION
ARNt Sitio de unión
al aminoácido

Uniones hidrógeno entre

pares de bases

Iniciación
La iniciación procariótica es el resultado de la asociación de las subunidades pequeña
y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt)
con el codón de iniciación mediante el emparejamiento de bases anticodón-codón.
 TRADUCCION

Elongación
La elongación de la cadena polipeptídica
consiste en la adición de aminoácidos al extremo carboxilo de la cadena.
 TRADUCCION

Continua la elongación

Este proceso continua hasta

Polipéptido que llega a un codón stop
Creciente
 TRADUCCION

Nueva proteína sintetizada

Carboxilo terminal
Amino terminal

Terminación
La terminación ocurre cuando se llega a uno de los tres codones de terminación
del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt.
 QUÉ ES UN GEN ?

Un segmento de ADN que contribuye a un

fenotipo/función. En ausencia de una función
demostrable, un gen puede ser caracterizado por
secuencia, transcripción u homología.

Human Gene Nomenclature Committee

 En Procariotas.....

Operón
Transcripción policistrónica (ARNm de varios genes)
 En Eucariontes...

REGION
EXONES
REGULATORIA

FIN
+1 TRANSCRIPCION
INTRONES

Un promotor para cada gen

LA DECADA DE LOS
70
 1865 1970 - Smith & Nathans
Descubrimiento de las enzimas de restricción

Hamilton Smith
• Descubrió HindII en
Haemophilus influenzae

Daniel Nathans
• Utilizó HindII para hacer el
primer mapa de restricción del
SV40
 1865 1972 - Paul Berg
El primer ADN recombinante utilizando EcoRI
Sitios de reconocimientoEcoRI

DNA
plasmidico
EcoRI corta el DNA en
fragmentos

Extremos
pegajosos SV40 DNA

DNA ligasa
DNA
recombinante
 1865 1973 - Boyer, Cohen & Chang
Transformación de E. coli con plásmidos
Gen resistente a la canamicina
recombinantes
Plasmid Gen resistente a
pSC101 la tetraciclina
Stanley Cohen &
Annie Chan

Medio con canamicina y tetraciclina

E. coli
transformada
con plásmidos
recombinantes Sólo crecen colonias recombiantes Herbert Boyer
 1865 1977 - Genentech, Inc.
La primera proteína humana producida por una
bacteria transgénica (somatostatina)
• Compañía fundada por
Herbert Boyer y Robert
Swanson en 1976
• Considerada el
advenimiento de la edad de
la biotecnología
LA DECADA DE LOS
80
1865

1980
• La suprema corte de U.S. permite patentar formas de
vida

1985
• Se prueban plantas modificadas genéticamente

En 1988 el National Center for Biotechnology

Information (NCBI) y el GenBank

Margaret Dayhoff
LA DECADA DE LOS
90
 1865 LOS 90: GENOMAS Y CLONES

1995
• primer genoma: Haemophilus influenzae.

1996
• Genoma de Saccharomyces cerevisiae

•1997
• Se clona Dolly

1998
• Genoma de C. elegans
COMO FUNCIONA UN GENOMA?

GENÓMICA Y PROTEÓMICA
26 de junio del 2000: se concluyó
el proyecto del GENOMA HUMANO,
en el cual se invirtió más de 3.000 millones de dólares…..
EL
FUTURO......
Genómica y sociedad

Genómica y salud

Genómica biológica
MUCHAS GRACIAS!!!!!!!!!!!

dcentron@gmail.com