PARÁMETROS CINÉTICOS PARA LA PRODUCCIÓN DE PHB POR MEDIO DE

RALSTHONIA EUTROPHA USANDO GLICEROL COMO SUSTRATO.

Karen Díaz | Alejandra Gualdrón | Leidy Gualdrón | Sergio Peña
 BIOMASA:
SUSTRATO:
¿QUÉ ES EL PHB? Ralstonia Eutropha
Glicerol
DSM 545
 Fórmula: C3H8O3.
El PHB es producido
por microorganismo  Densidad: 1,26 g/cm³.
por la asimilación de
carbono y es empleado  Punto de ebullición:
como una forma de 290 °C.
almacenamiento de  Crece en ambientes
energía para ser  Punto de fusión: 17,8 Aeróbios.
metabolizado cuando °C.
otras fuentes de  Produce
 Clasificación: Polihidroxibutiratos (PHB)
energía comunes no
Polialcohol cuando crece expuesta a
están disponibles.
un exceso de azúcares
 Residuo Diesel como sustrato es decir
(98%pureza) sometida a condiciones de
estrés nutricional.

 El PHB puede acumularse

hasta niveles de 1
aproximadamente el 90%
del peso de la célula en
PRETATAMIENTO DEL
GLICEROL

2
 DETERMINACIÓN: PARÁMETROS
CINÉTICOS
ESPECIFICACIONES:

 Nombre de la cepa: Ralstonia eutropha DSM 545

 Biomasa seleccionada: Glicerol puro

CONDICIONES DE OPERACIÓN DEL PROCESO:

Condiciones de mantenimiento de la cepa hasta ser utilizada
Ralstonia eutropha DSM 545
Temperatura Glicerol
4°C 1%

Condiciones de preparación del inóculo

Ralstonia eutropha DSM 545

Erlenmeyer de 1 L contenido 200 mL de medio Se mantuvo en agitador shaker orbital durante
de cultivo 24h a 200 rpm y 35 °C

Condiciones de fermentación en Sartorious Stedim Biotech (BIOSTAT A Plus).

Ralstonia eutropha DSM 545
Temperatura pH volumen Concentración inicial de glicerol
35ºC 7 2 L medio de cultivo 26.45 g/L
3
 ALGORITMO DE
SOLUCIÓN PARA
DETERMINAR LOS
PARÁMETROS
CINÉTICOS

4
 TABLA DE DATOS PARA BIOREACTOR BATCH

Biomasa, Sustrato, Producto, Los datos vienen de experimentos realizados

Tiempo (h)
X(g/L) S(g/L) PHB(g/L) en el laboratorio en fermentador Sartorious
0 0,2 26,45 0 Stedim Biotech a 35°C y pH de 7,
7,5 0,4 25,47 0
conteniendo 2 L de medio de cultivo.
12 0,5 21,5 0
18 1,2 19,28 0 Se obtuvo 0,2 g/L de biomasa al inicio de la
24 2,6 18,28 0 fermentación.
32 8,6 13 0,52
38 12,8 8,42 1 La determinación de biomasa, glicerol y PHB
43 16,5 7,74 1,35 se tomaron en muestras de intervalos
48 19,5 6,39 1,42 irregulares.
56 19,6 4,68 2,44
60 19,2 0,27 3,35

5
 TABLA DE DATOS PARA BIOREACTOR BATCH

Se obtuvo la regresión polinómica para sustrato y biomasa en función del tiempo con el fin de obtener nuevos valores
equi-espaciados para el tiempo.

Comparación de Sustrato Vs Tiempo Comparación de Biomasa Vs tiempo

30 25

25 20

20

Biomasa [g/L]
15
Sustrato [g/L]

Dato ajustado Dato con ajuste

15
Dato sin ajuste Dato sin ajuste
10
10
5
5

0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo [h] Tiempo [h]

5
 TABLA DE DATOS PARA BIOREACTOR BATCH

Resultados obtenidos con el ajuste:

t X (g/l) S (g/l) 1/S dX/dt 1/X µ dS/dt Yx/s P dP/dt qp Yp/x
0 0.368 26.402 0.038 -0.024 2.721 -0.065 -0.010 -2.425 0.000 0.000 0.000 0.000
5 0.305 25.836 0.039 -0.001 3.281 -0.004 -0.216 -0.005 0.000 0.000 0.000 0.000
10 0.357 24.237 0.041 0.063 2.805 0.175 -0.380 0.164 0.000 0.000 0.000 0.000
15 0.930 22.032 0.045 0.192 1.075 0.207 -0.467 0.411 0.000 0.000 0.000 0.000
20 2.279 19.563 0.051 0.357 0.439 0.157 -0.494 0.722 0.000 0.000 0.000 0.000
25 4.499 17.089 0.059 0.525 0.222 0.117 -0.478 1.100 0.000 0.000 0.000 0.000
30 7.531 14.787 0.068 0.666 0.133 0.088 -0.434 1.535 0.212 0.084 0.011 0.125
35 11.163 12.748 0.078 0.749 0.090 0.067 -0.381 1.969 0.836 0.093 0.008 0.124
40 15.024 10.981 0.091 0.743 0.067 0.049 -0.334 2.226 1.144 0.050 0.003 0.068
45 18.590 9.412 0.106 0.616 0.054 0.033 -0.310 1.987 1.340 0.049 0.003 0.079
50 21.181 7.881 0.127 0.337 0.047 0.016 -0.326 1.033 1.633 0.089 0.004 0.265
55 21.962 6.149 0.163 -0.124 0.046 -0.006 -0.399 -0.311 2.234 0.173 0.008 -1.394
60 19.941 3.888 0.257 -0.684 0.050 -0.034 -0.505 -1.355 3.362 0.278 0.014 -0.406
6
 CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO Y
CONSUMO DE GLICEROL.

Biomasa - Sustrato Vs tiempo

30
Visualización del consumo de
sustrato y crecimiento de los
microorganismos presentes
25
en el reactor

20
Biomasa- Sustrato (g/L)

Biomasa
15
Sustrato

10

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Tíempo Horas
7
 CONSUMO DE OXÍGENO

dX/Xdt dS/Xdt -dO2/Xdt

-0.0653 -0.0269 0.0659
-0.0036 -0.7102 -0.7051
0.1755 -1.0669 -1.3161
0.2066 -0.5024 -0.7957
0.1566 -0.2169 -0.4392
0.1168 -0.1062 -0.2720
0.0885 -0.0577 -0.1833
0.0671 -0.0341 -0.1294
0.0494 -0.0222 -0.0924
0.0331 -0.0167 -0.0637
0.0159 -0.0154 -0.0380
-0.0056 -0.0182 -0.0102
-0.0343 -0.0253 0.0234

8
 MODELO Y HERRAMIENTA
COMPUTACIONAL PARA PROCESO
BATCH: CONTOUIS
Es un modelo matemático para el crecimiento de microorganismos. El modelo de Contois es
considerablemente mejor que el modelo de Monod.

La herramienta computacional empleada para desarrollar el método numérico de Contois empleado en el

proceso Batch fue IBM SPSS Statistics a través de una regresión No Lineal.

El algoritmo a través del cual se desarrolló la ecuación Contois de la cinética Crecimiento bacteriano fué
Levenberg-Marquardt ya que posee un alto grado de convergencia y exactitud en el modelamiento de los
datos.

8
El modelo Contois arrojó un R cuadrado que se
ajusta de manera correcta a los datos
suministrados, el Ks bajo indica que el
microorganismo tiene gran afinidad con el
sustrato lo que conlleva a una gran generación y
concentración de producto.
 BIOPROCESO EN CONTINUO: NO
FACTIBLE
Los estudios que se han llevado a cabo con el Microorganismo Ralsthonia Eutropha no indican
proceso en Continuo con glicerol ni con otros sustratos debido a que el microorganismo al producir
intracelularmente el PHB requiere ser sometido a un proceso de Lisis celular al terminar la
fermentación, es decir finalizado el crecimiento bacteriano con producción interna del PHB la célula
debe morir para poder obtener el producto.

 Se propone realizar un proceso

productivo en Lotes alimentados o

proceso Fed-batch.

11
 TABLA DE DATOS PARA BIOREACTOR FED
BATCH

Sulfato
S
Tiempo de En este proceso de cultivo por
X (g/l) P (g/l) (Fructosa) Sr F (ml/h) F(l/h) µ(h-1
(h) Amonio
(g/l) lote alimentado, los nutrientes
(g/l)
0 0.2 0 6.5 0.73 0.1123 0 0 0
son continuamente
5 0.4 0 8.2 1.23 0.1500 80 0.08 0.04
10 0.8 0.01 8.3 1.3 0.1566 420 0.42 0.21 alimentados, mientras que el
15 1.8 0.9 6.4 1.4 0.2188 80 0.08 0.04 efluente es removido
20 2.5 1 3.8 1.27 0.3342 560 0.56 0.28
25 3.2 1.3 2.2 1.1 0.5000 500 0.5 0.25
discontinuamente. Este sistema
30 3.8 2 2.1 0.42 0.2000 350 0.35 0.175 es utilizado principalmente para
35 4.3 3.4 2 0.27 0.1350 770 0.77 0.385
disminuir efectos de inhibición,
40 4.6 3.9 1.9 0.25 0.1316 310 0.31 0.155
45 5 4.5 1.6 0.24 0.1500 340 0.34 0.17 llegando a mejorar la
50 5.5 5.2 1.1 0.23 0.2091 30 0.03 0.015 productividad de la
55 6 5.9 1 0.22 0.2200 0 0 0
fermentación.
60 6.9 6 0.9 0.2 0.2222 0 0 0
 Crecimiento Microbiano para Fed-Batch

Biomasa, Producto y consumo de sustrato Vs Tiempo

9

5
X (g/l)
S,X,P (g/l)

P (g/l)
4
S (Fructosa) (g/l)
Sulfato de Amonio (g/l)
3

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Tiempo (h)
 MODELO Y HERRAMIENTA
COMPUTACIONAL PARA PROCESO
FEDBATCH: SHAHHOSSEINI

Donde:
 : Velocidad máxima de crecimiento microbiano.
 : Constante de Saturación.
 : Relación
 : Concentración de sulfato de amonio en el bioreactor (g/L).
 : Concentración de fructosa en el bioreactor (g /L).
 : Valor de cuando
 : Constante adimensional.

La herramienta computacional empleada para desarrollar el modelo de Shahhosseini empleado en

el proceso FED BATCH fue IBM SPSS Statistics a través de una regresión No Lineal.
 COMPARACIÓN DE LOS PARÁMETROS
CINÉTICOS EN OPERACIÓN BATCH Y FEDBATCH

Batch (Glicerol) Fed-Batch

Modelo Contois Shahhosseini Se determinó que el proceso
Fed-Batch es una buena
Método de estimación Levenberg- Levenberg-
(Algoritmo) Marquardt Marquardt alternativa para lograr una alta
densidad de biomasa
0.005 0.210 conteniendo la mayor cantidad
posible de PHB
Constante de
0.599 0.042
saturación
 REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS

 MARTÍNEZ, Guadalupe. “PRODUCCIÓN DE PLÁSTICOS BIODEGRADABLES EN BACTERIAS”. Maestría en

Biotecnología. Facultad de Ciencias UdelaR. 2013

 POSADA, John, y Otros. “OPTIMIZATION ON THE USE OF CRUDE GLYCEROL FROM THE BIODIESEL
PRODUCTION TO OBTAIN POLY-3-HYDROXYBUTYRATE” Bioenergy Technology. Universidad Nacional de
Colombia sede Manizales. 2011.

 G.G Yolanda ,M.C  Juan Carlos , G.R Orfil,  C.L Jesús Antonio SÍNTESIS Y
BIODEGRADACIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS: PLÁSTICOS DE ORIGEN
MICROBIANO.  Rev. Int. Contam. Ambie. 29. Redalyc, 2013.

 BECERRA JIMENEZ, Mónica Liliana. “PRODUCCIÓN DE UN POLÍMERO TIPO POLIHIDROXIALCANOATO

(PHA) EMPLEANDO RESIDUOS DE LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL” Facultad de Ciencias. Universidad
Nacional de Colombia. Bogotá, 2013. Página 8-10

 NARANJO VASCO, Javier Mauricio. PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIBUTIRATO A

PARTIR DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES.  Universidad Nacional de Colombia. 2010.

 PRATAP R. patnaik, “DISPERSION OPTIMIZATION TO ENHANCE PHB PRODUCTION IN FED-BATCH

CULTURES OF RALSTONIA EUTROPHA” Institute of Microbial Technology, Bioresource Technology 97 (2006)
1994–2001 17
GRACIAS

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