Línea profundización diversidad de

los recursos zoogenéticos

David Fernando Parra Ramirez
Sebastián Prieto Moreno
El descubrimiento y desarrollo del sistema CRISPR
en aplicaciones de manipulación genómica
Antecedentes

• 1987, secuenciación del gen IAP en Escherichia coli para

identificar proteínas codificadas por el gen.
• Identificacion de 5 secuencias idénticas de 29 nucleótidos
separados por 32 secuencias espaciadoras no repetidas.
• Descubrimiento de matrices CRISPR en bacterias y arqueas, pero
no en eucariotas o virus.
• “Repeticiones Palindromicas Cortas Agrupadas y Regularmente
Interespaciadas” nombre dado por Jansen en 2002.
• Identificación de genes cas1, cas2, cas3 y cas4, presentan
homología a la familia de exonucleasas RecB
Mecanismo del CRISPR

• Tres fases:
• Fase de adaptación: las enzimas asociadas a CRISPR adquieren los prospacer
del ADN exógeno y lo integran al locus CRISPR dentro del genoma
procariota, seguido de la síntesis de una nueva repetición. Esta fase otorga
memoria genética.
• Fase de expresión: se transcribe la secuencia de repeticiones-spacer (locus
CRISPR) y, luego las Cas lo separa en pequeños fragmentos (crRNA), cada
tipo de CRISPR actúa de forma distinta para generar estos fragmentos.
• Fase de interferencia: el crRNA guía a la maquinaria del DNA
complementario que está por la secuencia PAM para que corte el DNA
exógeno en una zona concreta, cada tipo de CRISPR efectua el corte con un
complejo distinto.
Clasificación del sistema CRISPR-Cas

• Existen tres tipos de sistemas CRISPR-Cas: (I, II, y III), estos

pueden coexistir en un mismo organismo.
• Tipo I: reconocido por la presencia de Cas3, una proteína con dominios
helicasa y Dnasa (degradación); 6 subtipos (I-A al I-F) utilizan un complejo
de cascada, se une al crRNA y localiza el objetivo.
• Tipo II: el trans-activador (tracrRNA) madura el crRNA, ambos guían al Cas9
(endonucleasa) al punto de corte especifico.
• Tipo III: se asocia con la proteína Cas10.
Lo mas significativo es que los tipos I y III,
utilizan endonucleasas Cas especializadas
para procesar el pre-crRNA, y luego el
crRNA maduro se asocia a un complejo
multi-Cas, el cual reconoce y cortará en
DNA exógeno.
En el tipo II la maduración del crRNA se
produce por tracRNA y solo necesita Cas9
para el corte del DNA objetivo
 Interacción con la epigenética

• No sirven testear el rol especifico ni alterar el

estado epigenético.
• Cas9  Acetiltransferasa + dCas9 + núcelo
catalíco de la Acttrnsfrsa.
• Cataliza la acetilación de la lisina 27 de la
histona H3 en los sitios diana
• Promotores y potenciadores próximos y distales

• Controla la expresión pero es difícil determinar

el momento de metilación específico.
Descubrimiento y desarrollo de
medicamentos
• Facilidad y rapidez con la que permite la • Uso de tejidos sanos y afectados
alteración genómica

• Clones mutantes o Knockout a través de

• Medicina poblacional – medicina recombinaciones homólogas.
personalizada

• alto costo y tiempo

• Variaciones y efectos adversos  deben ser

testeados en modelos precisos
• CRISPR-Cas permite generación de clones
ko isogénicas de manera mas sencilla
 Screening funcional

• Los screen genéticos son útiles para estudiar enfermedades o fenotipos para los cuales la causa genética
que los produce no se conoce.

• El objetivo es generar una población de células con mutaciones variables en genes y poder identificar las
perturbaciones que expresan el fenotipo deseado.

• El sistema mas utilizado es un pool que consiste en una población heterogenea que contiene un sgRNA dirigido
a un organismo de estudio específico
sgARNs se diseñan in silico y se clonan, cada librería contiene de 3
a 6 sgARN para asegurar que cumpla la modificación diana

Cuentan con una secuencia única con todo el genoma

Selección positiva: se realiza una selección de tal manera que las

Células sin alteraciones relevantes permanezcan.

Están diseñados para identificar las perturbaciones que dan

Resistencia a un fármaco, toxina o patógeno.

Transducidas con mutación protectora, sobreviven y proliferan

Selección negativa: identifica las células que mueren durante la

Selección
 Terápia génica

Una de las principales aplicaciones de la técnica es en tecnología terapéutica

asociados a desórdenes genéticos

Trastornos monogénicos recesivo debido a pérdida de función, Cas9 es capaz de

corregir la mutación (fibrosis q. anemia falciforme dis. Muscular de Duchenne

Modoficaciones de células somáticas intoduciendo mutaciones protectoras contra

enfermedades no genéticas o complejas.
 Conclusiones

• A pesar de llevar poco tiempo en investigación se han logrado grandes avances

en la mayoría de campos abriendo puertas a la edición genética para mejorar
las condiciones socio-culturales del planeta.

• Creación de ténicas para investigación y corrección de enfermedades como

cáncer, enfermedades neurológicas y cardíacas y diseño de nuevos fármacos.

• Reducción de tiempo y costo para implementación de descubrimientos.

• Promete ser una herramienta en producción de tejidos sintéticos u orgános

para xenotransplantes
¡GRACIAS!