Metode razdvajanja

HROMATOGRAFIJA

Hromatografija (od grč. Χρώμα -

chroma, boja i γραφειν - grafein
pisati) je opšti naziv za grupu
laboratorijskih tehnika za
razdvajanje i izdvajanje
komponenata iz različitih smeša.

Kretanjem ispitivane smeše, rastvorene u "mobilnoj

fazi", kroz "stacionarnu fazu“ delovi smeše se
razdvajaju i izoluju.
- analitička
- preparativna
Metode razdvajanja HROMATOGRAFIJA
Različita raspodela komponenata uzorka između dve faze, od kojih je jedna
nepokretna (stacionarna), a druga pokretna (mobilna) u odnosu na prvu.

Eluacija
 HROMATOGRAFIJA
Pojmovi u hromatografiji
Analit je supstanca koja se razdvaja u hromatografiji.

Analitička hromatografija se koristi za određivanje prisustva

i koncentracije analita u uzorku (smeši).
Preparativna hromatografija služi za prečišćavanje
supstanci za određene svrhe (ne za analizu).
Hromatogram je vizualni prikaz rezultata hromatografskog
postupka. Svakoj supstanci odgovara određeni pik na
hromatogramu.
Eluent je komponenta separacijskog sistema koja pokreće
uzorak kroz kolonu.

Efluent je kompletna mobilna faza koja izlazi iz kolone

 HROMATOGRAFIJA
Pojmovi u hromatografiji

Stacionarna faza je supstanca koja je fiksirana u koloni

(GC i LC) ili ploči (npr. silikagel u TLC), na čijoj se površini
određeno vreme zadržavaju supstance koje se razdvajaju.
Mobilna faza je faza koja se kreće u određenom pravcu.
Može biti tečna (LC) ili gasovita (GC). Mobilna faza se kreće
kroz kolonu noseći uzorak koji se razdvaja.

Retenciono vreme je vreme za koje analit prođe kroz

hromatografski sistem u određenim uslovima.
Hromatograf je instrument za hromatografiju.
 HROMATOGRAFIJA

Hromatogram
Hromatogrami
 HROMATOGRAFIJA

Klasifikacija hromatografskih metoda

Različiti kriterijumi:
- fizičko-hemijski fenomeni koji se
dešavaju prilikom razdvajanja
(mehanizmi razdvajanja)
- fizičko stanje faza
- tehnike

Priroda molekula koji se hromatografski razdvajaju

određuje tip (vrstu) čvrstog matriksa (faze) koji će
se koristiti.
 MOBILNA MOBILNA
FAZA FAZA

Opšti pregled najčešćih

retencionih mehanizama koji
se primenjuju u različitim
PODEONA ADSORPCIONA
HROMATOGRAFIJA HROMATOGRAFIJA
vidovima hromatografije.
MOBILNA
FAZA MOBILNA
FAZA

EKSKLUZIONA JONOIZMENJIVAČKA
HROMATOGRAFIJA HROMATOGRAFIJA

MOBILNA
FAZA

AFINITETNA HROMATOGRAFIJA
 Klasifikacija hromatografskih metoda
Adsorpciona Fenomen adsorpcije
Podeona Fenomen raspodele
između dve faze
Na izmenjivačima jona Fenomen izmene jona
Na molekulskim sitima Fenomen molekulskog sita
Afinitetna Fenomen
visokospecifičnog afiniteta

Kolonske tehnike
Laminarne tehnike
 Klasifikacija hromatografskih metoda
Kolonske tehnike:
- tečna kolonska hromatografija
- visokopritisna tečna hromatografija
(HPLC - High-performance liquid chromatography )
- gasna hromatografija

Laminarne tehnike:
-hromatografija na tankom sloju
(TLC- Thin layer chromatography)
- papirna hromatografija
 Klasifikacija hromatografskih metoda

Tečna hromatografija:
Adsorpciona (tečno/čvrsto), npr. TLC i HPLC
Jonoizmenjivačka (Jonska)
Podeona (Particiona) (tečno/tečno)

Gasna hromatografija:
Gas/tečno
Gas/čvrsto
 Adsorpciona hromatografija

Mobilna faza koja može biti tečnost ili gas se prenosi duž čvrste faze
(adsorbensa). Ravnoteža između mobilne i stacionarne faze definiše
separaciju različitih supstanci iz smeše.
Separacija različitih molekula
zavisi od serije pojava
adsorpcija / desorpcija
Čestice iz
mobilne faze
adsorbovane na
površini
adsorbensa
(adsorbat)

Koncentracija
supstance u
stacionarnoj
fazi

Čvrsta faza
(adsorbens)
Adsorpciona izoterma

Koncentracija supstance u mobilnoj fazi

 Adsorpciona hromatografija

Adsorbensi koji se koriste u adsorpcionoj hromatografiji

Slabi Srednje jaki Jaki

Saharoza Kalcijum karbonat Magnezijum silikat
Skrob Kalcijum fosfat Aluminijum oksid
Inulin Magnezijum karbonat Silika-gel
Talk Magnezijum oksid Aktivni ugalj
Natrijum karbonat Kalcijum hidroksid

Jačina adsorpcije  granulacija (površina adsorbensa), aktivacija, saturacija (H2O)

Adsorpcija nepolarnih molekula raste sa porastom njihove veličine (mol. mase)

Adsorpcija polarnih molekula raste sa polarnošću grupa.

Rastvarač  razvijanje hromatograma  eluaciona sposobnost (zavisi od

polarnosti, odnosno dielektrične konstante)
 Metode za razvijanje (i analizu) hromatograma

Eluaciona metoda Frontalna metoda Metoda

analize analize istiskivanja
 Podeona hromatografija
Razdvajanje se vrši između mobilne faze koja može biti tečna (rastvarač)
ili gasovita (gas-nosač) i tečne stacionarne faze koja je naneta na inertni
nosač.
Ravnoteža između mobilne tečne i stacionarne tečne faze (koje se ne
mešaju) određuje separaciju različitih supstanci iz smeše.
Separacija komponenata iz smeše
Ispitivana supstanca se bazira na njihovoj preraspodeli
rastvorena u tečnoj između dve tečne faze (relativnoj
stacionarnoj fazi koja se rastvorljivosti komponenata
nalazi na površini smeše)
inertnog nosača

-normalne faze
Kolonska tehnika -obrnute faze
Laminarna tehnika
 Hromatografija na izmenjivačima jona
Razdvajanje supstanci se vrši između mobilne tečne faze i specifične čvrste
stacionarne faze (smola) koja sadrži labilno kovalentno-vezane jone. Joni nosača
se mogu reverzibilno i u ekvivalentnim količinama vezivati i zamenjivati drugim
jonima iz rastvora električnim silama.
Mobilni anjoni se
zadržavaju u blizini
katjona koji su
kovalentno vezani
za nosač
(stacionarnu fazu)
Anjon-izmenjivač Katjon-izmenjivač

Anjon-izmenjivačka
smola: samo anjoni
mogu biti privučeni
 Hromatografija na molekulskim sitima
Mobilna tečna, ili gasna faza prolazi kroz porozni gel koji ima ulogu
separatora molekula iz smeše na osnovu veličine. Pore su najčešće veoma
sitne čime se veliki molekuli isključuju. Rezultat ove separacije je da veliki
molekuli brže prolaze kroz kolonu i zajedno sa mobilnom fazom izlaze sve
molekulske vrste dimenzija većih od dimenzija pora.
Molekulska sita – visoko umrežena nerastvorna organska jedinjenja u obliku gela

Gel-filtracija Veliki molekuli se

odvajaju

Porozne
partikule Kolona
Mali molekuli nosača
prolaze kroz pore
partikula nosča

Mali Veliki
molekuli molekuli

Molecular exclusion chromatography Kolonska tehnika

 Afinitetna hromatografija
Veoma selektivna. Pogodna za izdvajanje komponenata iz biohemijskih smeša.
Razdvajanje bazira na interakciji između specifične vrste molekula iz rastvora i
molekula koji su imobilisani na stacionarnoj fazi npr. imobilisani molekul na
stacionarnoj fazi može biti antitelo za izdvajanje specifičnog proteina.

Specifičan molekul u
smeši vezuje se za
“kompatibilan” molekul
kovalentno vezan za
stacionarnu fazu

Ostali molekuli
prolaze kroz kolonu
Afinitetna hromatografija
Bazira na visoko specifičnoj biološkoj
interakciji, npr. između antigena i
antitela, enzima i supstrata, receptora i
liganda.

Pogodna za:
-prečišćavanje molekula iz smeše
-smanjenje koncentracije pojedinih molekula
iz smeše
- određivanje vrste bioloških materija koje
vezuju specifične molekule
Klasifikacija hromatografskih metoda
TLC

Hromatografska
komora

Rastvarač Rastvarač
 Klasifikacija hromatografskih metoda
TLC

TLC mastila

TLC automatski sistem

 Hromatografija na koloni

Pri hromatografskom razdvajanju supstanci u koloni, dužina puta l=const,

hromatogram predstavlja zavisnost koncentracije od vremena ili
zapremine mobilne faze. Kvalitativna i kvantitativna analiza hromatograma.
 Gasna hromatografija
Kolonska tehnika
Adsorpciona
Podeona – veća primena

Supstance koje se ispituju su na sobnim

temperaturama u gasnom obliku, zagrevanjem
prelaze u gasno agregatno stanje, ili se specifičnim
reakcijama mogu prevesti u isparljiva jedinjenja.

Razdvajanje se odvija između mobilne faze (gas nosač) i

stacionarne tečne faze (nalazi se na sprašenom inertnom
nosaču, ili prekriva unutršnji zid kolone)  različiti
koeficienti raspodele (rastvorljivosti) – eluaciona analiza.

Kvalitativne karakteristike  retencina vremena (zapremine)

Kvantitativne karakteristike  površine (visine) pikova
 Klasifikacija hromatografskih metoda
Analitička tehnika za Gasna hromatografija – Gas
separaciju komponenata iz chromatography [GC]
smeše koje su prisutne, ili se
mogu dovesti (zagrevanjem)
u gasno agregatno stanje.
Iz hromatograma se dobijaju
podaci o kvalitativnom i
kvantitativnom sastavu
smeša (uzoraka).
Prolazeći pod visokim
pritiskom u gasnom obliku,
komponente se razdvajaju i
raspodeljuju između
stacionarne faze (može biti
tečna, ili čvrsta) i mobilne
faze koja je gas. Različita
preraspodela (vremenska i
prostorna) komponenata u
stacionarnoj fazi rezultira
hromatogramom.
 Manometar za Gasna hromatografija
merenje
Manometar pritiska gasa
za merenje nakon Integrator
pritiska gasa redukcije Regulacija
protoka Detektor
u boci
gasa nosača

Redukcioni
ventil Pojačavač
el. signala
Pisač
Gas-nosač Hromatografska
kolona

Helijum
Azot
Argon
15 MPa Injekcioni blok Termostat
(do 400 °C)
 Gasna hromatografija
Gas nosač
Helijum
Argon
Azot
Kolone
Preparativne
Analitičke
Punjene – inertni nosač impregniran likvidnom fazom
Kapilarne
Standardne punjene kolone imaju prečnik 1.5 – 10 mm, dužinu nekoliko
metara, sadržaj likvine faze 5 – 30%, inertni nosač ima prečnik čestica 100
– 500 m

Standardne kapilarne kolone mogu imati unutrašnji zid prevučen

likvidnom fazom, ili unutrašnji zid prevučen likvidnom fazom u koju je
speašen inertni nosač. Unutrašnji prečnik je do 1 mm, a dužina do 200 m
 Klasifikacija hromatografskih metoda
Visokopritisna tečna hromatografija – High performance
liquid chromatography [HPLC]
Jedna od najmoćnijih metoda u analitičkoj hemiji.
Izdvaja, identifikuje i kvantifikuje komponente iz smeša
(uzoraka) koje su rastvorljive u tečnosti.
Mogu se izdvojiti komponente smeša koje su prisutne u
tragovima (milioniti, bilioniti deo).
Primena – u farmaceutskoj, kozmetičkoj, prehrambenoj
industriji, forenzici, ekologiji...
Klasifikacija hromatografskih metoda

HPLC SISTEM
 Centrifugiranje

Centrifugiranje je sedimentacija čestica pod uticajem centrifugalne sile i upotrebljava

se za razdvajanje vrlo finih suspenzija. Kod centrifugiranja se koriste sile do 10 000
puta veće od sile gravitacije, a kod ultracentrifuga i do 600 000 puta veće.

Upotreba:
-kada se iz koncentrisanih suspenzija izdvaja čvrsta supstanca ili
se iz emulzije izdvaja disperzna faza od disperznog sredstva

• bubanj se okreće velikom brzinom na horizontalnoj ili vertikalnoj osovini

 Centrifugiranje

Brzina kretanja čestica je u funkciji rezultanti sila koje ubrzavaju i koje

usporavajukretanje čestica u datom sistemu.
Sila koja ubrzava kretanje čestica je centrifugalna Fc, dok su sile koje
usporavaju kretanje čestica sila potiska i sila unutrašnjeg trenja.