Isolasi Supernatan Sel Bebas Exiguobacterium

acetylicum dari Akar Kubis Air (Pistia stratiotes)

yang Menghambat Bacilus subtilis dan
Escherichia coli

Kelompok
Anton (16330504)
Nurhilyah Ailah (16330747)
Suci Anugrahati (17330701)
I Gusti Lanang Bgs. Suhartana (17330719)
Wahyudi Anggrian (17330724)
 PENDAHULUAN

Antibiotik adalah zat aktif yang memiliki kemampuan untuk menghambat atau membunuh
patogen dengan cara berbeda mekanisme dan strategi.

Beberapa antibiotik seperti :

 Penicillin, Cephalosporin, Carbapenems dan Monobactams diketahui mengganggu dinding
sel bakteri.
 Tetrasiklin dan Aminoglikosida berikatan dengan subunit ribosom 30S.
 Clindamycin, Macrolides dan Chloramphenicol berikatan dengan 50S ribosomal subunit
yang mengakibatkan gangguan aktivitas ribosom.
 Sulfonamides mengganggu sintesis folat
 Kuinolon mengganggu DNA girase
 Rifampisin menargetkan polimerase RNA.
Kubis air (Pistia stratiotes) merupakan tanaman air yang
umum ditemukan di danau dan sungai. Namun, tidak ada
penelitian yang dilaporkan tentang akarnya yang berkaitan
dengan microbiome. Pada penelitian ini, di dalam akar
kubis air telah diidentifikasi mengandung 99%
Exiguobacterium acetylicum, berdasarkan sekuensing gen
16S rRNA ditemukan memiliki potensi antibiotik yang kuat.
 METODE

 Isolasi dilakukan dengan pengenceran berlapis, metode pour plate, pemunian dan
pengembangbiakkan dengan metode brot.

PENGAMBILANN SAMPEL
Sampel tanaman dikumpulkan dari Sungai Danga, bagian dari Sungai Pampanga
menggunakan penjepit steril.
 Kemudian dimasukkan ke dalam kantong steril.
 Spesimen tanaman yang terpisah diidentifikasi dan diotentikasi di Divisi Botani dari
Museum Nasional Sejarah Alam, Manila, Filipina.
 Preparasi Sampel

Setelah homogen,
Ditambahkan air pengenceran serial
10 kubis air dicuci 10 gram akar peptone steril pH 7,0 disiapkan untuk
menggunakan 0,9% ditempatkan dalam ; lalu labu ditutup dan memperoleh koloni
larutan garam. labu 225 ml steril. diaduk selama 5 yang terhitung mulai
menit. dari 1:10 hingga 1:
106.
 Pembiakan Sampel

Pelat dibiarkan memadat

1 mL dari masing-masing
pengenceran disiapkan dan
disemaikan ke dalam cawan
petri steril
Pra-cooled nutrient agar pada
selama empat (4) jam dan
38oC menjadi 40oC dengan pH
diinkubasi dalam posisi
6.9 dituangkan di masing-
terbalik pada 35oC selama 48
masing pelat.
jam.

Seleksi Koloni dan Pemurnian

Retensi dari kultur

Setelah inkubasi, Sebanyak 6 koloni
Isolat awalnya yang dimurnikan dari
jumlah koloni yang yang terisolasi
dikodekan sebagai T1 7 isolat juga
tumbuh dinilai. Plelat dengan baik dari
untuk koloni disiapkan untuk
dengan pertumbuhan pelat pengenceran 10-
6 dipilih secara pertama, T2 hingga identifikasi
yang dapat dihitung
T7 untuk koloni molekuler
digunakan untuk individual dan
berikutnya. setelah skrining
seleksi koloni. disubkultur dua kali.
antimikroba.
 Persiapan Supernatan Sel Bebas

7 koloni yang Kemudian disentrifugasi pada

Setelah inkubasi, Supernatan sel
terisolasi 2000 rpm selama 5 menit diikuti
supernatan sel bebas disimpan
diinokulasi dalam dengan filtrasi membran
bebas disiapkan pada suhu 4oC
kaldu nutrisi 100 menggunakan 0,45 μm filter
dengan selama 2 jam
ml dalam labu dan nilon (Whattman) untuk
memperoleh 10 ml sebelum uji
diinkubasi pada memastikan bahwa tidak ada sel
kultur kaldu sensitivitas
suhu 35oC selama bakteri di dalam
bakteri. antibiotik.
5 hari. supernatan.

Uji Persiapan Strain

Sebuah loopful dari setiap

Organisme uji termasuk E. coli, B.
subtilis, dan S. aureus diperoleh
dari Departemen Mikrobiologi
Medis Kesehatan Masyarakat
Universitas Filipina, Manila.
organisme uji diinokulasi ke dalam
2,5 ml air pepton steril dalam
tabung kecil dan dibandingkan
dengan standar McFarland dengan
memberikan kira-kira 1,5 × 108 cfu
/ ml bakteri uji.
 Kontrol Positif dan Negatif

Tetrasiklin dengan
konsentrasi 100 μL per Air suling ganda
sumur ditetapkan sebagai sebagai kontrol negatif.
kontrol positif.

Uji Sensitivitas Antibiotik

Penggerek gabus steril

Pelat yang disiapkan
berukuran 10mm Seratus (100) μL
mengandung Muller
digunakan untuk supernatan sel bebas Prosedur yang
Hinton Agar dengan pH
membuat sumur di dari masing-masing sama dilakukan
7.2 diinokulasi dengan 0,3
setiap piring. 3 isolat ditempatkan untuk dua
mL inokulum disiapkan
lubang/sumur dibuat di pada nutrien agar kontrol.
dari strain uji secara
setiap lempeng dengan baik.
terpisah.
mewakili 3 ulangan.

Zona inhibisi diukur

Pelat kemudian
setelah inkubasi dan
diinkubasi pada suhu
pengukuran dinyatakan
35oC selama 24 jam.
sebagai milimeter.
 Identifikasi Molekuler dari Isolat

Isolat yang menunjukkan

penghambatan strain uji digunakan Ekstraksi DNA, amplifikasi
untuk identifikasi molekuler gen 16S rRNA,
menggunakan sekuensing gen 16S elektroforesis gel dan
rRNA di Philippine Genome Center sekuensing kapiler
(PGC) dari Universitas Filipina dilakukan di PGC.
Diliman.

Analisis Urutan DNA dan

Perlakuan Data

Urutan ini dibandingkan dengan urutan

Perangkat lunak perataan
publikasi di GenBank menggunakan Perlakuan data
urutan nukleotida bioedit
Alat Pencarian Pelurusan Lokal Dasar menggunakan Analisis
digunakan untuk
(BLAST) dari Pusat Informasi Satu Arah Varians
membersihkan dan
Bioteknologi Nasional (NCBI) untuk (ANOVA).
mengedit urutan data.
menentukan identitas mereka.

Perbedaan di antara
Analisis statistik
sarana dianalisis
menggunakan
lebih lanjut dengan
perangkat lunak
menggunakan uji
GraphPad Prism versi 6.
HSD.
 HASIL PENELITIAN

Gambar 1 Zona penghambatan terhadap E. coli dan B. Subtilis oleh sel bakteri bebas
supernatan (T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7) kontrol negatif (T0) dan
kontrol positif (T +)
 HASIL PENELITIAN

Gambar 2 Identitas Molekul dari bakteri yang terisolasi (T4) berdasarkan urutan 16s RNA
HASIL PENELITIAN

Gambar 3 Amplifikasi urutan gen 16S rRNA (T4)

 KESIMPULAN

Dalam penelitian ini, bakteri yang berpotensi menghasilkan antibiotik

diisolasi dari akar kubis air adalah Exiguobacterium acetylicum. Supernatan
sel bebas dari isolat ditemukan untuk menghambat pertumbuhan E. coli dan
B. subtilis tetapi tidak S. aureus.