Transkripcija i RNK

procesiranje

Chapter 21 1
Tok biološke informacije

Chapter 21 2
Vrste RNK molekula
(1) Glasnička -Transfer RNK (tRNA)
• Prenosi aminokisenline do translacijske
mašinerije
• Vrlo stabilna molekula
(2) Ribosomalna RNA (rRNA)
• Izgrađuje većinu ribosoma
• Vrlo stabilna, čini većinu stanične RNK
(3) Informacijska -Messenger RNA (mRNA)
• Prenosi poruku sa DNA na ribosomu
• Brzo degradira djelovanjem nukleaza
Chapter 21 3
 RNK polimeraza

• RNK polimeraza (RNA pol) katalizira DNA-

usmjerenu RNK sintezu (transkripciju)
• RNA pol čini srž velikog transkripcijskog
kompleksa
• Kompleks se udružuje na jednom kraju gena of a
gene when transcription is initiated
• DNK se kontinuirano odmotava kako RNK pol
katalzira elongaciju (produžavanje) RNK lanca

Chapter 21 4
A. RNK polimeraza je oligomerni protein
• Srž enzima: a2ββ’ω sudjeluje u većini reakcija tijekom
transkripcije.
• β podjedinica udružuju enzim i prepoznaju regulatorne
faktore.
• β’ podjedinica doprinosi vezanju za DNK (nespecifično)
• α (2) podjedinice čine skelu (scaffolding) i u interakciji
je sa drugim proteinima u regulaciji transkripcije
• ω obnavlja denaturiranu RNK polimerazu do njene
funkcionalne forme in vitro. Ima protektivnu/šaperon
ulogu za β' podjedinicu kod Mycobacterium smegmatis.
Doprinosi udruživanju.
• σ podjedinica ima ulogu u inicijaciji transkripcije.
Chapter 21 5
Struktura srži RNK pol kodThermus aquaticus

Chapter 21 6
 B. Reakcija produžavanja lanca

• Mehanizam je uglavnom identičan kao kod

DNK polimeraza.
• Rastući RNK lanac je odgovarajući (base-
paired) DNK template lancu.
• Dolazeći ribonukleotid trifosfat (RTPs)
formira ispravne vodikove veze sa templatom.
• Formira se nova fosfodiesterska veza uz
oslobađanje PPi.
Chapter 21 7
 Reakcija RNK polimerazom
• Katalizira polimerizaciju u pravcu 5’  3’
• Visoko procesivna i termodinamički podržana
PPi hidrolizom
• Dolazeći RTPs: UTP, GTP, ATP, CTP
• Rastuća jednolančana RNK se otpušta
• Dodaje 30-85 nukleotida/sec (~ 1/10
učinkovitosti DNK replikacije)

Chapter 21 8
• RNA
polymerase
reaction

Chapter 21 9
(nastavak)

Chapter 21 10
Inicijacija (započinjanje ) transkripcije

• Transkripcijski kompleks se udružuje na

mjestu početka transkripcije (DNK
promotorska regija)
• Kratki odsječak RNK se sintetizira
• Operon: transkripcijska jedinica gdje se
nekoliko gena kotranskribira kod prokariota
• Eukariotski geni – svaki ima svoj vlastiti
promotor
Chapter 21 11
Transkripcija E. coli
ribosomskih RNA gena

Chapter 21 12
 A. Geni imaju orijentaciju 5’ 3’

• Pravilo za dvolančanu DNK:

Coding strand (vrh) se piše: 5’ 3’
Template strand (dno) se piše: 3’  5’
• Geni se transcribiraju u pravcu 5’  3’
• Template strand DNA se kopira u pravcu
3’  5’
• Rastući RNK lanac napreduje u pravcu 5’ 3’

Chapter 21 13
Orijentacija gena

Chapter 21 14
 B. Transkripcijski kompleks se
udružuje s promotorom
• Konsenzus sekvenca je nađena uzvodno od
mjesta početka transkripcije.
• DNK-vežući proteini vezuju se na sekvencu
promotora (prokarioti i eukarioti) i usmjeravaju
RNA pol do promotorskog mjesta.
• σ podjedinica prokariotske RNK polimeraze je
neophodna za prepoznavanje promotora i
stvaranje kompleksa.

Chapter 21 15
Sekvenca promotora iz 10 bakteriofagnih
i bakterijskih gena

Chapter 21 16
 E. coli promotor
(1) TATA box (-10 bp uzvodno od mjesta početka
transkripcije (regija bogata A/T bp)
(2) -35 region (-35 bp uzvodno) od mjesta početka
transkripcije
• s podjedinica je potrebna (npr. s70)
• Jaki promotori se tijesno podudaraju sa konsenzus
sekvencom (operoni se transkribiraju efikasno)
• Slabi promotori se slabo podudaraju sa konsenzus
sekvencom (operoni se transkribiraju nerijetko)

Chapter 21 17
C. σ podjedinica prepoznaje promotor

• σ podjedinica povećava afinitet srži polimeraze

za specifičnu promotorsku sekvencu.
• σ podjedinica također snižava afinitet srži
polimeraze za nepromotorske regije.
• Srž polimeraze (ne σ podjedinica) vezuje DNK
nespecifično

Chapter 21 18
Table 21.3

Chapter 21 19
D. RNK polimeraza mijenja konformaciju

• Unwinding of DNA at the initiation site

requires a conformational change
• RNA pol (R) i promotor (P) se pomiču od:
(RPc) zatvoren kompleks (dvolančana DNK)

(RPo) otvoreni kompleks (18 bp DNK odmotana)

(formira se transkripcijski mjehurić)
Chapter 21 20
 Inicijacija transkripcije
u E. coli

Chapter 21 21
(nastavak)

Chapter 21 22
 NusA protein pomaže konvertiranju
RNA polimeraze u elongacijsku formu.

 Elongacijski kompleks je odgovoran za

većinu sinteze RNK.

Chapter 21 23
Terminacija transkripcije

• Samo se određeni dijelovi DNK prepisuju

• Transkripcijski kompleksi se udružuju sa
promotorom i odvajaju na 3’ kraju gena na
specifičnoj terminacijskog sekvenci
• Dva tipa terminacijskih sljedova:
(1) Nestabilni elongacijski kompleks
(2) Rho-ovisna terminacija

Chapter 21 24
 Mjesta pauze
• Pause sites – regije na genu gdje stopa
elongacije pada (10 do 100-puta) ili se
privremeno zaustavlja
• Terminacija transkripcije često se događa
tamo gdje su:
• G-C bogate regije je teže odvojiti nego A-T
bogate regije i mogu biti mjesta
zaustavljanja transkripcije
• Zaustavljanje se također događa kada
novotranskribirana RNK formira ukosnicu.
Chapter 21 25
Stvaranje ukosnice “hairpin”
na RNK molekuli

Chapter 21 26
 Rho-ovisna terminacijska mjesta

• Rho je okidač za razdruživanje

transkripcijskog kompleksa na mjestima
pauze.
• Rho se vezuje za ssRNA lanac, destabilizira
RNA-DNA hibrid i zaustavlja transkripciju.

Chapter 21 27
• Rho-ovisna
terminacija
transkripcije (E.
coli).
• RNA pol je stala
na mjestu pauze.
• Rho vezuje novu
RNA,
destabilizirajući
RNA-DNA hibrid.

Chapter 21 28
 Transkripcija kod eukariota

A. Eukariotske RNK polimeraze

• Tri različite RNK polimeraze prepisuju

jezgrine gene
• Druge RNK polimeraze nađene su u
mitohondrijima i kloroplastima

Chapter 21 29
Chapter 21 30
RNA polimeraza II iz
kvasca S. cerevisiae

Chapter 21 31
 B. Eukariotski transkripcijski faktori

• Ista reakcija kao kod prokariotske

transkripcije.
• Kompliciranija mašinerija udruživanja.
• Vezanje RNK polimeraze za promotor
zahtijeva brojne inicijacijske
transkripcijske faktore (TFs).

Chapter 21 32
 Moran et al 2006
Chapter 21 33
 RNA polimeraza II
• Transkribiraju se svi protein-kodirajući geni i
neki mali geni za RNK.
• Protein-kodirajuću RNK sintetiziranu RNK pol
II nazivamo mRNA prekursor (ili hnRNK)
• 20%-40% ukupne stanične RNK sinteze
• Generalni transkripcijski faktori su u
direktnoj interakciji sa RNA pol II i
kontroliraju početak transktripcije klase II
gena
Chapter 21 34
A. thaliana TATA-vežući protein
(TBP) (plavo) vezan za DNK

Chapter 21 35
RNA polimerase II holoenzimski
kompleks vezuje se za promotor

Chapter 21 36
 Regulacija transkripcije gena
• Ekspresija housekeeping gena je konstitutivna.
• Ovi geni obično imaju jake promotore koji se
nerestano i efikasno transkribiraju.
• Housekeeping geni čiji su produkti dovoljni na
niskom nivou imaju slabe promotore i
transkribiraju se povremeno.
• Regulatorni geni se ekprimiraju u različitom
nivou pod različitim uvjetima.
Chapter 21 37
 iRNK procesiranje kod eukariota

• Kod prokariota mRNA transkript se

translatira dirketno.
• Kod eukariota transkripcija se događa u
jezgri, translacija u citoplazmi.
• Eukariotske mRNA se procesiraju u
jezgribez interferiranja sa translacijom.
• Kod nekih mRNA, uklanjaju se introni a
egzoni potom udružuju (splicing).
Chapter 21 38
A. Eukariotske mRNA molekule
imaju modificirane krajeve
• Svi eukariotski mRNA prekursori podliježu
modifikacijama koje doprinose povećanju
stabilnbosti i čine ih boljim supstratom za
translaciju.
• Krajevi su modificirani te su neko vrijeme
zaštićeni od degradacije nukleazama.
• 5’ krajevi se modificiraju prije nego je
mRNA prekursor kompletno sintetiziran.
Chapter 21 39
 (nastavak)

• Gvanilatna baza je m
etilirana na N-7, Step
(3)
• 2- Hidroksilne grupe
posljednje dvije
riboze može također
biti metilirana, Step
(4)

Chapter 21 40
Poli A repovi na 3’ krajevima mRNA
prekursora
• Eukariotski mRNA prekursorsi su također
modificirani na 3’ krajevima.
• Poly A polimeraza dodaje do 250 adenilatnih
ostataka na 3’ kraj mRNA prekursora.
• poly A tail se progresivno skraćuje na 3’
kraju djelovanjem egzonukleaza.
• Poly A tail povećava vrijeme potrebno za
djelovanje nuklaza na kodirajuću regiju.
Chapter 21 41
Poliadenilacija mRNA prekursora

Chapter 21 42
(nastavak)

Chapter 21 43