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Pueden ser sintetizadas por el uso de una RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA
polimerasa). La secuencia de la sonda es clonada en un vector que
flanqueará dos sitios distintos de iniciación.
Las sondas pueden ser usadas para detectar
microorganismo directamente de una muestra clínica
(expectoración, orina, etcétera) o para confirmar la
identificación de un cultivo que por otros métodos tarda
varios días.
INDICACIONES
PARA EL USO DE Las sondas pueden ser usadas para hibridación in situ
SONDAS EN EL para evaluar la respuesta del huésped a un agente
LABORATORIO infeccioso en particular y también para determinar la
extensión de la infección mediante el estudio de
muestras de tejidos de varios órganos.
PREPARACIÓN DE LA
SONDA
Para sondas de cadena sencilla, se debe usar la secuencia reversa
complementaria. Cuando las sondas son sintetizadas por transcripción,
involucra generar mRNA del gen endógeno.
En general es preferible usar sondas específicas, ya que esto garantiza una
buena hibridación. Existen situaciones en las cuales esto no puede llevarse a
cabo, por ejemplo, si los genes todavía no están clonados de las especies
usadas para la hibridación o si la secuencia génica es muy similar entre
especies. Esto puede favorecer una hibridación entrecruzada.
EL DISEÑO DE LA SONDA
La hibridación entrecruzada utiliza sondas largas usadas bajo condiciones
selectivas especialmente después de la digestión con nucleasas, ya que una
sonda además de homóloga.
Para sondas es muy probable que algún gen distinto al de interés tenga una
secuencia idéntica. Alternativamente se puede hacer un screening y éste
puede ser realizado por búsqueda de secuencias en bases de datos.
Los mRNA poseen las secuencias poli(T) y poli(U), al transcribirse a cDNA se evita
que la sonda no incluya esta cola, porque secuencias largas, ricas en GC dan
una gran estabilidad a la sonda por los triples enlaces que se forman entre
estas bases.
ELECCIÓN DE LA SONDA
Las sondas largas pueden emitir una señal más fuerte debido a
que incorporan mayor número de nucleótidos marcados dentro de
ella. Sin embargo, las sondas que son tan largas dan señales
débiles, debido a que la sonda penetra menos eficientemente en el
tejido. La mejor estrategia es usar una secuencia larga como
templado para la síntesis de la sonda pero asegurar que la sonda
generada es lo suficientemente pequeña para poder penetrar.
Las ventajas de estas técnicas son que nos permiten investigar directamente al
microorganismo, sin necesidad de que se encuentre viable, ni de que esté en
cultivo puro.
Entre las principales ventajas de las sondas genéticas hay que destacar la sencillez de su
manipulación, que permite su adaptación a cualquier laboratorio. El principal
inconveniente es su coste. Es una tecnología muy utilizada en la actualidad en
laboratorios nivel II.
TECNOLOGÍAS GENÉTICAS Los científicos han desarrollado una
serie de técnicas bioquímicas y
genéticas mediante las cuales el ADN
puede ser separado y transferido de
una célula a otra. Algunos de esos
métodos de laboratorio ayudan a los
investigadores a estudiar las
propiedades de los genes en la
naturaleza