UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE

OAXACA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LIC. QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

MICROBIOLOGÍA GENERAL

FEB.2015
EXAMEN DE PREPARACIONES
COLOREADAS
Las técnicas de coloración permiten la
observación morfológica con un mejor
contraste que en el examen en fresco, así como
la observación de estructuras celulares. El
examen microscópico de preparaciones teñidas
tiene una serie de pasos comunes previos a la
tinción, que son:
PREPARACIÓN DEL FROTIS:
- La extensión del material sobre el portaobjetos
se hará de diferentes formas, en función de la
procedencia del producto a examinar. Si el
producto es líquido, se depositará una pequeña
(muy pequeña) cantidad de material en el
centro del porta, extendiéndolo con el asa
hasta conseguir una capa fina y homogénea.
- Si la extensión debe hacerse a partir de un
cultivo en medio sólido, la colonia que
vayamos a estudiar se mezclará con una gotita
de agua destilada estéril colocada en el centro
del porta. Conviene recordar que no es
necesario depositar una gran cantidad de
producto, pues se dificultaría la visualización,
y que un exceso de agua solo contribuye a
aumentar el tiempo en secar la preparación.
-
Por último, si el producto se ha recogido con
una torunda (exudados) debe extenderse
directamente sobre el portaobjetos,
procurando que el algodón "ruede", en vez de
"frotar" el porta; de esta manera se consigue
preservar mejor los elementos celulares que
pudiesen acompañar a las bacterias, a la vez
que se conserva la agrupación de éstas, en caso
de que las hubiere.
SECADO
- Una vez efectuada la extensión del frotis
debemos dejar secar al aire la preparación.
- Cuando la preparación está seca la superficie del
frotis pasa de ser brillante a mate.
- El secado se puede acelerar calentando
ligeramente la parte inferior del porta (sin
quemar).
FIJADO
El último paso antes de proceder a la tinción es
la fijación de la preparación al portaobjetos,
mediante la coagulación rápida de las
albúminas citoplasmáticas. Con esto
conseguimos que el producto adherido al
portaobjetos no sea eliminado, ni vea alteradas
sus características morfológicas y estructurales
en los procedimientos de tinción posteriores.
 La fijación puede hacerse por calor suave, pasando el
porta sobre una llama o mediante la utilización de
placas calefactoras especiales a 37ºC.
Tras la fijación por calor es muy importante esperar a
que la preparación se enfríe antes de proceder a
realizar cualquier procedimiento de tinción.
Si el material que vamos a teñir puede poseer
abundante material celular (leucocitos, células
epiteliales, etc.) que conviene visualizar también, es
preferible recurrir al alcohol metílico para fijar la
preparación
Una vez cubierta de alcohol la preparación, se deja
actuar durante un minuto, eliminando después el
exceso y dejando secar a temperatura ambiente.
TINCIONES
 Son técnicas que permiten observar
microorganismos en función de la capacidad de
los mismos para retener o no determinadas
sustancias colorantes, lo que depende de la
carga de la célula y del colorante
LOS COLORANTES PUEDEN SER DE
DISTINTOS TIPOS
 Catiónicos. Son sustancias que tienen carga
positiva. Penetran en el interior de las células y
las tiñen. Ejemplos: azul de metileno, cristal
violeta, safranina.
 Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en
el interior celular, de modo que no tiñen las
células, sino el entorno. En este caso se habla de
tinción negativa. Ejemplos: eosina, nigrosina.
 Liposolubles. Se mezclan con los lípidos
celulares y los tiñen. Ejemplo: negro sudán.
TINCION SIMPLE
 Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido
de los microorganismos aplicando sólo una solución
colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o
negativas
 La coloración positiva es la tinción de los
microorganismos, efectuada con colorantes básicos
que, poseen afinidad por los constituyentes celulares y
se combinan químicamente con el citoplasma
microbiano.
 La coloración negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de los microorganismos en
microscopía óptica, pero su máxima utilidad está en
revelar estructuras como cápsulas  tanto bacterianas
como de levaduras, esporas que se observan como
cuerpos refringentes y espiroquetas  que, por su
pequeño diámetro transversal, resulta difícil ponerlas
en evidencia.
TÉCNICA TINCIÓN SIMPLE
1.- Empezamos por colocar una pequeña gota de suero
salino o de agua destilada en un portaobjetos
2.- Esterilizar el asa, poniéndola al rojo en la llama del
mechero Bunsen.
3.- Tomar con el asa una pequeña porción de la colonia
a analizar.
4.- Emulsionar la porción tomada con la gota de
líquido del porta y extender con el asa.
5.- Secar en la llama del mechero Bunsen, pero sin
calentar demasiado para no estropear la muestra.
6.- Fijar la extensión pasando un par de veces por la llama
rápidamente. Así disminuye la probabilidad de que las
bacterias sean arrastradas por los líquidos que se agregan
para teñir.
7.- Colocar el porta con la extensión fijada y FRIA, en
un puente de tinción para añadir el colorante.
8.- Aplicar el colorante, en este caso violeta de genciana,
hasta que toda la extensión quede cubierta

- Azul de metileno
- Cristal violeta
- Fucsina
9.- Dejar actuar el colorante 1 MINUTO!!!
10.- A continuación lavar con agua destilada para
eliminar el exceso de colorante. El chorro de agua
debe ser suave para no arrastrar toda la extensión.
11.- Una vez lavada, secar con papel de filtro para
eliminar el exceso de agua
12.- Ya se tiene la muestra teñida y preparada
para observarla en el microscópio
13.- Mediante esta técnica, se pueden observar
características morfológicas de bacterias y otras
células, pues son más fácilmente visibles después
de teñir
 TINCIÓN
DIFERENCIALES
TINCIONES DIFERENCIALES.
 Se basan en el hecho de que distintos tipos de
células tienen distinta composición química, y
por lo tanto reaccionan de forma diferente
frente a una tinción, lo que permite clasificar
los microorganismos en diferentes grupos,
según su capacidad de tinción
TINCIÓN DE GRAM
 Fue desarrollada empíricamente por Christian
Gram en 1884.
 La técnica es capaz de diferenciar dos grandes
grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram
negativas
FUNDAMENTO
La diferenciación entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas
se establece en la naturaleza y características de la pared celular
bacteriana.

Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano

que es capaz de retener al complejo colorante-mordiente (cristal violeta-
yodo). Durante la decoloración con alcohol acetona se provoca una
deshidratación de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando
entonces al complejo en el interior de la célula.

Las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de

peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante-
mordiente (cristal violeta-yodo) y es entonces fácilmente teñida por el
colorante secundario o de contraste.
PROCEDIMIENTO

 1. Extensión de la muestra (Escherichia y Bacillus).

 2. Fijación.
Métodos físicos: acción del calor
Métodos químicos: metanol

 3. Cristal violeta 1-2 minutos.

 4. Tirar el exceso de colorante (¡NO lavar con agua!).
 5. Añadir lugol, esperar 1 minuto y tirar el exceso (¡No lavar con
agua!)
 6. Decolorar con etanol-acetona (20 segundos)
 7. Lavar con agua.
 8. Añadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto.
 9. Lavar con agua.
 10. Secar.
 11. Observar (100×).
RESULTADOS:

Bacterias Gram positivas: se verán de color violeta

o azul intenso.
Bacterias Gram negativas: se observarán de color
rojo.
OBSERVACIONES:

El lugol se utiliza como mordiente (no como

colorante), para favorecer la retención del
cristal violeta
por parte de las bacterias Gram positivas.
Los cultivos viejos (más de 24 horas) pueden
hacerse más sensibles a la decoloración,
pudiendo
aparecer como Gram negativas bacterias que no
lo son
Escherichia coli
Clostridium_perfringens
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
 Desarrollada inicalmente por Paul Ehrlich para
poner de manifiesto la presencia de los bacilos
causantes de tuberculosois en muestras clínicas
de pacientes.
FUNDAMENTO
 Las paredes celulares de ciertos parásitos y
bacterias. contienen ácidos grasos (ácidos
micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de
carbono) que les confieren la propiedad de
resistir la decoloracíón con alcohol-ácido,
después de la tinción con colorantes básicos.
Por esto se denominan ácido-alcohol
resistentes. Las micobacterias como M.
tuberculosis y M. marinum y los parásitos
coccídeos como Cryptosporidium se
caracterizan por sus propiedades de ácido-
alcohol resistencia.
 La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la
pared bacteriana que contiene ceras. Al
suspender el calentamiento y enfriar con agua,
provoca una nueva solidificación de lo ácidos
grasos de modo que el colorante ya no puede
salir de las bacterias. Por otro lado, el
calentamiento aumenta la energía cinética de
las moléculas del colorante lo cual también
facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias
que resisten la decoloración son de color rojo y
la que no se ven de color azul.
PROCEDIMIENTO
. 1) Hacer un frotis
2) Secar al aire y fijar por calor
3) Cubrir todo el porta-objetos con fucsina fenicada
4) Calentar suavemente con el mechero hasta la emisión de
vapores.
5) El colorante no debe secarse ni hervir, añadir más si es
necesario.
6) Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos.
7) Lavar con un chorro suave de agua.
8) Decolorar con alcohol ácido
9) Lavar con agua
10) Cubrir el frotis con azul de metileno y dejarlo actuar durante
un minuto.
11) Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire Observar al
microscopio con el objetivo de inmersión
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
TINCION DE TAN-THIAM-HOK
Esta coloración permite una tinción más rápida
que el clásico procedimiento de Ziehl-Neelsen y
evita
la necesidad de calentamiento.
El resultado es el mismo que en la tinción
anterior, observándose los microorganismos
ácido alcohol
resistentes de color rojo
 TINCIONES
ESTRUCTURALES
Tinción de esporas
Se realizan para poner de manifiesto las formas de
resistencia de las bacterias (esporas) y su localización
en la célula.
Suelen utilizarse colorantes muy concentrados y tinción
forzada por calentamiento hasta emisión de vapores.
Uno de los métodos más utilizados es el método de
Wirtz o del verde de malaquita, que consiste en la
utilización de este colorante en caliente y posterior
utilización de fucsina diluida como contracolorante.
Tras la tinción las esporas, si existen, se observan de
color verde, mientras que las formas vegetativas
aparecen de color rojo
TINCIÓN DE FLAGELOS

La observación de flagelos en preparaciones

teñidas es muy difícil, debido a que se retraen
con mucha facilidad y se adhieren a la pared
celular.
Se deben utilizar cultivos jóvenes (de menos de
24 horas), sembrados en agar semisólido,
empleándose técnicas que engruesan los
flagelos para facilitar su observacion
Tras la realización de la delicada técnica (extensión por
inclinación -sin asa-, secado sin calor, fijación con
vapores de óxido de osmio) los flagelos aparecen
visibles al microscopio debido al precipitado de plata
formado a su alrededor.
TINCIÓN DE CÁPSULAS

La cápsula es una capa gelatinosa, de espesor variable,

situada alrededor de la pared celular
bacteriana. Como es difícil teñirlas, se consiguen mejores
resultados utilizando métodos que, coloreando el
fondo de la preparación y el microorganismo, hacen resaltar
las cápsulas sin teñir.
El método más utilizado es el de Burri o de la tinta china, en
el que se tiñen primero los
microorganismos con fucsina diluida y posteriormente se
cubre la preparación con tinta china.
Tras el procedimiento de tinción, se observan sobre un
fondo negro los microorganismos teñidos de
rojo y la cápsula como un halo blanco que los rodea
TINCIÓN DE CORPÚSCULOS
METACROMÁTICOS:

Los corpúsculos metacromáticos son gránulos de

reserva de fosfato del microorganismo, que al
teñirlos dan el color complementario al
colorante utilizado. Solo aparecen en el género
Corynebacterium.
Se utilizan varios métodos para su visualización
(Neisser, Loeffler y Albert), dependiendo el
resultado final del método utilizado.
TINCIÓN NEGATIVA
TINCIÓN NEGATIVA
 Algunas bacterias presentan una capa externa a
la pared denominada cápsula. Está compuesta
de azúcares y proteínas. No es una estructura
vital para la bacteria, de modo que es posible
que bajo determinadas condiciones
ambientales o del propio desarrollo genere
cápsula y bajo otras no lo haga. Se ha
comprobado que la presencia de cápsula
dificulta de algún modo la fagocitosis de las
bacterias, es decir las cápsulas constituyen un
factor de virulencia de los microorganismos.
 La tinción de cápsula se denomina tinción
negativa porque tiñe el fondo de la preparación
y no el microorganismo. Desde el punto de vista
formal no es una tinción propiamente dicha,
porque no fija los microorganismos. Se parece
más a una preparación en fresco. Su realización
es sencillísima, consiste en colocar la muestra
húmeda sobre el porta objetos y mezclarla con
tinta china. La tinta cubre toda la preparación a
excepción de las cápsulas. En el microscopio se
observa el fondo negro y los microorganismos
con cápsula sin color.
Método de la tinta china para cápsula

1.-En el centro de un portaobjetos se coloca una

gota de agua, otra de tinta china y un poco del
cultivo de una cepa capsulada. Se mezcla
suavemente sin extender.
2.-Se coloca un cubreobjetos sobre la suspensión y
se presiona suavemente evitando que queden
burbujas.
3.-Observar inmediatamente al microscopio.
4.-Desechar la preparación en un recipiente con
antiséptico.

La cápsula se observa como una gran estructura

alrededor de la célula delimitada por los pequeños
fragmentos de carbón de la tinta china.
 bacteriofago

bacillus
Helicobacter pylori
TINCION ESPECIALES
 Tinción de auramina –rodamina
Estos dos fluorocromos se fijan selectivamente
sobre el ácido micólico de la pared celular de las
micobacterias, por lo que la investigación de éstas
es su principal aplicación.
Tras la tinción, los microorganismos aparecen
como puntos amarillos o amarillo-verdosos
brillantes
sobre fondo negro.
Es una tinción equivalente a la de Ziehl-Neelsen,
aunque mucho más sensible y específica
TINCIÓN DE NARANJA DE ACRIDINA
Se basa en la tinción selectiva y diferencial de los
ácidos nucleicos por parte del fluorocromo
naranja de acridina. Se utiliza en la
investigación de muestras con escaso número
de microorganismos. Tras la tinción, los
microorganismos se observan con un color
rojo-anaranjado, mientras que otras células o
restos de tejidos presentes en la muestra
aparecen con una fluorescencia amarillo-
verdosa.
BLANCO DE CALCOFLÚOR
 Las paredes celulares de los hongos fijan el
colorante blanco de calcoflúor aumentando
considerablemente su visibilidad en los tejidos y
otras muestras. Según fue descrito por Hageage y
Harrington, este colorante se emplea en lugar de
KOH al 10% para el examen inicial de los
materiales clínicos. También se emplea para
aumentar la visualización de los elementos
morfológicos de los cultivos puros de los hongos.
En algunos laboratoríos ha suplantado al azul de
lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos
fluorescen con luz blanco-azulada o verde
manzana, según la fuente luminosa que se utilice.
GRACIAS…..