Atina Hussaana

Dept. Pharmacology & Therapy

Medical Faculty of UNISSULA
PENELITIAN BA
/TO/OT Bioassay in vitro Clinical
assay
Bioassay in vivo

Preparasi Pembuatan
EKSTRAKSI
Bahan Simplisia

Identifikasi Identifikasi Fraksinasi

Kualitatif Kuantitatif Isolasi
GOLONGAN (Penetapan Pemurnian
Kadar)
Alkaloid Penentuan
Flavonoid Struktur
STANDARISASI kimia
Terpenoid
(senyawa marker)
Saponin
 IDENTIFIKASI
KUALITATIF

Fraksinasi + Pereaksi Pewarna Reaksi

Warna
GOLONGAN
APA?
Pereaksi Pewarna Bercak
(Semprot) Berwarna
Kromatografi
(KLT) +
Sinar UV Bercak
254 dan 366 nm Berpendar

Dibandingkan
warna / Rf SENYAWA
dengan bercak APA?
senyawa standar
 Fraksinasi + Pereaksi Pewarna

GOLONGAN
Identifikasi Kualitatif
Identifikasi Alkaloid : Metoda Culvenor-Fiztgerald
Alkaloid Kira-kira 4 gram sampel segar dirajang halus dan digerus dalam
lumpang dengan bantuan pasir, lalu ditambahkan kloroform
sedikit sampai membentuk pasta.
Tambahkan 10 ml larutan amoniak-kloroform 0.05 N dan digerus
lagi, saring campuran kedalam sebuah tabung reaksi kering.
Tambahkan 10 ml H2SO4 2 N dan kocok kuat. Diamkan larutan
sampai terbentuk dua lapisan.
Dengan menggunakan pipet yang telah diberi kapas pada
ujungnya untuk menyaring, ambil lapisan asam sulfat dan
masukan kedalam tabung reaksi kecil ( Lapisan kloroform
disimpan untuk pengujian terpenoid ).
Filtrat diuji dengan pereaksi Mayer, Wagner dan Dragendorf.
Terbentuknya endapan putih atau keruh dengan pereaksi Mayer.
Endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan orange
dengan pereaksi Dragendorf menunjukan sampel mengandung
alkaloid.
 Fraksinasi + Pereaksi Pewarna

GOLONGAN
Identifikasi Kualitatif
Flavonoid Identifikasi Flavonoid : Shinoda Test / sianidin Test

Kira-kira 0.5 mg sampel yang telah dirajang halus,

diekstrak dengan 5 ml metanol dan dipanaskan selama
5 menit dalam tabung reaksi. Ekstraknya ditambahkan
beberapa tetes HCl pekat dan sedikit serbuk
magnesium. Bila terjadi perubahan warna merah/pink
atau kuning menunjukan sampel mengandung
flavonoid.
 Fraksinasi + Pereaksi Pewarna

GOLONGAN
Identifikasi Kualitatif
Identifikasi Steroid / terpenoid : Metode Lieberman-
Terpenoid Burchard

Beberapa tetes kloroform pada uji alkaloid,

ditempatkan pada plat tetes. Tambahkan anhidrida
asetat 5 tets dan biarkan mengering. Kemudian
ditambahkan 3 tetes H2SO4 pekat. Timbulnya warna
merah jingga atau ungu menandakan uji positif
terhadap terpenoid, warna biru atau hijau
menunjukkan positif terhadap steroid
 Fraksinasi + Pereaksi Pewarna

GOLONGAN
Identifikasi Kualitatif
Identifikasi Saponin : Uji Busa
Saponin
Uji saponin ini sebaiknya digunakan sampel yang
telah dikeringkan, karena test yang digunakan adalah
test pembentukan busa. Bila sampel yang basah
dididihkan dengan air suling, kemungkinan cairan sel
akan membentuk busa bila dikocok.
Caranya : sampel kering dirajang halus, dimasukan
kedalam tabung reaksi dan ditambahkan air suling,
didihkan selama 2-3 menit. Dinginkan, setelah dingin
dikocok dengan kuat. Adanya busa yang stabil selama
5 menit berarti sampel mengandung saponin.
 METODA
PEMISAHAN
 Kromatografi : adalah suatu tehnik pemisahan tertentu, yang
pada dasarnya menggunakan dua fase yaitu satu fase tetap
(stationary) dan yang lain fase bergerak (mobile).

 Kromatografi kertas (KKt)

 Kromatografi lapisan tipis (KLT)

 Kromatografi gas cair (KGC)

 Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)

 KKt untuk senyawa yang mudah larut dalam air (misalnya :
karbohidrat, asam amino, basa asam nukleat, asam organik,
senyawa fenolat).

 KLT untuk senyawa yang larut dalam lipid (misalnya : lipid,

steroid, karotenoid, kuinon).

 KGC untuk pemisahan senyawa atsiri yaitu asam lemah,

seskuiterpen, hidrokarbon dan senyawa belerang.

 KCKT untuk senyawa yang keatsiriannya kecil.

 POLA KROMATOGRAM

 Ekstrak ditinbang, diekstraksi dengan pelarut dan cara

tertentu, kemudian dilakukan analisis kromatografi
sehingga memberikan pola kromatogram yang khas.

 Kadar Total Golongan Kandungan Kimia

 Dengan penerapan metode spektrofotometri, titrimetri,

volumetri, gravimetri atau lainnya, dapat ditetapkan kadar
golongan kandungan kimia.
 Ada beberapa golongan kandungan kimia yang dapat
dikembangkan dan ditetapkan metodenya, yaitu :

 Golongan minyak atsiri

 Golongan steroid

 Golongan tanin

 Golongan flavonoid

 Golongan triterpenoid (saponin)

 Golongan alkaloid

 Golongan antrakinon
 Kadar Kandungan Kimia Tertentu

 Dengan tersedianya suatu kandungan kimia yang berupa

senyawa identitas atau senyawa kimia utama ataupun
kandungan kimia lainnya, maka secara kromatografi
instrumental dapat dilakukan penetapan kadar kandungan
kimia tersebut.

 T U J UAN :

 Memberikan data kadar kandungan kimia tertentu sebagai

senyawa yang diduga bertanggung jawab pada efek
farmakologi.
 Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

 Umumnya dibuat kromatogram pada lempeng silika dengan

berbagai jenis fase gerak sesuai dengan golongan kandungan
kimia sebagai sasaran analisis.

 Kromatografi Gas Cair (KGC)

 Sistem kromatografi gas cair mempunyai resolusi tinggi

sehingga optimal untuk pemisahan komponen yang stabil
dengan pemanasan.
 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT / HPLC)

 Umumnya pola kromatogram kandungan kimia yang

termolabil dibuat dengan HPLC

 Penetapan Kadar :

 Minyak atsiri : destilasi

 Steroid : spektrofotometri
 Tanin : titrasi dengan KMnO4 (Permanganometri)
 Flavonoid : hidrolisis, ekstraksi dan
spektrofotometri
 Saponin : hemolisa
 Alkaloid : ekstraksi dan spektrofotometri
 Antrakuinon : ekstraksi dan spektrofotometri
 KLT lebih baik dari KKt yaitu dalam keserbagunaan, kecepatan
dan kepekaannya. Ini karena pada KLT dapat digunakan
bermacam-macam zat penyerap lainnya selain cellulosa, yaitu :
silika gel, aluminium oksida, kalsium hidroksida, damar penukar
ion, magnesium fosfat, poliamida, polivinil pirolidon.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT / HPLC )

 Hampir sama dengan KGC

 KCKT dilakukan dalam suhu kamar

 KCKT digunakan untuk senyawa-senyawa : terpemoid, fenol ,

alkaloid , lipid , gula.
 Setelah senyawa diisolasi dan dimurnikan , pertama-tama
ditentukan golongannya dulu, kemudian baru ditentukan jenis
senyawa dalam golongan tersebut.

 Metoda Identifikasi dilakukan dengan spektrofotometri :

 Spektroskopi UV (Ultra Violet)

 Spektroskopi IM (Infra Merah)

 Spektroskopi Massa ( S.M. )

 Spektroskopi RMI ( Resonansi Magnet Inti )

 Spektroskopi UV ( Ultra Violet )

 Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam

larutan yang sangat encer dengan pembanding blanko pelarut
serta menggunakan spektrofotometer yang merekam
otomatis. Senyawa tak berwarna diukur pada jangka 200
sampai 400 nm, senyawa berwarna pada jangka 200 sampai
700 nm.

Spektroskopi IM ( Infra Merah )

 Spektrum infra merah tumbuhan dapat diukur dengan

spektrofotometri infra merah yang merekam secara otomatis
dalam bentuk larutan ( dalam khloroform,
karbontetrakhlorida, 1-5 % ), bentuk gerusan dalam minyak
nuyol, atau bentuk padat yang dicampur dengan kalium
bromida.
 Spektroskopi Massa (S.M. )

 Spektroskopi Massa adalah penguraian sesepora

senyawa organik dan perekaman pola fragmentasi
menurut massanya.

Spektroskopi RMI

 Spektroskopi RMI merupakan sarana untuk

menentukan struktur senyawa organik dengan
mengukur momen magnet atom hidrogennya.
 Pada analisa hasil yang dilakukan adalah :

 Analisa kualitatif

 Analisa kuantitatif

 Analisa kualitatif : Pada analisa kulaitatif, ini

diharapkan ditemukan beberapa kandungan yang
mempunyai struktur baru.

 Analisa kuantitatif : Yaitu penentuan banyaknya

( jumlah gram ) senyawa yang ditemukan, biasanya
ditentukan dalam persentase.
 TEKNIK KROMATOGRAFI
Kromatografi
: suatu teknik pemisahan tertentu yang pada
dasarnya menggunakan 2 fase : fase tetap
(stationary) & fase bergerak (mobile).

Penggolongan sesuai dengan sifat-sifat dari

fase tetap, yang bisa berupa zat padat / zat
cair.

Jika fase tetap berupa zat padat disebut :

kromatografi serapan
Jika fase tetap berupa zat cair disebut :
kromatografi partisi.
Keuntungan kromatografi :

Merupakan metode pemisahan yang

cepat, mudah, murah & sederhana,
membutuhkan campuran cuplikan sedikit
sekali.

Dapat diulang.
Kromatografi Lapisan Tipis :
metoda pemisahan fisikokimia menggu-
nakan lapisan tipis yang dilekatkan pada
penyokong berupa plat dari gelas / logam.

Keunggulan : lebih peka (dapat memisahkan

bahan yang jumlahnya sedikitnya / ukuran µg)

Deteksinya : dengan penyemprotan pereaksi

pewarna / lampu UV.

Biasanya untuk pemisahan senyawa larut lipid

(misalnya: lipid, steroid, karotenoid, kuinon )
Fase diam biasanya : silica gel
Fase gerak :
campuran pelarut organik dengan polaritas
rendah.

Penempatan cuplikan dengan pipa kapiler

/ mikropipet pada salah satu ujung plat KLT.

Kemudian plat KLT ditaruh dalam bejana

yang sudah ada dan dijenuhi dengan fase
gerak.
Deteksi hasil KLT :
•Untuk senyawa tak berwarna pada
kromatogram  dengan alat UV pendek
(254 nm) & atau  panjang (365 nm).

•Senyawa dengan 2 ikatan rangkap / lebih &

senyawa aromatik (benzena) punya serapan
kuat di  230 - 300 nm.

•Deteksi dengan pereaksi pewarna semprot.

Menggunakan alat penyemprot khusus.

•Metoda deteksi biologi  untuk mendeteksi

senyawa kimia dengan aktivitas biologi
tertentu.
CONTOH KROMATOGRAM dengan
pereaksi pewarna
CONTOH KROMATOGRAM dengan
deteksi UV
• Gambar 32. Hasil KLT trans- dan cis-UCA
• Larutan trans-UCA 4% dalam
• DMSO dipapar radiasi UVB selama
60 menit, akan mengalami
isomerasi, sebagian berubah
menjadi konformasi cis. a. trans-
UCA murni b. hasil ekspose trans-
UCA pada radiasi UVB.
Cis-UCA Trans-UCA
Rf : 7/8.5 Rf : 4/8.5
= 0.82 = 0.47
Identifikasi & harga-harga Rf
Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal
Harga Rf = --------------------------------------------------------------------
Jarak yang digerakkan oleh pelarut dari titik asal

Jarak yang digerakkan oleh senyawa yang tak diketahui

Rx / Rstd = --------------------------------------------------------------------------
Jarak yang digerakkan oleh senyawa standart yang
diketahui
Faktor yang mempengaruhi gerakan noda
dalam KLT (mempengaruhi harga Rf) :
a. struktur kimia dari senyawa yang
sedang dipisahkan.
b. sifat penyerap dan derajat aktifitasnya
c. tebal dan kerataan lapisan penyerap
d. pelarut & derajat kemurnian fase
bergerak
e. derajat kejenuhan dari uap dalam
bejana
f. teknik percobaan
g. jumlah cuplikan yang digunakan
h. suhu
i. kesetimbangan
Pembuatan Kromatogram

Totolkan cuplikan dengan pipa kapiler, pada jarak ± 1

cm dari bagian bawah plat KLT.
(plat kecil noda berupa titik, plat besar noda berupa
deretan titik membentuk garis). Biarkan beberapa saat
hingga kering. Penotolan cuplikan dapat diulang
seperlunya, pada tempat yg sama.

Plat KLT dimasukkan dalam bejana yang berisi fase

gerak (noda jangan sampai tercelup )

Setelah fase bergerak naik sampai hampir ujung atas

plat, plat kemudian diambil dan dibiarkan kering.

Tentukan harga Rf.