Cromatografía

Dra. Alba Yadira Corral Avitia

 FLUJO OPTIMO EN LA COLUMNA
La forma más precisa y reproducible de establecer el
flujo en la columna capilar es inyectando una sustancia
no retenida para determinar la velocidad lineal
(volumen de tiempo muerto) y ajustar la presión de
cabeza hasta que ésta se encuentre en su valor
óptimo.

Tiempo muerto = longitud de la columna (cm)

u gas de arrastre (cm/s)
PRESIONES APROXIMADAS DE GAS DE
ARRASTRE EN COLUMNAS
LONGITUD 0.18 0.25 mm 0.32 mm 0.53 mm
(m) mm D.I D.I D.I D.I
15 6 psig 3 psig 2 psig

20 14 psig

30 12 psig 8 psig 4 psig

40 30 psig

60 24 psig 16 psig 8 psig

105 40 psig 30 psig 14 psig

Fuente: Capillary Column Installation Guide. Restek Corporation, 1994

Fundamentos de cromatografía
1. Velocidades de migración
La eficiencia de una columna cromatográfica para separar dos solutos
depende, en parte, de las velocidades relativas con las que eluyen las dos
especies.

Esas velocidades están determinadas por la magnitud de las constantes de

los equilibrios en función de las cuales las especies se distribuyen entre las
fases estacionaria y móvil.

1.1. Constantes de distribución

Es la transferencia de un analito entre las fases estacionaria (E) y móvil
(M):
[S]E
[S] Móvil  [S] Estacionaria KD  (1)
[S]M
 Fundamentos de cromatografía
• Cromatograma

tr (2)
tr (1)

tr´(2)

tr´(1)

d
Compuesto 1 Compuesto 2

Pico de W(1/2)h h
Punto de butano (tm)
inyeccción

Línea base Wb (1) Wb (2)

Cuando las condiciones llegan al equilibrio, la transferencia de masa es igual a cero. Esto
representael máximode la distribucióngausiana.

nE VM Kc, Constante de distribución

Kc  KD, Coeficiente de distribución (2)
nM VE Kp, Coeficiente de partición

nE
 ks´ Factor de retención o de capacidad (3)
nM

VM
 Razón de fases (4)
VE
Objetivo de la cromatografía

Separar los compuestos en una mezcla

Proceso cromatográfico
 L
vsoluto  Velocidad lineal promedio del soluto (5)
tr

L
u Velocidad del soluto no retenido (6)
tm

Para relacionar el tr del soluto con su K, se tiene:

t Solutoen fase móvil nSolutoen fase móvil

vSoluto  u u (7)
ttotal ntotales
 nM 1 1
M    Fracción del soluto
nM  nE 1  nE 1  C EVE en la fase móvil
nM CM VM (8)

1 1 1
M    Fracción del soluto
VE Kc 1  ks´ en la fase móvil
1  Kc 1
VM  (9)

Si todas las moléculas están en la fase estacionaria, el equilibrio se ve

Smóvil Sestacionaria y M0, K  , k´   y v=0

desplazado hacia la derecha

Por el contrario, si todas las moléculas están en la fase móvil, el equilibrio se ve

desplazado hacia la izquierda Smóvil Sestacionaria y M=1, K  0, k´  0 y V=u

De (7):

t Solutoen fase móvil nSolutoen fase móvil

vu u (7)
ttotal ntotales

De aquí que la velocidad de migración del soluto sea:

u u
vsoluto  u M  
Kc 1  ks´ (10)
1

1.2. Factor de retención (Velocidad de migración del
soluto) k’A Relaciona el equilibrio de distribución del analito con sus propiedades
termodinámicas. Velocidad de migración.

Se utiliza con frecuencia para describir las velocidades de migración

de los solutos en las columnas. Otra forma de definirlo es:

K cVE
k s ´ (11)
VM

Tomando de (10): Sustituyendo (5) y (6) en (10):

u L  L  1
vsoluto  
1  ks´ t r  t m  1  k s ´
Reordenando:

tr  tm tr ´
k s ´  (12)
tm tm
De esta forma, el factor de capacidad o de retención, es el tiempo que
el soluto permanece en la fase estacionaria en relación con el que
pasa en la fase móvil y se puede calcular directamente del
cromatograma.

Idealmente, las separaciones se realizan en condiciones en las que

los factores de retención para las especies de una mezcla oscilan
entre 2 y 10.

Cuando k’A es < 1 es difícil determinar los tiempos de retención

Cuando k’A es >10 los tiempos de elución son excesivamente largos
Idealmente 1< k’A > 5
1.3. Factor de selectividad o factor de separación
(Velocidades de migración relativas)

El factor de separación a para una especie A menos retenida que la especie

B, donde a siempre es mayor que 1, se define por:

KB
a (11)
KA
Sustituyendo (9) en (11): Y (10) en (12):

k ´B tr B  tm
a (12) a (13)
k´ A tr A  tm
 Velocidades de migración relativas:
Factor de selectividad

Sustituyendo (9) en (11):

' k’B especie mas fuertemente retenida
k
a B
'
(12) k’A especie menos retenida
k A
k’B > k’A por lo tanto α siempre es
mayor que la unidad

Y (10) en (12):

Esta formula permite determinar el factor

(t R ) B  t M de selectividad a partir de un cromatograma
a (13) experimental
(t R ) A  t M α es independiente de los cambios de flujo
2. Ensanchamiento de banda y eficiencia
de la columna
Para este curso, se asume que la forma de los picos es de tipo
gausiano. La forma simétrica se debe a que ciertas moléculas
se desplazan en la fase móvil durante la mayor parte del
tiempo, mientras que otras, se incorporan a la fase estacionaria
un tiempo mayor que el promedio de las moléculas.

La consecuencia de esos procesos individuales aleatorios, es

una dispersión simétrica de las velocidades alrededor del valor
medio, que representa el comportamiento promedio de las
moléculas.

Lo ancho de la zona está relacionado con el tiempo de

permanencia en la columna e inversamente con la velocidad a
la que fluye la fase móvil.
2.1. Evaluación de la eficiencia de la columna
cromatográfica
a. Altura del plato teórico (H)
b. Número de platos teóricos (N) determina la
eficacia de una columna*
L
N (14)
H
L= longitud de la columna (cm)
Al incrementar N, se incrementa la eficiencia y H disminuye

La teoría del plato teórico no explica el ensanchamiento de banda, la teoría

de la velocidad si lo hace.

* - Martin A.J.P. y Synge R.L.M. (1941). Biochem J. 35, 1358.

 
 Desviación estándar  de un pico
(16)
L cromatográfico: W = 4 
tr
Sustituyendo W = 4  en (16) y reordenando: Y (17) en (15):

LW LWb2
 (17) H 2 (18)
4t R 16t R
Ancho del pico en la base: W equivale al 96% del área bajo la curva
 2
 tR 
N  16  Número de platos teóricos
(ancho de la base del pico)
(19)
 Wb 

O bien

2
 
 tR 
N  5.54  Número de platos teóricos
(20)
 W1  (ancho a la mitad de la altura del pico)
 2 
 40.16

Benzo(j+k)fluorantenos

Benzo(b)fluoranteno

Benzo(a)pireno
Perileno-d12

Benzo(e)pireno

41.65

Benzo(a)fluoreno Perileno

0.088 min 0.082 min

0.085 min 0.094 min 0.097 min

0.109 min 0.097 min

 Ejemplo
L, cm 3000

Compuesto tr Wb=4   , LW/4tr H, 2/L N, 16(tr/W)2 v R

min min min cm mm cm/s Dt/Wb
Benzo(b)fluoranteno 40.06 0.088 0.02 1.7 0.009 3298050 1.248

Benzo(k+j)fluorantenos 40.16 0.109 0.03 2.0 0.014 2179023 1.245 0.9

Benzo(a)fluoreno 40.22 0.082 0.02 1.5 0.008 3816330 1.243 0.7
Benzo(e)pireno 41.11 0.085 0.02 1.6 0.008 3716865 1.216
Benzo(a)pireno 41.30 0.094 0.02 1.7 0.010 3080903 1.211 2.0
Perileno-d12 41.54 0.097 0.02 1.8 0.010 2930778 1.204 2.5
Perileno 41.65 0.097 0.02 1.7 0.010 2946320 1.200 1.1

Sandra (1989) Sandra (1989)

Rs tablas Separación Rs tablas Separación
Dt/Wb % Dt/Wb %
0.5 68.3 1.3 98.8
0.9 92.8 1.5 99.7
1.0 95.4 2.0 100.0
1.1 97.2 2.5 100.0
2.2. Variables cinéticas en el ensanchamiento de
banda
Se produce como consecuencia de la velocidad finita con la que ocurren
los distintos procesos de transferencia de masa durante la migración de
una especie a lo largo de la columna.

Los estudios de eficiencia generalmente se realizan determinando H en

función de la velocidad de la fase móvil.
Representaciones gráficas de la ecuación de
van Deemter

Cromatografía de líquidos Cromatografía de gases

 Variables cinéticas que influyen en el
ensanchamiento de banda
Ecuación de Van Deemter
H = A + B/u + Cu
Donde :
A = caminos múltiples de flujo
B = difusión longitudinal
C = transferencia de masa entre fases
u = velocidad lineal de la fase móvil
Parámetros que afectan a la resolución
 Ensanchamiento de Banda

• Una señal cromatográfica tiene la forma de una

curva Gaussiana.
• La anchura de una banda esta relacionada
directamente con el tiempo de permanencia del
soluto en la columna, e inversamente con la
velocidad a la que fluye la fase móvil.
Objetivo de la cromatografía
Maximizar los parámetros de resolución (Rs):
k – factor de retención
a – factor de separación
N – platos teóricos
Métodos para mejorar la separación
de una mezcla
a) Cromatograma original
b) Aumento en la
separación de bandas
c) Disminución de la
anchura (dispersión) de
las bandas
 Resolución de la Columna

Rs = ΔZ = 2ΔZ = 2 [ (tR)B – (tR)A]

½ (WA + WB) WA + WB WA + WB
(tR)B
Rs = 1,5

(tR)A ΔZ
Señal del detector

tM W1/2 hB
A
1/2hB
B

Material que WA/2 WB/2

no interacciona
WA WB

Tiempo, min
 Influencia de los factores de retención y
selectividad sobre la resolución

Asumir que WA = WB = W


N  a  1 k B 
'
R    ' 
4  a  1  k B 
s

2
 a   k  1
2 '
N  16 R 
2

B
 ' 
 a  1  k B 
s
 Influencia de los factores de retención y
selectividad sobre la resolución

Cuando k’A = k’B = k’ y α → 1

 k  '
R
N
a  1 ' 
1  k 
s

4
2
 1   k  1
2 '
N  16 R 
2
  
 a  1  k ' 
s
 Efecto de la resolución sobre el
tiempo de retención

El tiempo se determina por la velocidad del soluto más

lento v
B

L
v 
B

(t ) R B

(t ) 
16 HR  a  1  k
2
S
2
 B
' 3
R B
 
u  a  1 kB'
Relación entre el volumen de retención y el
factor de retención

El volumen de retención volumen requerido para eluir un

soluto específico de la columna

vB
vR  tR  uv 
Uv = caudal
t  t V V
k 
'

R M R M

El volumen es proporcional al tiempo por lo

tanto: t M V M

VM= Volumen de la fase móvil VR  KVs  VM

Relación entre el empaque, diámetro y el volumen
de velocidad de flujo para aumentar el tamaño de
la columna

2
Eg  rg 
 
E p  rp 

Vf g Eg

Vf p Ep
Relación entre la resolución y el número de platos

R 1

N 1

R 2 N 2

Relación entre la tiempos de retención y la

resolución

t 
R1 2

R2
r1
2
t r2
Mejorar la resolución

•  N:  tR
•  H:  N; tR constante
•  K´: máximo hasta 10
•  a: manteniendo K´pequeña