Bộ Y tế

Trường Đại học Dược Hà Nội

CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ HÌNH

THÀNH PHỨC HỢP OXYTOCIN-PEG
BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH

Người thực hiện:

Nguyễn Thị Nhung

Người hướng dẫn:

PGS. TS. Nguyễn Văn Rư
HVCH. Lê Quang Nghị
 Nội dung
1 Đặt vấn đề

2 Nguyên liệu và phương pháp

3 F Thực nghiệm và kết quả

4 Kết luận và đề xuất

1. Đặt vấn đề
 Đặt vấn đề
- Dễ bị phân hủy bởi
enzym trong cơ thể
- Kém ổn định trong
bảo quản

- Đặc điểm cấu tạo

- Vai trò
Phương pháp tăng độ bền ?
- Sự kém bền phân tử
 Phương pháp pegyl hóa

Tăng độ bền phân tử

Tăng cường tác dụng

Pegyl hóa
Giảm tính sinh miễn dịch của
protein đối với cơ thể

Tăng thời gian bán thải

 Mục tiêu

Gắn kết được Oxytocin với phân tử

1 polyehthylen glycol tạo phức hợp
Oxytocin-PEG

Xác định hiệu quả hình thành phức hợp

2
Oxytocin-PEG
 2. Nguyên liệu
và phương pháp nghiên cứu
 Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên Oxytocin, methoxyl polyethylen glycol

liệu propion aldehyd 5kDa

Hóa Kali dihyrophosphat, ethanol, Tris(methylen,

chất aminopersulfat, natri dodecyl sulfat,…

Máy khuấy từ, điện di, buret, tủ lạnh,

Thiết bị
máy đo quang….
 Phương pháp nghiên cứu
 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin
- Dựa trên phản ứng khử

- Dựa trên nghiên cứu của Jenifer Collin và công sự

Đã thực hiện phản ứng liên hợp với
Oxytocin với mPEG aldehyd. Xác định vị
trí gắn ở amin Cys 1.
 Phương pháp nghiên cứu
 Xác định sự hình thành Oxytocin-PEG bằng
phương pháp điện di
Điện di trên gel polyacrylamid có Natri dodecyl sulfat (SDS)
 Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp sắc ký lọc gel
 Phương pháp nghiên cứu
 Định lượng hợp chất Oxytoicn-PEG bằng phương pháp đo
quang trực tiếp
- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cchuẩn= 0,02 mg/ml
- Chuẩn bị mẫu thử: Gộp phân đoạn thể tích Ve
- Đo quang UV ở bước sóng 280 nm
𝐷𝑡ℎử
Nồng độ Cthử Oxytocin_PEG 𝐶𝑡ℎử = . 𝐶𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛. (mg/ml)
𝐷𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛

Lượng hợp chất Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel
25
𝑚 = 𝐶𝑡ℎử . 11. 𝑥. (mg)
2

Hiệu suất thu hồi hợp chất Oxytocin-PEG trong VR ml

mOxytocin−PEG
H% = . 100
MOxytocin−PEG .mOxytocin ban đầu
3. Thực nghiệm và kết quả
 3. Thực ngiệm và kết quả
• Gắn PEG vào phân tử Oxytocin
3.1

• Xác định sự hình thành Oxytocin-PEG bằng điện di

3.2

• Tách chiết và xác định khối lượng phân tử Oxytocin-PEG

3.3

• Xác định hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG sau sắc ký lọc
3.4 gel

• Đánh giá ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd tới lượng

3.5 Oxytocin-PEG sau sắc ký lọc gel
 3.1 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin

• 40 mg mPEG
• 8 mg Oxytocin aldehyd Khuấy trộn trong
• 1 ml dung dịch • 10 ml đệm phophat 1 giờ trước khi để
đệm phophat pH 4,5 phản ứng xảy ra ở
pH 4,5 • 250 mg NaCNBH3 40C/24 giờ
khuấy 15 phút

Tiến hành tương tự dung dịch đệm pH 7,5

3.1 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin

2 giai đoạn
- Giai đoạn 1:
ngưng tụ
- Giai đoạn 2:
khử hóa
3.1 Gắn PEG vào phân tử Oxytocin
Hai mẫu phản ứng cho kết quả tương tự

- Không màu - Màu vàng nhạt

- Trong suốt. - Trong suốt
- Độ nhớt giảm
 3.2 Xác định sự hình thành Oxytocin-
PEG bằng điện di

1 2 3 1 2 3
Kết quả điện di ở pH 4.5 Kết quả điện di ở pH 7.5
Như vậy, trong mẫu phản ứng có có sự xuất hiện protein mới
có khối lượng phân tử khoảng 6 kDa.
3.3 Tách chiết và xác định khối lượng
phân tử Oxytocin-PEG
01 Vẽ pick sắc ký của Oxytocin và sản
phẩm tạo thành trong quá trình
pegyl hóa

02
Xây dựng đường chuẩn về khối
lượng phân tử
 Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của
dung dịch Oxytocin
0.4 D
0.35
Oxytocin có 1 pick ở
0.3 có đỉnh hấp thụ cực
0.25 đại ở V =18 ml.
0.2

0.15

0.1

0.05

0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 ml
Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn
rửa giải dung dịch Oxytocin.
 Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của
D mẫu phản ứng ở pH 4,5
0.35 Mẫu phản ứng
Ve=12ml
0.3 xuất hiện đỉnh
pick Ve=12ml là
0.25 Ve=18ml Oxytocin-PEG
0.2
0.15
0.1
0.05
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 ml
Đồ thị tương quan mật độ quang và các phân đoạn rửa giải dung
dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG aldehyd ở pH 4,5.
 Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của
mẫu phản ứng ở pH 7,5
D
0.4
Ve= 18ml
0.35
Mẫu phản ứng
0.3
Ve=12ml xuất hiện đỉnh
0.25 pick Ve=12ml là
0.2 Oxytocin-PEG
0.15

0.1

0.05

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 ml

Đồ thị tương quan mật độ quang các phân đoạn rửa giải dung
dịch sau phản ứng liên hợp Oxytocin và mPEG aldehyd với pH 7,5
 Nhận xét chung

Hỗn hợp sản phẩm tạo thành ở pH 4,5 và pH 7,5

đều cho thấy:
+ Có sự hình thành hợp chất Oxytocin-PEG
+ Pick sắc ký có đỉnh hấp thụ cực đại ở Ve =12ml
+ Lượng hợp chất Oxytocin-PEG nằm trong phân
đoạn 9 ml -14ml
 Xây dựng đường chuẩn về khối lượng
phân tử
 Tiến hành:
Lọc qua cột gel các protein: Chymotrypsin, Casein,
Insulin, Oxytocin đã biết khối lượng phân tử.
 Kết quả:

Protein MW (kDa) Log (MW) Ve(ml)

Chymotrypsin 25 1,398 7
Casein 23,6 1,373 8
Insulin 5,78 0,762 12
Oxytocin 1,007 0,003 18
 Xây dựng đường chuẩn về khối lượng
phân tử
1.500 logMW y = -0.131x + 2.361
R² = 0.995

1.000

logMW
0.500

Ve ml
0.000
0 5 10 15 20

Đồ thị hồi quy tuyến tính giữa logMW và Ve

Vậy MOxytocin-PEG = 6 kDa. Do đó trong phản ứng liên hợp, một phân
tử mPEG aldehyd đã gắn kết với một phân tử Oxytocin.
 3.4 Xác định hiệu suất thu hồi hợp
chất Oxytocin-PEG sau sắc ký lọc gel
Chỉ số pH 4,5 pH 7,5
1 2 3 1 2 3
Cchuẩn 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02
Dchuẩn 0,313 0,313 0,314 0,312 0,313 0,313
Dthử 0,574 0,575 0,576 0,328 0,328 0,329
Cthử 0,036 0,037 0,038 0,021 0,021 0,021
mOxytocin-PEG 30,28 ± 0,07 17,33 ± 0,03
H% 63,08 ± 0,002 36,10 ± 0,002
p 0,001
Nhận xét: Hiệu suất thu hồi Oxytocin-PEG ở
mẫu pH 4,5 lớn hơn mẫu pH 7,5
 3.5 Đánh giá ảnh hưởng lượng mPEG
aldehyd tớivlượng Oxytocin-PEG sau sắc
ký lọc gel
Quá trình đánh giá được tiến hành ở 5 mức,
thêm và bớt lượng mPEG aldehyd 10%, 20% so
với ban đầu M0

M2 (-20%) M1 (-10%) M0 M3(+10%) M4(+20%)

Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của
mẫu phản ứng M1
D
0.4 Mẫu phản ứng
Ve=12 ml -
0.35 xuất hiện đỉnh
0.3 pick Ve=12ml là
0.25
Ve=18 ml Oxytocin-PEG
0.2
0.15
0.1
0.05
0
ml
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn
rửa giải của mẫu M1
Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của
mẫu phản ứng M2
D
0.4 Ve=12 ml Mẫu phản ứng
0.35 xuất hiện đỉnh
0.3 Ve=18 ml pick Ve=12ml là
0.25 Oxytocin-PEG
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 ml
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn
rửa giải của mẫu M2.
Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của
mẫu phản ứng M3

D Mẫu phản ứng

0.4 Ve=12 ml
xuất hiện đỉnh
0.35 pick Ve=12ml là
0.3 Ve=18 ml Oxytocin-PEG
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24ml
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn
rửa giải của mẫu M3.
Kết quả rửa giải trên cột sắc ký lọc gel của
mẫu phản ứng M4
D
0.4 Ve=12 ml Mẫu phản ứng
0.35 xuất hiện đỉnh
0.3 pick Ve=12ml là
Ve=18 ml Oxytocin-PEG
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
ml
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và các phân đoạn
rửa giải của mẫu M4.
 Nhận xét chung

Mẫu M0, M1, M2, M3, M4 đều cho 2 pick sắc ký

+ Có sự hình thành Oxytocin-PEG

+ Ve Oxytoin-PEG là 12 ml, M= 6 kDa

+ Lượng hợp chất Oxytocin-PEG nằm trong

phân đoạn 9 ml -14ml
 Đánh giá ảnh hưởng của lượng mPEG aldehyd tới
lượng Oxytocin-PEG trong dung dịch sau sắc ký lọc gel

Thông số M2 M1 M0 M1 M2
mOxytocin 8
mPEG 32,40 36,45 40,50 44,55 48,60
Ve 12
MOxytocin-PEG 6
mOxytocin-PEG 29,36 30,22 30,28 30,61 31,38
H% 61,16 62,95 63,08 63,76 65,38
p 0,07 0,81 0,27 0,06

Nhận xét: Lượng và hiệu suất thu hồi

Oxytocin-PEG là như nhau giữa các mẫu
 Bàn luận

1 2 3
Về phản ứng Về khối lượng Về đánh giá
pegyl hóa phân tử protein hiệu suất thu
Oxytocin sau phản ứng hồi Oxytocin-PEG
 Về phản ứng pegyl hóa
• Cơ chế phản ứng

• Vị trí nhóm NH2: ở Cys1

• mPEG aldehyd: Methoxyl polyethylen glycol propion
aldehyd
• pH: 4,5 và 7,5
• Tác nhân khử : NaCNBH3
• Tiến hành phản ứng
• Kết quả điện di : sự hình thành Oxytocin-PEG, 6 kDa
Khối lượng phân tử protein sau phản ứng

- Xác định sự hình

thành Oxytocin-PEG
- Tách chiết
- Xác định M Oxytocin-PEG
= 6 kDa

Kết luận: một phân tử mPEG aldehyd đã gắn kết với

một phân tử Oxytocin.
 Về đánh giá hiệu suất thu hồi
Oxytocin-PEG
Ảnh hưởng của pH

Lượng và hiệu suất

thu hồi Oxytocin-PEG

Mẫu pH 4,5
> Mẫu pH 7,5

Điều này được giải thích theo cơ chế phản ứng

 Về đánh giá hiệu suất thu hồi
Oxytocin-PEG
Ảnh hưởng lượng mPEG aldehyd

Thay đổi khoảng Oxytocin

Ve=12ml
10, 20% lượng Oxytocin-PEG
mPEG aldehyd M =6 kDa

Lượng và hiệu suất thu hồi như nhau

- Do khoảng khảo sát hẹp

- Ảnh hưởng quá trình tách chiết
4. Kết luận và đề xuất
  Kết luận
1. Đã thực hiên 2. Đã tách chiết
gắn phân tử PEG và xác định khối
vào Oxytocin lượng phân tử

Oxytocin Oxytocin-PEG

3. Xác định
4. Đánh giá ảnh
điều kiện phản
hưởng lượng
ứng phù hợp
mPEG aldehyd
 Đề xuất:
Khảo sát các điều kiện khác, cải tiến phương pháp và xây
dựng các tiêu chuẩn đánh giá đặc điểm Oxytocin-PEG
Nguyễn Thị Nhung