Uvod u tečnu

hromatografiju
Tečna hromatografija, odnosno tečna hromatografija
visoke efikasnosti (High performance Liquid
Chromarography – HPLC ) je tehnika koja se
primenjuje tek dvadesetak godina.
Pogodna je za analizu termolabilnih jedinjenja jer se
HPLC tehnika izvodi na sobnoj temperaturi.
Ovom metodom polarna jedinjenja, mogu da se
analiziraju direktno.
Naročito je pogodna za rad termički nestabilnih i
biološki aktivnih jedinjenja, kao i supstanci koje se
degradiraju prilikom uparavanja, ali i za teško
isparljiva jedinjenja.
HPLC metod se koristi za hromatografiju veoma
različitih jedinjenja čija se relativna molekulska
masa kreće od nekoliko desetina do nekoliko
miliona.

Ovom tehnikom se mogu odrediti amino kiseline,

ugljeni hidrati, vitamini, antibiotici, mikotoksini.

Razlog za univerzalnu upotrebu HPLC metode je

i taj, što HPLC sistem pogodnom kombinacijom
hromatografskog materijala i mobilnih faza
omogućava izvođenje različitih tipova tečne
hromatografije.
 Tečna hromatografija se sastoji iz:
• Nepokretna faze (čvrste) - supstanca sa
velikom adsorpcionom površinom koja se
nalazi u šupljim metalnim cevima (4,5 cm,
dužine od 10 -25 cm)
• Mobilne faze (tečna) - mešavima vode,
organskih rastvarača i pufera koja se
nalazi u rezervoarima (staklene boce u
zapremini od 250 - 2000 mL)
Vrste HPLC u zavisnosti od čvrste faze su:

• tečno-čvrsta (adsorpciona),

• tečno-tečna (podeona),

• jono izmenjivačka i

• ekskluzivna ( gel-filtracija).

Drugim rečima, tip HPLC je određen tipom

kolone, odnosno črvstim puniocem kolone.
 Tečno-čvrsta hromatografija
Adsorpciona

Zavisi od interakcije analizirane

supstance sa površinskim slojem
adsorbensa.
Najčešći adsorbens je silika gel i ovaj
hromatografski proces odgovara TLC-u.
TLC može da se iskoristi kako bi
predvideli odgovarajući sastav mobilne
faze za HPLC analizu.
Površina čestice silika gela

Supstanca
koja se
razdvaja

C6H14(mobilna
faza)
Površina čestice modifikovanog
silika gela

Acetonitril/voda
(mobilna faza)
18

18
Hromatografski proces
Pakovanje kolone
 Mehanizam je zasnovan na selektivnoj raspodeli
supstanci uzorka između tečne mobilne faze i površine
čvrste stacionarne faze.
Silika –gel, opšte formule SiO2 x H2O je jedan od
najčešće upotrebljavanih adsorbenasa u hromatografiji.
Silika-gel se razlikuje po veličini :
• čestica,
• aktivne površine kao i
• međuprostora (pore).
Za adsorpcionu hromatografiju značajne su hidroksilne
grupe vezane za silicijum koji se nalazi na površini
čestica.
Stvaranje vodoničnih veza sa površinskim hidroksilnim
grupama je mehanizam adsorpcije koji se najčešće javlja
na silika-gelu.
Kako je površina čestica silika-gela polarna,
razdvajanje se zasniva na razlici u polarnosti
različitih molekula uzorka. Najpolarniji
molekuli se najjače vezuju za adsorbens.

Ovakva hromatografija se zove

hromatografija na normalnoj fazi i
podrazumeva da je stacionaran faza polarna,a
mobilna faza nepolarna.
 Tečno- tečna hromatografije
Podeona

Zavisi od raspodele analiziranih supstanci između

dva rastvarača koja se ne mešaju i od kojih je
jedan mobilan a drugi vezan na čvrsti adsprbens.

Podeona hromatografija može biti:

• Normalna (Normal fase-NF) - stacionirana faza

je polarna, a mobilna faza nepolarna i

• Reversna (Reverse fase - RF) kada je

stacinoirana nepolarna, a mobilna faza polarna.
 Tečno - tečna particiona

U ovoj hromatografiji je površinski sloj

adsorbensa zamenjen nekom tečnom
stacionarnom fazom.
Kretanje supstance, koja se razdvajaja, preko
ovakve stacinarne faze je određen njenom
ravnotežnom distribucijom između mobilne i
stacionarne tečne faze,
koje se međusobno ne mešaju.
U idealnom slučaju mehanizam odvajanja je
raspodela supstance između stacinarne i mobilne
faze i ne dolazi do njihove adsorpcije na nosaču
stacionarne faze.
 Hromatografija na vezanoj fazi

Silika-gel, najčešće primenjivan nosač stacinarne faze

je reaktivan i za njega se mogu kovalentno vezati
različite funkcionalne grupe.

Najčešći način vezivanja silanol grupa silika-gela je

derivatizacija sa hloro ili alkoksisilanima u siloksane.

Tako modifikovane čestice na površini silika-gela mogu

biti polarne ili nepolarne, što zavisi od prirode vezane
funkcionalne grupe.
 Vrste adsorbenasa u čvrsto-tečnoj
hromatografiji
Polarne grupe Nepolarne grupe

Joni-katijoni
Alternativni pristup u hromatografiji na vezanim
fazama je upotreba hidrofobnih stacioniranih
faza.

Za eluiranje se tada koristi polarna mobilna faza,

a ova hromatografska tehnika se naziva
hromatografija pomoću reversne faze i označava
se skraćenicom RP-HPLC.
Ovaj termin označava suprotnu polarnost
stacionirane faze i mobilne faze u odnosu na
adsorpcionu hromatografiju.
 Interakcija između molekula uzorka i
stacionirane faze je hidrofobne prirode, pa se
jedinjenja eluiraju sa kolone prema rastućoj
hidrofobnosti.
Eluiranje se obično vrši pomoću vodenih
rastvora alkohola ili acetonitrila. Molekuli
organskog rastvarača zamenjuju i istiskuju
molekule jedinjenja koja se razadvajaju sa
stacinirane hidrofobne faze.
Mehanizam razdvajanja u čvrsto-tečnoj
hromatografiji
Mehanizam razdvajanja u čvrsto-tečnoj
hromatografiji
Mehanizam razdvajanja u čvrsto-tečnoj
hromatografiji
 Izbor sastava mobilne faze omogućava
veoma raznovrsnu primenu jedne iste kolone.

Npr. C-18 kolona može da razdvaja mono i

oligosaharide sa vodenom mobilnom fazom.
Ista kolona može da razdvaja smešu
različitih lekova ali uz upotrebu mobilne
faze koja sadrži mešavinu vode i organskih
rastvarača, ako što su acetonitril i voda ili
metanol i voda.
 Jedinjenja jonske prirode takođe se mogu
hromatografisati na hidrofobnim stacionarnim fazama.
Primenom dve tehnike, supresijom jonizovanja ili
jonskim sparivanjem, uklanja se naelektrisanje molekula
uzorka i tako se povećava njihov afinitet prema
hidrofobnoj stacioniranoj fazi.
U prvom slučaju se pogodnim pH mobilne faze podesi
tako da se suzbija jonizovanje (1,5-2,0 pH jedinice
ispod pKa za kiseline i za odgovarajući iznos iznad pKb
za baze).Pri time treba imati u vidu da je silika-gel
stabilan u oblasti od 2.5- 7.5 pH.
Shema HPLC aparata
 Delovi aparata za HPLC

• Rezervoar za mobilnu fazu

• Uređaj za prenos (transfer) mobilne faze - pumpa
• Injektor - (autosempler)
• Kolona
• Detektor
• Rezervoar za iskorišćenu mobilnu fazu
• Pisač - Jedinica za skupljanje, analiziranje i čuvanje
podataka
 Uređaj za prenos (transfer mobilne faze)

• Napajaju sistem mobilnom fazom (mešavina organskih

rastvarača i dejonizovane vode ili pufera).

• Neophodno kontinuirano degaziranje mobilne faze,

odnosno da se uklanjaju mehurići vazduha koji mogu
značajno da ugroze proces hromatografisanja.

• Degaziranje mobilne faze moguće je izvesti i pre unošenja

u rezervoar, odnosno da se posude sa mobilnom fazom
stave u ultrazvučno kupatilo, u vakum ili da se uvodi struja
inertnog gasa kroz rastvor.
 Upotreba eluiranja sa gradijentom se
koristi:

• Kada se koponente kompleksne smeše

međusobno značajno razlikuju prema nekom
od relevantnih parametara razdajanja
(polarnost).

(a) prikaz slabog razdvajanja pikova 1,2,3 i dugog

vremena retencije pikova 4 i 5
 Uspešno razdvajanje primenom gradijenta

Primenom gradijenta u početnoj fazi, eluiranje se

vrši blažim rastvaračem i time poboljšava
razdvajanje komponenti u toj fazi, a zatim
povećanjem jačine rastvarača, u kontiunalnom smislu,
eluiraju se komponente koje su čvršće vezane za
kolonu.
 Injektor

Mesto za nanošenje uzorka u kolonu.

Iniciranje se vrsi tako sto se uzorak ubrizga u
metalnu petlju, pa se prebacivanjem ventila, uzorak
iz petlje ubacuje u struju mobilne faze, koja dalje
uzorak nosi do kolone.
 U cilju postizanja dobrog razdvajanja petlja za
uzorke mora biti potpuno napunjena.
U tom slučaju količina ubrizganog uzorka je
fiksirana, obično 10 –20 l, a može i više (50,100,
175,200).
Velike zapremine uzorka nepovoljno utiču na
efikasnost razdvajanja, naročito u slučajevima
kada rastvarač uzorka nije kopatibilan sa
mobilnom fazom. Da bi se ovo izbeglo ponovno
rastvaranje uparenog ekstrakta za HPLC obavezo
uraditi sa mobilnom fazom koja služi za eluiranje
komponenata iz tog uzorka.
 HPLC kolone
To su čelične cevi, prečnika od 2 do 6 mm i duzine 10 –
100cm. Običneo se koriste kolone sa unutrašnjim
promerom od 4.6 mm i veličinom čestica od 10-50l.
Izrađene su od nerđajućeg čelika i mogu biti
postavljene na nosače koji su fiksirani.
Efikasnost tečne hromatografije na koloni određena
je veličinom čestica stacionarne faze. Smanjenjem
čestica sa 5 na 3 m povećava se aktivna površina
stacionarne faze ( na datu dužinu kolone), a time i
efikasnost razdvajanja. Smanjenje veličine čestica
utiče na propustljivost kolone pa je neophodno
primeniti veći pritisak, smanjiti zapreminu uzorka i
odabrati osetljivi detekcioni sistem.
 Veliki broj razdvajanja se obavlja na sobnoj
temperaturi. Reproduktivni rezultati se dobijaju
samo onda kada je temeratura kolone konstantna.

Kada je rastvorljivost uzorka mala može se

primeniti termostatiranje kolone posebnim
uređajem, a može se termostatirati i kolona
ukoliko se radi sa rastvaračima čiji je viskozitet
veći od uobičajenog.

Time se onemogućava taloženje uzorka u injektoru

i omogućava bolja prohodnost mobilne faze kroz
kolonu i tako produžava život kolone i celog
sistema.
 Detektori

Postoji više tipova detektora od kojih su u

najčešćoj upotrebi:

• UV,

•fluorescentni,

•elektrohemijski detektori
 UV detektori

To su spektrofotometri koji obuhvataju oblast

od 200-400 nm(UV) ili
od 400-700 nm tj. oblast vidljivog spektra

Princip rada se zasniva na sposobnosti

hemijskih jedinjenja da absorpbuju zračenja u
UV ili vidljivoj oblasti spektra.
 Postignuta apsorpcija je direktno
proporcionalna koncentraciji uzorka.

Kvantitativna analiza se se zasniva na principu

Lamber-Beer-ovog zakona.
Za reproduktive rezultate potrebno je
obezbediti identične hromatografske uslove
pri radu standarda i uzoraka.

Izvor zračenja

•UV oblast je deuterijumova lampa

•Vidljivi deo spektra je volframova lampa.
Talasne dužine zračenja se mogu odabrati
interferentnim filtrima ili
monohromatorima.
Primena monohromatora (difrakciona
rešetka) omogućava veću fleksibilnost u
pogledu talasne dužine.

Oblik i veličina protočne kivete određuje

efikasnost detekcije.
Obično se prinenjuju kivete sa unutrašnjim
prečnikom od 5mm i zapremine 5-10 l.
 Fluorescentni detektor

Zasniva na osobini nekih organskih molekula

da posle apsorpcije UV ili vidljivog zračenja
emituju zračenje većih talasnih dužina
(fluoresciraju).

Primenom fluorescencije selektivnost i

osetljivost se znatno povećava u odnosu na
apsopciju tako da je moguće analizirati veoma
male količine komponenti u uzorku.