ANALIZE DREVNE DNK

Jelena Jovanović
Božana Kardaš
 ŠTA JE DNK?
- molekularno genetičke analize DNK
izolovane iz drevnih ostataka predstavljaju
novu oblast istraživanja
- ogroman potencijal u pružanju odgovora na
neka od ključnih pitanja o prošlosti ljudskog
roda
- izolacijom drevne DNK omogućeno je
izučavanje molekula koji leže u osnovi
evolucije živog sveta, u praktično
neograničenoj vremenskoj skali
- Dezoksiribonukleinska
kiselina ( skraćeno DNK) je
nukleinska kiselina koja
sadrži uputstva za razvoj i
pravilno funkcionisanje svih
živih organizama

- DNK izolovana iz drevnih

uzoraka označava se
terminom drevna DNK
(dDNK)
- DNK je dugačak polimer sastavljen od manjih
jedinica koje se nazivaju nukleotidi. Međusobno
povezani nukleotidi čine skeleton DNK molekula,
koji je sagrađen od šećera i fosfatnih grupa.
Ovaj skeleton se takođe sadrži i od četiri različita
molekula, baza i sekvenca, a redosled ovih baza
je ono što kodira genetski materijal.
- U živim organizmima, DNK molekul je sastavljen
od dva polinukleotidna lanca koji su spiralno
uvijeni jedan oko drugog. U DNK molekulu
postoje četiri međusobno komplementarne baze:
adenin (A), citozin (C), guanin (G) i timin (T).
- mitohondrijalna DNK (mtDNK) sisara se
nasleđuje preko majčine linije
- izolovanje mtDNK je više verovatno nego
pronalaženje DNK iz nukleusa
- analiza mikrosatelitskih ili STR lokusa (engl.:
“Short Tandem Repeat“) primenljiva je u
humanoj identifikaciji, rekonstruisanju
geneoloških stabala, populacionoj genetici,
analizama vezanosti itd.
- Analize Y vezanih STR lokusa primenljive su u
praćenju migracija i genetičke srodnosti
populacija
 Istorijat istraživanja

- Kineska princeza iz Mawangtui-ja

- 1984. dDNK iz kože zebre
- 1985. dDNK iz egipatske mumije
- Kraj ’80-ih godina XX veka razvijen metod PCR
- 1990. god. dDNK iz čvrstih tkiva
 Stanje očuvanosti drevne DNK

- prirodna mumifikacija
- veštačka mumifikacija
 Grob,Lepenski Vir

Ledena mumija sa
Alpa
različiti materijali za
uzorkovanje
 Uzimanje uzoraka

- U idealnim uslovima, uzorci bi trebalo da budu

sveže iskopani i neoprani
- Prilikom proučavanja ljudskih kostiju poželjno je
radi provere kontaminacije uzeti i nekoliko
uzoraka životinjskih kostiju iz istog arheološkog
sloja odnosno konteksta
- Rad sa drevnom DNK nosi veliki rizik od
kontaminacije uzoraka savremenom DNK
 čišćenje uzorka

uzimanje uzorka
- Mere predostrožnosti da do kontaminacije ne dođe:
• koristiti sterilne instrumente u toku obrade kostiju
• pre mlevenja treba skinuti površinski sloj kostiju (1-
2mm) i nakon toga kosti izložiti UV svetlu oko 30 min
• koristiti sterilne nastavke za pipete sa barijerom ,
sterilne epruvete za jednokratnu upotrebu, sterilne
reagense i rastvore namenjene samo za rad s drevnom
DNK
• sve rastvore koji se koriste sterilisati filter sterilizacijom
i autoklaviranjem, a nakon toga izložiti UV svetlu
najmanje 30 min
• uvek koristiti sterilne rukavice i što češće ih prati
• uvek raditi negativnu, slepu i kontrolu bez DNK pri PCR
amplifikaciji
 Izvlačenje DNK

- Ovaj proces služi da se oslobode nukleinske

kiseline iz ćelija u rastvor. Koriste se Tris-HCl i
EDTA (etilendiaminotetraacetat) da se razbiju
ćelijske membrane uz jone kalcijuma koji
stabilišu DNK, natrijumova ili kalijumova so za
stvaranje izotopske sredine koja će stabilisati
slobodne nukleinske kiseline, proteinaza K za
rastvaranje proteinskog dela
-RFLP (restriction fragment length polymorphism)
analizom se seče lanac DNK-a pomoću
restriktivnih enzima u kraće fragmente koji se
lakše razdvajaju prilikom elektroforeze u želatinu
od agaroze
-uzorak se stavlja na membranu i snimi
rendgenskim filmom
-dobijeni DNK profil se zatim klonira
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
- PCR je molekularno genetička tehnika kojom je
moguće umnožiti odeđeni segment DNK više od
milijardu puta
- dovoljna je minimalna količina drevnog materijala
za izolaciju dDNK
Determinacija pola

- upotrebom molekularno bioloških metoda

moguće je utvrditi pol individue, bez obzira
na njenu arheološku starost

- primeri: lokalitet Aškelon

Prisustvo patogenih
mikroogranizama
- moguće detektovati bolesti koje ne
ostavljaju tragove na kostima, kao što
su na primer malarija, kuga i kolera
Egipatska mumija i TBC
“Huanita”
Populacione
analize
- primeri:

1)Neandertalci

2)stanovnici
Pirinejskog
poluostrva
Srodničke veze
- primer: Romanovi
primer: Pompeja
Analize dDNK iz
životinjskih ostataka

- ostaci riba sa lokaliteta

Sagalasos
Grčki manuskripti na
pergamentu
-nalazi parazita u koprolitima
-Beringov moreuz kao “genetski muzej
ledenog doba”
 Ostaci dDNK iz biljnih ostataka

- razlike između divljih i domestikovanih vrsta

- geografsko poreklo
Analize dDNK na našim prostorima
- U Srbiji je tokom 1999. i 2000. godine urađena
komparativna analiza DNK iz kostiju humanog porekla
sa 5 različitih arheoloških lokaliteta. Za izolovanje i
analizu drevne DNK korišćeni su uzorci rebara
skeletnih ostataka sa arheoloških lokaliteta: 34 uzorka
sa mezolitsko-neolitskog lokaliteta Lepenski Vir, 25
uzoraka sa neolitske nekropole Gomolava, 31 uzorak
sa srednjovekovne nekropole Gomolava, 21 uzorak sa
srednjovekovne nekropole Horgoš-Crkvine i 1 uzorak
sa srednjovekovne nekropole Perlez Svete Vodice
 Lepenski Vir

- od 34 infanata sa ovog lokaliteta, 22 pripada

muškom, a 12 ženskom polu
 Gomolava

- neolit: svih 25 individua pripadaju muškom polu

- srednji vek: 16 individua pripadalo je muškom

polu a 15 ženskom
Horgoš-Crkvine

- 8 skeletnih individua dečjeg uzrasta bilo 5

individua muškog i 3 individue ženskog pola

Perlez-Svete vodice

- skelet muške individue

 Beogradska mumija

- potvrđen pol mumificirane osobe