Universidade de Brasília – UnB

Faculdade de Ciências da Saúde

Mestranda da Pós –Graduação
em Ciências Farmacêuticas
Larizza Matos
 Toda substância química pode ser considerada tóxica sob certas
condições de exposição.
Para cada substância deve haver alguma condição de exposição que
seja segura à saúde humana e ao ambiente.
 Toxicidade é a propriedade potencial de uma determinada substância
química de instalar um estado patológico em consequência de sua
introdução ou interação com o organismo. Esta propriedade é verificada
através da avaliação toxicológica onde se obtém dados como dosagem,
sinais, efeitos provocados que irão determinar o potencial de toxicidade
dessa substância.
Conceito:
Avaliação toxicológica é a análise de dados toxicológicos de uma
determinada substância química

Estabelecer os
limites de
segurança na
exposição aos
agentes químicos
Quais as substâncias devem ser testadas?
 TODAS?!
Todas as substâncias químicas novas devem ser submetidas à avaliação de sua segurança antes de serem
colocadas no mercado
Testes toxicológicos
 Servem para conhecer a toxicidade de uma substância química, a fim
de estimar os riscos para a saúde humana e meio ambiente .
Utilizando como modelos:

A. Técnicas in vitro : utilizam organismos como, bactérias, fungos, algas.

B. Técnicas in silico: ferramentas computacionais com capacidade preditiva, que fazem

comparações entre a molécula a ser testada e com os dados de REA (Relação Estrutura-
atividade) e QSTR (Quantitative Structure-toxicity Relationship) em diferentes sistemas, e se
possível, na literatura.
C. Técnicas in vivo : Animais de laboratório
 Boa correlação com homem
 Substâncias carcinogênicas no homem normalmente causam câncer in animais
 Doses tóxicas são similares no homem e em vários animais.
 Parâmetros anatômicos, fisiológicos e bioquímicos similares entre mamíferos
 Aceito pela comunidade científica
 Ética  principio dos 3Rs de Willian Russel refinamento, redução e substituição.
 Fazem parte dos requerimentos obrigatórios
para o registro de produtos
 Aditivos alimentares, agrotóxicos,
medicamentos

 Seguem protocolos internacionais

 OECD (Organização para Cooperação e
Desenvolvimento Econômico) 
Diretrizes da OECD para a ensaios de
produtos químicos são revistos
periodicamente à luz do progresso
científico ou mudança de práticas de
avaliação.
 Relação dose resposta
 Relação dose-resposta individual
Descreve a resposta de um organismo INDIVIDUAL . a diferentes doses de uma substância
química

 Relação dose-resposta quântica

Caracteriza a distribuição de respostas diante de doses diferentes em uma POPULAÇÃO
de organismos individuais
 Hipóteses consideradas na análise da relação dose- resposta:

1. Resposta é devida à substância administrada

2. A magnitude da resposta esta relacionada à dose

a. Existe um sítio receptor ou molecular com o qual a substância interage

b. A resposta está relacionada à concentração da substância no sítio de ação
c. A concentração da substância no sítio de ação está relacionada à dose administrada e à concentração
plasmática

3. Uma mesma substância pode ter uma série de relações dose-resposta uma para cada
efeito tóxico resultante
 A forma da curva relação dose- resposta
tem implicações importantes na
avaliação da toxicidade.
.
• Forma U : nutrientes essenciais,
hormesis
• Conceito dose limite : relação com a
segurança de exposição
Testes toxicológicos- Pesticidas
 Consulta Pública ANVISA nº 2 – 25/01/2011
 Registro de agrotóxicos – Lista de estudos para novas moléculas e produtos formulados
 Toxicidade oral aguda (DL50 oral);
 Toxicidade dérmica aguda (DL50 dérmica);
 Toxicidade inalatória aguda (CL50 inalatória);
 Irritação/corrosão ocular aguda;
 Irritação/corrosão dérmica aguda;
 Sensibilização dérmica;
 Teste de mutação reversa em bactérias;
 Teste de micronúcleo em eritrócitos de mamíferos;
 Toxicidade dérmica com doses repetidas 21/28 (vinte e um/vinte e oito) dias
 Toxicidade oral com doses repetidas por 90 (noventa) dias em ratos;
 Toxicidade oral com doses repetidas por 90 (noventa) dias em camundongos;
 Toxicidade oral com doses repetidas por 90 (noventa) dias em não roedores;
 Toxicidade crônica em não roedores;
 Toxicidade crônica e carcinogenicidade em ratos;
 Toxicidade crônica e carcinogenicidade em camundongos;
 Toxicidade reprodutiva por duas gerações em ratos;
 Toxicidade sobre o desenvolvimento pré-natal em ratos;
 Toxicidade sobre o desenvolvimento pré-natal em coelhos;
 Neurotoxicidade em roedores, quando houver indícios de neurotoxicidade nos estudos
de toxicidade aguda;
 Neurotoxicidade retardada após exposição aguda, quando houver indícios de
neurotoxicidade retardada nos estudos de toxicidade aguda;
 Neurotoxicidade retardada com doses repetidas (28 dias), quando houver indícios de
neurotoxicidade retardada: a) nos estudos de neurotoxicidade retardada após
exposição aguda; ou b) em outros estudos em doses repetidas;
 Neurotoxicidade no desenvolvimento, quando houver indícios de neurotoxicidade nos
estudos de toxicidade sobre desenvolvimento pré natal;
 Imunotoxicidade;
 Toxicocinética (ADME);
 Metabolismo em plantas
Testes toxicológicos- Medicamentos
Testes toxicológicos- Medicamentos
 Os testes pré clínicos objetivam satisfazer todas as exigências necessárias
antes de uma nova substância ser testada em humanos.
 Envolve 4 categorias principais:

Desenvolvimento químico e farmacêuticos

Testes farmacológicos

Testes toxicológicos

Testes farmacocinéticos
 Os estudos não clínicos de segurança propostos no Guia para a condução de
estudos não clínicos de toxicologia e segurança farmacológica
necessários ao desenvolvimento de medicamento – ANVISA são:

 Toxicidade de dose única (Aguda)

 Toxicidade de doses repetidas
 Toxicidade reprodutiva
 Genotoxicidade
 Tolerância local
 Carcinogenicidade
 Avaliação da segurança farmacológica
 Toxicocinética
Toxicidade oral aguda
 Protocolos (2001): OCDE 420, 423, 425;
 Objetivo: estimar a faixa de DL50 após exposição em dose única
ou múltipla, por um período de 24 horas;
 Espécie: ratos albinos (Rattus norvegicus )3 animais /dose;
 Doses: 5, 50, 300 e 2000 mg/kg de p.c.;
 Via: oral;
 Avaliação clínica: diária, durante 14 dias;

 Eutanásia: inalação de dióxido de carbono ou injeção de anestésico ;

 Achados patológicos
Toxicidade Dérmica Aguda
 Protocolo: OCDE 402, 434;
 Objetivos: estimar a faixa de DL50 cutânea por dose única ou múltiplas, 24 horas;
 Espécie: Ratos albinos (Rattus norvegicus), mín. 5 animais/sexo/dose.
 Dose limite: 2000 ou 4000 mg/kg de p.c.;
 Via: Dérmica
 Avaliação clínica: diária, durante 14 dias;
 Eutanásia: inalação de dióxido de carbono;
 Achados patológicos;
 Análise estatística: PROBIT
(intervalo de confiança a 95%).
 Toxicidade Inalatória Aguda
 Protocolo: OCDE 436
 Objetivo: determinar a CL50 (mg/L de ar/tempo) de uma substância quando
administrada pela via inalatória em ratos, em concentração única por um período de 4
horas;
 Espécie: ratos albinos (Rattus norvegicus), mín. 5 animais/sexo/concentração;
 Conhecer previamente o tamanho das partículas sólidas: granulometria;
 Via: inalatória;
 Avaliação clínica: diária, durante 14 dias;
 Eutanásia: inalação de dióxido de carbono;
 Achados patológicos;
 Irritação/Corrosão Cutânea
 Protocolo: OCDE 404;
 Objetivo: avaliar os efeitos irritantes e/ou corrosivos de uma substância quando
aplicada na pele de coelhos albinos, Nova Zelândia;
 Condições: pH ≥ 2 ou ≤ 11,5
 Espécie : coelhos albinos, Nova Zelândia, até 3
animais. Machos e/ou fêmeas;
 Dose: 0,5 mL (líquido) ou g (sólido/ pasta);
 Eutanásia: injeção intravenosa de anestésico
 Achados patológicos
 ESCALA DE GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES CUTÂNEAS
Formação de Eritema e Escaras
Ausência de eritema 0
ESCALA DE GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES CUTÂNEAS
Eritema muito fraco (pouco perceptível) 1
Formação de Eritema
Eritema e Escaras
bem definido 2
Ausência de eritema
Eritema moderado ..............................................................0
a severo 3
Eritema muito fraco (pouco perceptível) ......................................1
Eritema Eritema severo (vermelhidão)
bem definido à formação de escaras
..............................................................2 4
Eritema que
moderado a severo
impedem a graduação do ..................................................3
eritema
Eritema severo (vermelhidão) à formação de escaras que impedem
a graduação do eritema ..................................................4
Formação de Edema
Ausência
Formação de edema
de Edema 0
Edema muito fraco (pouco perceptível)
Ausência de edema ..............................................................0
1
Edema muito
Edemafraco (pouco
fraco (área perceptível)
de elevação do edema ......................................1
bem definida) 2
Edema fraco (área de elevação do edema bem definida) ................2
Edema moderado (elevação(elevação
Edema moderado de aproximadamente
de aproximadamente1 mm)................3
1 mm) 3
Edema severo (elevação acima de 1 mm, ultrapassando a área
Edema..........................................................................4
de exposição) severo (elevação acima de 1 mm, ultrapassando 4 DRAIZE et al, 1944, p. 384
a área de exposição
 Sensibilização Dérmica

 Protocolo: OECD 429 e 406 ;

 Método de Buehler
 Objetivo: Mensurar a capacidade de desenvolvimento de resposta imune pela comparação do
resultado com animais que tiveram a exposição de indução somente com o veículo.
 Espécie: Cobaias (Cavia porcellus)  20 animais teste e 10 animais controle. Machos e/ou fêmeas;
 Via: Injeção intradérmica ou exposição da epiderme – (exposição de indução)
 Achados patológicos
 1° Indução – dia 0: flanco esquerdo do grupo teste  6 horas
 2° Indução – dia 6-8 : flanco esquerdo do grupo teste  6 horas
 3° Indução – dia 13-15: flanco esquerdo do grupo teste  6 horas
 Desafio – dia 28: flanco direito do grupo teste e controle  6 horas
 Exames clínicos: 30 e 54 horas após cada aplicação
 Desafio: as reações cutâneas serão graduadas de acordo com Magnusson &
Kligman (1969)

 Positivo: desafio reações grau ≥ 1

Irritação/Corrosão Ocular em Coelhos
 Protocolo: OCDE 405, 438 ;
 Objetivo: avaliar os efeitos irritantes e/ou corrosivos de uma substância quando aplicada
no olho de coelhos;
 Condições: pH ≥ 2 ou ≤ 11,5; teste inicial com um animal
 Espécie/linhagem: coelhos albinos, Nova Zelândia. Até 3 animais. Machos e/ou fêmeas;
 Dose: 0,1 mL ou g;
 Uso de anestésico local  Lavagem após a aplicação.
 Olho controle;
 Eutanásia: injeção intravenosa de anestésico para eutanásia de animais;
 Achados patológicos : O grau de irritação / corrosão ocular é avaliado pelas lesões de
perfuração conjuntiva, córnea e da íris, em intervalos específicos.
 DRAIZE et al., 1944, p. 387
Córnea:
A.OPACIDADE
Nenhuma ulceração ou opacidade 0
Áreas espalhadas ou difusas de opacidade (diferente de brilho normal do olho 1
levemente diminuído) detalhes da íris claramente visíveis
Áreas translúcidas, facilmente discerníveis, detalhes da íris 2
levemente obscuros
Áreas opalescentes, sem detalhes visíveis da íris, tamanho da pupila pouco 3
discernível
Córnea opaca, íris invisíveis 4
B. ÁREA DA CÓRNEA ENVOLVIDA
Nenhuma área comprometida 0
Um quarto (ou menos), mas não zero. 1
Maior que um quarto, mas menos da metade 2
Maior que a metade, porém menos de três quartos 3
Maior que três quartos até a área total 4
Íris:
Normal 0
Dobras acima do normal, congestão, edema, moderada hiperemia pericorneana (alguma 1
ou todas essas reações ou combinações delas), íris ainda reagindo à luz
Nenhuma reação à luz, hemorragia, grande destruição 2

Conjuntiva:
A. HIPEREMIA
Vasos normais 0
Vasos injetados (hiperêmicos) acima do norma 1
Hiperemia mais difusa, vermelho mais escuro, vasos individualmente não discerníveis 2
Hiperemia vermelho vivo 3
B. EDEMA
Nenhum edema 0
Edema acima do normal 1
Edema evidente com everção parcial das pálpebras 2
Edema com as pálpebras semifechadas 3
Edema com as pálpebras semifechadas a completamente fechadas 4
Classificação toxicológica de pesticidas de acordo com os
testes toxicológicos
 Portaria nº 3/92, classificação toxicológica
 Portaria nº 84/96, classificação do potencial de periculosidade

Classificação Toxicidade1 Periculosidade2 Cor da tarja

Classe I Extremamente tóxico Altamente perigoso Vermelha

Classe II Altamente tóxico Muito perigoso Amarela

Classe III Medianamente tóxico Perigoso Azul

Classe IV Pouco tóxico Pouco perigoso Verde

 Aplicações das informações obtidas nos testes agudos- pesticidas:
 Definição de rotulagem e bula
 Símbolos de perigo e pictogramas (corrosivo ou irritante)
 Definição dos EPI’s que devem ser utilizados durante a manipulação
 Informações sobre os mecanismos de ação
 Efeitos adversos
 Primeiros socorros em casos de acidentes
Toxicidade Oral em Doses Repetidas – 28 dias
 Protocolo OCDE 407

 Objetivo : Investigar os efeitos sobre uma ampla variedade de potencial de toxicidade,

fornecendo informações sobre os possíveis riscos de saúde que possam decorrer de repetidas
exposições ao longo de um período de tempo relativamente limitado, incluindo os efeitos sobre o
sistema nervoso, endócrino imunológico. Principalmente estimar a NOAEL.

 Espécie: ratos albinos (Rattus norvegicus)  5 machos e 5 fêmeas/ dose

Grupo satélite do controle e da maior dose (não serão eutanasiados ao final do experimento, para avaliar
reversibilidade, persistência ou efeitos tardios adversos)
 Doses: Geralmente três doses são escolhidas, na qual a primeira será a milésima parte do valor
inferior do intervalo da estimativa de DL50. A segunda dose testada será a centésima parte; e a
terceira dose a décima parte limite máximo de dose 1000 mg/kg/dia.
 Avaliação clínica: diariamente aos 28 dias
Grupos satélite mais 14 dias
 Via: oral tratamento por 28 dias
 Eutanásia: inalação de dióxido de carbono ou injeção de anestésico ;
 Achados patológicos:
 Testes laboratoriais (hematologia, bioquímica) devem ser conduzidos, e em sequência os animais são
eutanasiados
 Realização de necropsia: observação macroscópica dos órgãos
 Mensuração da massa de todos os órgãos internos
 Histopatologia de todas as lesões encontradas
 De todos os órgãos coletados nos grupos controle e de maior dose. Nos outros grupos, somente dos órgãos com
lesão visível
Toxicidade Oral em Doses Repetidas para cães – 90 dias
 Protocolo: OECD 409
 Objetivos: Fornecer informações sobre a principais efeitos tóxicos, identificar os órgãos-alvo e a
possibilidade de acumulação, e pode fornecer uma estimativa da NOAEL, que pode ser usado na
seleção dos níveis de dose para estudos crônicos e na determinação de critérios de segurança para a
exposição humana.

 Espécie usadas: cães beagles de 4 a 6 meses de idade

 4 animais de cada sexo por grupo

 Via : Oral  ração alimentar ou na água ou por sonda gástrica ou em cápsulas

 Dose: Pelo menos 3 doses diferentes com sequência decrescente até chegar no NOAEL por 90
dias.
 Avaliação Clínica:
 Inspeção diária;
 Consumo de água, ração, peso corporal e exame clínico - semanal
 Exame neurotóxico, manifestações clínicas;
 Oftálmo - um dia antes do início e último dia
 Patologia clínica: análise hematológica, coagulação e bioquímica;
 Eutanásia: : injeção intravenosa de anestésico ,seguida de exsanguinação por secção das artérias
femurais.
 Necropsia: todos os órgãos são coletados e pesados; sangue por punção cardíaca
 Histopatologia: grupo controle e maior dose, nos outros grupos apenas órgãos alterados
Teste de Toxicidade / Carcinogenicidade- Combinado
 Protocolo: OECD 453
 Objetivos:
 Teste serve para identificar as propriedades carcinogênicas de uma susbtância,
especificamente seu potencial para induzir lesões neoplásicas
 Tempo de surgimento de tumores malignos
 Avaliar toxicidade crônica
 Identificar órgãos-alvo
 Caracterizar a relação dose/resposta
 Identificar o NOAEL com maior precisão
 Predizer os efeitos sobre a saúde em níveis de exposição equivalentes ao de humanos
 Prover dados para testar hipóteses sobre os mecanismos de ação
 Teste em duas fases paraleas
 Primeira fase (12 meses) – fase crônica
Avaliação do grupo controle e satélite de dose alta
 Segunda fase (24 meses) – fase carcinogenicidade
 Avaliação de todos os outros grupos

 Espécie: Ratos albinos (Rattus norvegicus), 6 semanas de idade. Ambos os sexos devem ser
usados.
 Grupos (1 controle e 3 tratados)
Grupos de tratados em pelo menos três doses (50 animais /sexo/dose, e mais um satélite com a
dose alta, 12 animais)  50 animais /sexo/grupo= para cada grupo 100 animais e 4 grupos=400;
DÚVIDA PROFESSOR Sobre
 eutanásia após 24 meses quem são esse 20 animais são os
não tratados? E pq ou com os
Satélite por cada grupo com 20 animais (controle) ou 12 animais (tratado) tratados, não seria e?? Li o
 eutanásia após 12 meses protocolo td e nã consegui
entender essa parte
 Via: oral  Substância adicionada na ração
 Dose : em pelo menos três doses (alta, média e baixa)  sequência decrescente até chegar no
NOAEL
 Avaliação clínica
• Exame clínico semanal e inspeção duas vezes ao dia
• Exame oftálmico um dia antes do início e no último dia do tratamento nos grupos satélites
• Exames laboratoriais (hematologia, bioquímica e de urina) aos 3, 6, 12, 18 e 24 meses em 20
animais por sexo por grupo.
Avaliação Toxicidade Reprodutiva
 Protocolo: OECD 421
 Objetivos: fornecer informações iniciais sobre os possíveis efeitos sobre a reprodução e / ou
desenvolvimento avaliação significativa da potencial da substância para afetar a fertilidade,
gravidez, amamentação materna e comportamento, e crescimento e desenvolvimento fetal da
prole desde a concepção até dia 4 pós-parto.
 Espécie: Ratos Albinos (Rattus norvegicus)
3 grupos tratados e 1 controle : 10 animais de cada sexo/ grupo (espera-se pelo menos 8 fêmeas
prenhes no processo)
 Via: oral  gavagem, na ração ou água
 Dose: Pelo menos 3 doses diferentes com sequência decrescente até chegar no NOAEL
 Avaliação clínica:
Todas as avaliações clínicas vistas anteriormente, mais a avaliação de número de nascimentos, de
fetos mortos e avaliações histopatológicas dos órgãos reprodutivos do animais são realizadas
 Teratogênese
 Protocolo: OECD 414
 Objetivos: Avaliar o efeito de substâncias no desenvolvimento embriofetal de ratos.
 Espécie: Ratos Albinos (Rattus norvegicus) com idade de acasalamento  20 fêmeas por grupo,
pelo menos
 Via: oral  por gavagem do 6º (implantação) ao 20º dia de gestação.
 Dose: Pelo menos 3 doses diferentes com sequência decrescente até chegar no NOAEL
 Eutanásia e laparatomia após a ultima dose
 Avaliação clínica:
As fêmeas são mortas, o conteúdo uterino é examinado e os fetos são avaliados para tecidos moles e
alterações esqueléticas.
Avaliação dos índices reprodutivos:
 Números de corpos lúteos

 Presença de reabsorção

 Sítios de implantação
Teste de Ames
 Avalia a atividade mutagênica de compostos químicos, utilizando linhagens de bactérias
Salmonella thiphimurium com mutações no operon histidina (his-), que as impossibilitam de
crescerem em um meio sem histidina. A avaliação da mutagenicidade pelo Teste baseia-se na
quantidade de colônias de bactérias (revertantes) que cresceram em meio deficiente de
histidina, devido a uma reversão genética, 48 horas após a inoculação juntamente com o
composto a ser analisado. Também foi incorporado ao sistema enzimas do fígado de mamífero
(rato)
Situações: Resultado
1. Hist - em meio com histidina cresce normalmente
2. Hist- em meio sem histidina não cresce
3. Hist- em meio sem histidina e com substância não mutagênica não cresce
4. Hist- em meio sem histidina e com substância mutagênica (que promove cresce pois passa a sintetizar
mutação de hist- para hist+) histidina
 Teste cometa:
 O Teste Cometa (teste de células individualizadas em gel de agarose) é uma técnica útil
para o estudo de danos e reparos no DNA  detecta lesões pré- mutagênicas

 O princípio da técnica é simples: as células são inclusas em gel sobre uma lâmina
de microscopia, faz-se passar uma corrente elétrica e, como o DNA tem carga
negativa, se estiver rompido (clastogênese), migra para fora do núcleo, ficando
com a aparência de um cometa ou cauda. O DNA que não estiver rompido ou
quebrado fica armazenado no núcleo, sendo muito grande para migrar.

 Este teste não é utilizado para detectar mutações, mas sim lesões genômicas 
que podem ser reparadas e, se não reparadas, podem resultar em mutação
 Teste micronúcleo:
 O teste do micronúcleo tem sido aplicado
extensivamente em testes de
genotixicidade, pois os micronúcleo
são facilmente visualizados nos eritrócitos e são
fortes indicativos de
mensuração de aberrações cromossômica.